專利名稱：液體抗菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及液體抗菌組合物，用于制備這些組合物的方法，這些組合物作為防腐劑的用途以及使用這些組合物來保存食物的方法。
背景技術(shù)：
改善食物保存方法的需求是迫切的。估計世界食物來源的大部分由于微生物腐敗而被損耗，而且食物型微生物感染不斷地對人體健康造成嚴重威脅。
可能損害食品和谷物并在其中生長的若干種細菌物種是病原性的，或者會產(chǎn)生毒素從而造成一系列食物中毒疾病。盡管技術(shù)和衛(wèi)生大幅改善，但是食物產(chǎn)品在食物加工環(huán)境中仍可能暴露于腐敗和病原菌，從而食物中毒的數(shù)量在多數(shù)國家仍在不斷增加。食物保存技術(shù)(例如熱加工、冷凍、超聲、照射和高壓處理)顯著減少了微生物量，但要特別關(guān)注被加工的食物在加工之后和包裝之前被微生物污染的跡象。在食品工業(yè)中，對于與各種食品諸如乳制品和肉制品、新鮮和冷凍的食品和海產(chǎn)品相關(guān)的微生物問題的關(guān)注不斷增加。
尤其，公知pH在4. 5至7. O范圍內(nèi)的食品易于受到微生物(包括病原體和孢子形成菌)而發(fā)生微生物腐敗。在較低的PH水平下，酵母、霉菌和耐酸菌是最相關(guān)的。在大多數(shù)情況下，加工食品在加工之后不會被直接消費，從而允許細菌在生產(chǎn)工藝之后存活或者由于后期污染而被引入生長。因為食品消費可能在未將加工食品預加熱至足夠高的溫度足夠長的時間的情況下進行，所以存在食物中毒或食物腐敗的風險。
此外，近來具有生鮮食品的固有營養(yǎng)和感知品質(zhì)的最小程度加工食品的趨勢提升了安全風險。較溫和的保存處理(諸如高靜壓和脈沖電場技術(shù))已被證明是成功的，但是通常依賴于有效障礙(hurdle)，即冷鏈和天然抗菌藥的添加。
在食品安全領(lǐng)域中已經(jīng)進行了深入的研究來開發(fā)有效的抗菌產(chǎn)品設(shè)計，以產(chǎn)生組合物、加工和保存條件的組合。
乳鏈球菌素(Nisin)是由Lactococcus lactis subsp. Lactis 生產(chǎn)的一種妝類抗菌物質(zhì)。其 包含34種氨基酸并且主要對革蘭氏陽性菌具有活性。乳鏈球菌素是無毒的并且沒有副作用。乳鏈球菌素是通常被認為安全的物質(zhì)，并且被廣泛用在各種食品中。這些產(chǎn)品的實例是加工奶酪、乳、凍奶油、奶類甜品、冰淇淋混合物、液體蛋、熱烤的面粉制品、調(diào)料和啤酒。乳鏈球菌素是熱穩(wěn)定的并且在巴氏溫度下存活而僅有最小的活性損耗。
通常,乳鏈球菌素通過Lactococcus Iactis物種的發(fā)酵來獲得,并且被進一步配制成干粉，該干粉原樣或者在首先被溶解在適當溶劑中之后可被用作防腐劑。Delvoplus 和Nisaplin 是乳鏈球菌素粉末的品牌，其每克含有I百萬IU。它們分別由DSM和Danisco 經(jīng)銷。這些粉末狀的乳鏈球菌素產(chǎn)品具有若干缺陷在加工時產(chǎn)生粉塵并且難以將少量粉末加入、混合到產(chǎn)品中。因此，不具有上述缺陷的液體乳鏈球菌素組合物在商業(yè)上是優(yōu)選的。
含有乳鏈球菌素的液體抗菌組合物是本領(lǐng)域已知的。盡管已經(jīng)報道了含有乳鏈球菌素的液體抗菌組合物對革蘭氏陽性菌具有活性(參見Mota-Meira等人(2000)，Montville等人(1999), US 5，584，199和US 4，597，972)，甚至對革蘭氏陰性菌也具有活性 (參見EP 0453860、US 5，260，271和US 5，559，096)，但是仍需要具有改善抗菌活性、特別對食品工業(yè)中的革蘭氏陽性菌具有改善抗菌活性的含乳鏈球菌素的液體抗菌組合物。發(fā)明內(nèi)容
令人驚訝地，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了含有乳鏈球菌素和酒花酸(hops acid)的抗菌組合物對革蘭氏陽性菌具有非常高的活性。由于它們的高抗菌活性，所以僅需要少量的這種組合物用于對細菌例如革蘭氏陽性菌的有效作用。這種組合物具有良好的抗菌穩(wěn)定性，該性質(zhì)與所述組合物的良好物理、化學穩(wěn)定性組合使得該組合物適于長期儲存，因此使得它們具有長保存期。此外，本發(fā)明的組合物可以具有低濁度，這使得它們適于用在添加低濁度添加劑較為重要的食品應用中。考慮到上述特性，本發(fā)明的組合物可以有利地用作食物防腐劑。
發(fā)明詳述
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種含有酒花酸、酒花酸衍生物或其混合物的液體乳鏈球菌素組合物，優(yōu)選含有酒花酸、酒花酸衍生物或其混合物的含水液體乳鏈球菌素組合物的制備方法。所述方法包括如下步驟a)制備pH為約1. 5至約12、優(yōu)選約3至約12、 優(yōu)選約3. 5至約12、優(yōu)選約3. 5至約9. 5、更優(yōu)選約4至約9、還要更優(yōu)選約4. 5至約8. 5、 甚至更優(yōu)選約5至約8、最優(yōu)選約5. 5至約7. 5、具體約5. 5至低于7的含有乳鏈球菌素的第一液體組合物，b)將固體化合物從制備好的含有乳鏈球菌素的第一液體組合物中分離出來，c)使分離出的固體化合物與pH為約O至約5、優(yōu)選約O. 5至約4. 5、優(yōu)選約I至約4、優(yōu)選約I至約3. 5、優(yōu)選約1. 5至約3. 5、優(yōu)選約I至約3、更優(yōu)選約1. 5至約3、具體約2至約 3的溶液接觸，從而制成第二液體乳鏈球菌素組合物，以及d)從所述第二液體乳鏈球菌素組合物中除去固體合物，其特征在于，所述方法還包括添加至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物的步驟。步驟d)是可選的，但在優(yōu)選的實施方式中，其在本發(fā)明的方法中進行。酒花酸、酒花酸衍生物或其組合的添加可以在本發(fā)明方法的至少一個步 驟之前、期間或之后進行。在優(yōu)選的實施方式中，該添加可以在步驟b之后進行，例如酒花酸、酒花酸衍生物或其組合可以添加到第二液體乳鏈球菌素組合物中。酒花酸、酒花酸衍生物或其組合可以以液體或固體形式添加。
本文中使用的術(shù)語“酒花酸”是指，酒花的苦酸組分，包括酒花β酸(蛇麻酮 Iupulone)、酒花α酸(_草酮humulone)和它們的鹽。該術(shù)語還涵蓋了酒花酸提取物(例如美國專利5286506(通過引用插入)中描述的那些)。人們相信，存在許多α和β酒花酸的類似物，包括類_草酮(cohumulone)、_草酮(humulone)、聚蛇麻酮(adhumulone)、類蛇麻酮(colupulone)、蛇麻酮(Iupulone)和伴_草酮(adlupulone)。這些都包含在本文所用術(shù)語“酒花酸”之內(nèi)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，酒花酸是β酒花酸，例如經(jīng)純化的 β酒花酸。酒花酸可以通過從天然酒花中提取并純化來制備或者可以通過化學合成來制備。例如，酒花提取物的生產(chǎn)商通過各種色譜技術(shù)以商業(yè)方式分離α和β酒花酸，而且已經(jīng)開發(fā)了一種在超臨界條件下利用液體二氧化碳分離這兩種酸級分的技術(shù)。這個操作的副產(chǎn)物是含有β酒花酸和酒花樹脂的產(chǎn)品。酒花樹脂也被本文使用的術(shù)語“酒花酸”涵蓋。 本文使用的術(shù)語“酒花酸衍生物”是指，通過天然生物合成工藝或者通過人工合成工藝從α 酒花酸、β酒花酸或酒花樹脂以化學方式衍生得到的化合物。實例包括但不限于六氫類蛇麻酮和四氫異潷草酮(參見例如美國專利US 5，455，038 (通過引用插入))。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明的方法包括將第二液體乳鏈球菌素組合物的pH 調(diào)節(jié)至所希望的PH值諸如介于1. 5和6之間的pH的步驟，所述pH例如為介于2和3之間的pH或介于5和6之間的pH。
可選地，可以在本發(fā)明方法的至少一個步驟之前、期間或之后添加下述額外的功能化合物中的至少一種。例如，可以在步驟c期間添加防凍劑，例如丙三醇，使得第二液體乳鏈球菌素組合物包含35%至60% w/w防凍劑。在其他實例中，可以在步驟b之前添加會降低或消除氣泡的化合物和/或額外的抗菌化合物，例如有機酸或其鹽。然而，在優(yōu)選的實施方式中，至少一種額外的功能化合物在步驟d之后且在pH調(diào)節(jié)步驟之前添加，或者在pH 調(diào)節(jié)步驟期間或之后添加。
在一個實施方式中，步驟a包括，將乳鏈球菌素與含水溶液混合，從而制成最終無機鹽(例如NaCl)濃度為1. 5M或更低、優(yōu)選O. 05M至1. 5M、更優(yōu)選O.1M至1. 5M的含有乳鏈球菌素的第一液體組合物。所述含有乳鏈球菌素的第一液體組合物具有約1. 5至約12、 優(yōu)選約3至約12、優(yōu)選約3. 5至約12、優(yōu)選約3. 5至約9. 5、更優(yōu)選約4至約9、還要更優(yōu)選約4. 5至約8. 5、甚至更優(yōu)選約5至約8、最優(yōu)選約5. 5至約7. 5、具體約5. 5至低于7的 pH。任何乳鏈球菌素源都可以懸浮在和/或溶解在含水溶液中。乳鏈球菌素可以是粉末形式或者可以是液體發(fā)酵制劑(fermentate preparation)。在優(yōu)選的實施方式中，乳鏈球菌素是粉末，優(yōu)選是干粉。例如，可以使用可商購乳鏈球菌素粉末組合物，諸如Delvoplus 和Nisaplin 。這種乳鏈球菌素來源可以包括所有已知的乳鏈球菌素變體，包括但不限于乳鏈球菌素A、乳鏈球菌素Z或其組合。含水溶液可以是緩沖溶液，例如磷酸鹽緩沖液，如 NaH2P04/Na2HP04。當然，也可以使用其他適當?shù)木彌_液。這些緩沖液包括但不限于，乙酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、甘氨酸/HCl緩沖液及其任意組合。
固體化合物可以通過公知的離析技術(shù)從含有乳鏈球菌素的第一液體組合物中分離/離析出來。在優(yōu)選的實施方式中，步驟b通過離心、過濾或其任意組合的方式進行。
隨后，第二液體乳鏈球菌素組合物可以通過如下制備使經(jīng)離析的固體組合物例如與如下溶液(優(yōu)選含水溶液)接觸，例如溶解或混合或懸浮在如下溶液(優(yōu)選含水溶液) 中，所述溶液(優(yōu)選含水溶液)具有約O至約5、優(yōu)選約O. 5至約4. 5、優(yōu)選約I至約4、優(yōu)選約I至約3. 5、優(yōu)選約1. 5至約3. 5、優(yōu)選約I至約3、更優(yōu)選約1. 5至約3、具體約2至約3 的pH。在一個實施方式中，這個步驟的過程中添加下述額外的功能化合物。在一個實施方式中，酒花酸、酒花酸衍生物或其組合在這個步驟的過程中添加。例如，經(jīng)離析的固體化合物可以溶解在具有約O至約5的pH并且包含酒花酸、酒花酸衍生物或其組合的溶液中?；蛘撸?jīng)離析的固體化合物可以溶解在PH為約O至約5的溶液中，然后將酒花酸、酒花酸衍生物或其組合添加到所得到的乳鏈球菌素組合物中。在溶解各個化合物之后，PH應當仍在約 O至約5、優(yōu)選約O. 5至約4. 5、優(yōu)選約I至約4、優(yōu)選約I至約3. 5、優(yōu)選約1. 5至約3. 5、優(yōu)選約I至約3、更優(yōu)選約1. 5至約3、具體約2至約3的范圍內(nèi)。如果不是這樣的話，那么應當將PH再次調(diào)節(jié)至各個pH范圍。
接下來，第二液體乳鏈球菌素組合物可以通過去除例如剩余的碎片和/或非-乳鏈球菌素蛋白質(zhì)或其部分進行純化。這個純化步驟可以通過公知的離析技術(shù)進行。在優(yōu)選的實施方式中，步驟d通過離心、過濾或其任意組合的方式進行。在一個實施方式中， 酒花酸、酒花酸衍生物或其組合在這個純化步驟之前、期間、優(yōu)選之后添加。
可選地，本發(fā)明的液體乳鏈球菌素組合物在最終用在食品中之前，可以進行巴氏消毒或過濾滅菌。這可以例如在步驟c或d之后進行。優(yōu)選地，巴氏消毒或滅菌在低pH(例如小于3的pH)下進行，以防乳鏈球菌素熱變性。預先巴氏消毒的液體配制品與使用粉末狀的乳鏈球菌素相比具有顯著的優(yōu)點。粉末狀的乳鏈球菌素通常必須由最終用戶進行再水化、標準化和巴氏消毒，然后它才可被添加到預加工的食品中。由于存在細菌污染的風險， 所以未滅菌的粉末不能直接添加到未經(jīng)歷任何額外的加工以消除細菌污染的食品中。經(jīng)巴氏消毒或過濾滅菌的液體乳鏈球菌素組合物本質(zhì)上是無菌的，所以它可以被直接添加到預加工(即預烹調(diào)的)食品(例如即食肉類、奶酪或醬汁)中，而無需任何進一步的烹調(diào)步驟。 這不僅方便了食品加工，還是確保較大抗菌效力的方式。一些工廠當再水化乳鏈球菌素時不具有有效控制pH的能力。當這些工廠在較高的pH水平(尤其>5)下對這種再水化的乳鏈球菌素進行熱巴氏消毒時，由于乳鏈球菌素的熱變性而導致抗菌活性顯著損耗。本發(fā)明的液體乳鏈球菌素組合物避免了這個問題，并且減少了不適當?shù)脑偎蜆藴驶娘L險。
上述方法導致液體乳鏈球菌素組合物與現(xiàn)有技術(shù)描述的液體乳鏈球菌素組合物相比對微生物、特別是革蘭氏陽性菌具有遠遠更高的活性。換句話說，本發(fā)明的方法導致液體乳鏈球菌素組合物與現(xiàn)有技術(shù)描述的液體乳鏈球菌素組合物相比對微生物、特別是革蘭氏陽性菌具有遠遠更低的最小抑菌濃度(MIC)。此外，酒花酸、酒花酸衍生物或其組合的存在進一步增加了高活性液體乳鏈球菌素組合物的抗菌活性，因為乳鏈球菌素與酒花酸、酒花酸衍生物或其組合進行組合對微生物、特別是革蘭氏陽性菌表現(xiàn)協(xié)同效應。
因此，可通過本發(fā)明的方法獲得的乳鏈球菌素組合物是本發(fā)明的另一部分。乳鏈球菌素組合物可以是固體，但優(yōu)選地其是液體組合物。
在一個實施方式中，本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物對至少一種革蘭氏陽性菌具有 l.Oyg/ml或更低的MIC。MIC是指，為了抑制待測微生物的生長所必需的化合物或組合物的最低濃度。優(yōu)選地，MIC是至少三個獨立重復實驗的平均值。本發(fā)明的組合物當在本文所述的試驗中測試對于至少一種革蘭氏陽性菌的生長抑制性時具有1. Ομ g/ml或更低的MIC。在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物對至少一種革蘭氏陽性菌具有O. 5 μ g/ml或更低的MIC、優(yōu)選O.1 μ g/ml或更低的MIC、更優(yōu)選O. 05 μ g/ml或更低的MIC、甚至更優(yōu)選 O. 01 μ g/ml或更低的MIC、還要甚至更優(yōu)選O. 005 μ g/ml或更低的MIC、具體O. 001 μ g/ ml或更低的MIC、更具體O. 0005 μ g/ml或更低的MIC，最具體地對至少一種革蘭氏陽性菌具有O. 0001 μ g/ml或更低的MIC。革蘭氏陽性菌包括但不限于，Micrococcus sp.、 Listeria sp.，、Bacillus sp.、Staphylococcus sp.、Clostridium sp.、Streptococcus sp.、Lactobacillus sp.和Lactococcus sp.。在一個實施方式中，革蘭氏陽性菌選自由 Baci I Ius λ Lactococcus λ Staphy lococcus λ Li steria 和 Micrococcus 組成的組。Bacillus、 Lactococcus、Staphylococcus、Listeria 和 Micrococcus 各屬中的適當物種別包括但不限于，B. subtilis、L lactis、S. aureus、L innocua 和 M.1uteus0 在列出的各物種中， 適當?shù)木攴謩e包括但不限于，Bacillus subtilis ATCC 31578、Lactococcus lactis ATCC 19257、Staphylocoocus aureus ATCC 27661、Listeria innocua LMD 92.20 和 Micrococcus lu teus B212。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物對至少一個M.1uteus 菌株、優(yōu)選M. luteus B212具有O. 5 μ g/ml或更低的MIC、優(yōu)選O.1 μ g/ml或更低的MIC、更優(yōu)選O. 05 μ g/ml或更低的MIC、甚至更優(yōu)選O. 01 μ g/ml或更低的MIC、還要甚至更優(yōu)選 O. 005 μ g/ml或更低的MIC、具體O. 001 μ g/ml或更低的MIC、更具體O. 0005 μ g/ml或更低的 MIC。
乳鏈球菌素活性可以利用如下本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的生物試驗測量(參見 Pongtharangkul and Demirci, 2004),該生物試驗包括在低pH下預處理乳鏈球菌素組合物。簡言之，利用新生長的培養(yǎng)物制備含M. luteus B212的瓊脂盤(Iso_sensitest瓊脂)。 干燥后，用真空泵在瓊脂中形成小孔。將樣品及其稀釋液(10μ I)轉(zhuǎn)移到各孔中，并允許在 5°C下擴散到瓊脂中18小時。隨后，將瓊脂盤在30°C下培養(yǎng)24小時，并且測量含有樣品的各孔周圍的抑制區(qū)。與各樣品平行，具有已知量(0-1600IU/ml)的乳鏈球菌素的對照樣被引入。使用它們的抑制區(qū)來準備為了測定各樣品的乳鏈球菌素水平所必需的校準曲線。所有步驟都是無菌的。乳鏈球菌素的IU已被定義為如下。世界衛(wèi)生組織委員會在1970年的 Biological Standardization, Twenty second report. World Health Organization Technical Report Series, No. 444中已經(jīng)確定了乳鏈球菌素的國際參比制劑，國際單位 (此后稱為“IU”)被定義為0. OOlmg的這種制劑。Delvoplus 和Nisaplin (乳鏈球菌素粉末產(chǎn)品的品牌，每克含有I百萬IU)分別由DSM和Danisco經(jīng)銷。通過上述試驗，可以測定樣品中的乳鏈球菌素濃度。
乳鏈球菌素組合物的MIC可以通過如下MIC試驗測定。乳鏈球菌素活性利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準微量培養(yǎng)基稀釋試驗(standard microdilution broth assay)測定。簡言之，利用新生長的培養(yǎng)物制備含有Micrococcus luteus B212的Iso-sensitest 培養(yǎng)基。每ml的細胞數(shù)利用計數(shù)室測定。優(yōu)選地，使用IO3的細胞技術(shù)。將100 μ I的接種物(inoculum)添加到96孔微滴定盤的各孔中。將100 μ I的乳鏈球菌素組合物添加到第一孔(Al)中并用移液管上下移液3次適當混合。順序稀釋通過如下進行通過將100 μ I 的第一孔溶液轉(zhuǎn)移到下一孔(Α2)中并適當稀釋。重復這個過程，直到各組分在36個孔中進行了順序稀釋。然后，將該盤在30°C下培養(yǎng)7天，并且每天對細菌生長進行讀數(shù)。MIC濃度是完全抑制 生長的最低濃度。在優(yōu)選的實施方式中，MIC在抗菌組合物生產(chǎn)之后直接測定。
在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物具有約O至約5、優(yōu)選約0. 5至約4. 5、優(yōu)選約 I至約4、優(yōu)選約1. 5至約3. 5、優(yōu)選約I至約3、更優(yōu)選約1. 5至約3、具體約2至約3的pH。 在這樣的PH條件下，本發(fā)明組合物的微生物穩(wěn)定性是良好的，并且組合物的MIC在儲存條件下較低并且穩(wěn)定。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明的組合物包含0. 01至5%、優(yōu)選0. 05至2. 5%、更優(yōu)選0.1至1.0%、最優(yōu)選0. 15至0.5%、具體0.2至0.3% (w/w)的乳鏈球菌素。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明的組合物包含0. 0000001至25%、優(yōu)選0. 000001 M 15%,優(yōu)選 0. 000001 至 10 %、優(yōu)選 0. 00001 至 5 %、更優(yōu)選 0. 0005 至 I %、最優(yōu)選 0.0002 至0.9%、具體0.001至0.5% (w/w)的酒花酸、酒花酸衍生物或其組合。
本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物可以包含少量的鹽，諸如無機鹽，例如NaCl。要理解到，下文所述的額外的功能化合物(例如抗菌化合物，諸如有機酸或其鹽)并未被包含在 “鹽”的定義內(nèi)。在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物包含鹽，例如無機鹽，其與乳鏈球菌素的比率為100 :1至1: 100，優(yōu)選50 :1至1: 100，更優(yōu)選25 :1至1: 100，具體為10 :1至1: 100。在一個實施方式中，本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物基本上不含鹽，優(yōu)選不含無機鹽如NaCl。該無機鹽可以是任何食品級無機鹽。無機鹽的實例是NaCl、Na2S04、 (Ca) 3(PO4)2、KNO3、KCl和MgC03。這些鹽在組合物中的濃度為100mg/ml或更低、優(yōu)選50mg/ ml或更低、更優(yōu)選25mg/ml或更低、具體為15mg/ml或更低。鹽濃度可以通過單獨的陽離子分析、通過原子吸收陰離子分析、通過HPLC或優(yōu)選通過燃燒測定灰分含量(550+/-25°C ) 來測定。具有低濃度無機鹽的乳鏈球菌素組合物是非常吸引人的，因為它們不會妨礙食品基質(zhì)，從而不會帶來不希望的味道和/或結(jié)構(gòu)的反應和變化。
本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物可以包含少量不同于乳鏈球菌素、酒花酸和鹽的組分。這些組分可以是蛋白質(zhì)或其部分。要理解到，下文所述的額外的功能化合物(例如抗菌化合物、消泡劑、表面活性劑等等)并未被包含在“不同于乳鏈球菌素、酒花酸和鹽的組分” 的定義內(nèi)。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中的非乳鏈球菌素組分和乳鏈球菌素的比率為100 :1至1: 100，優(yōu)選10 :1至1: 100，更優(yōu)選2 :1至1: 100。在一個實施方式中，本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物基本上不含這些組分。這些組分可以源自利用Lactococcus lactis的乳鏈球菌素發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物質(zhì)?？梢允紫韧ㄟ^上述試驗測量乳鏈球菌素的濃度。隨后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)典試驗估計總蛋白質(zhì)濃度。非乳鏈球菌素蛋白質(zhì)濃度可以通過如下估計從總蛋白質(zhì)濃度中減掉乳鏈球菌素濃度。
在另一實施方式中，本發(fā)明的組合物是澄清的液體組合物。澄清的液體乳鏈球菌素組合物可以用在任意類型的產(chǎn)品上和/或產(chǎn)品中?？紤]到它們的透明度，它們可以有利地用在透明度對其很重要的產(chǎn)品中，諸如果凍基產(chǎn)品，例如果凍甜點、果汁、飲料和食品的表面應用。本文中使用的“澄清的液體組合物”是濁度為O至IOOFNU、優(yōu)選O至50FNU、更優(yōu)選O至25FNU、具體O至10FNU的液體組合物?！皽啙岬囊后w組合物”是濁度高于100FNU的液體組合物。以FNU(Formazine Nephelometric Unit)計的池度可以采用光散射法測定,并且可以利用N印hla濁度光度計采用測量方法DIN EN 27027/IS0 7027測量。澄清的和渾濁的乳鏈球菌素組合物都可以通過本發(fā)明的方法制備。在本發(fā)明方法的步驟a)中準備了 PH為約5或更高、優(yōu)選pH為約5至約9的含有乳鏈球菌素的液體組合物的情況下，會制成澄清的液體組合物。在本發(fā)明方法的步驟a)中準備了 pH低于約5、優(yōu)選pH為約1. 5至低于約5、 或者pH高于9、優(yōu)選pH高于9至約12的含有乳鏈球菌素的液體組合物的情況下， 會制成渾濁的液體組合物。澄清的和渾濁的液體乳鏈球菌素組合物對微生物、具體革蘭氏陽性菌都具有上述高活性。
含有乳鏈球菌素的第一液體組合物(即在本發(fā)明方法的步驟a中制備的液體乳鏈球菌素組合物，如上)的最終無機鹽(例如NaCl)濃度大于1. 5M的方法與含有乳鏈球菌素的第一液體組合物的最終無機鹽濃度小于等于1. 5M的方法相比具有若干缺陷。首先，最終無機鹽濃度大于1. 5M的第一液體乳鏈球菌素組合物與最終無機鹽濃度小于等于1. 5M的液體乳鏈球菌素組合物相比在離心時顯示降低的分離性能(即具有降低的沉降速率)。第二， 通過進行本發(fā)明的方法(即步驟a至c以及可選的步驟d和pH調(diào)節(jié)步驟，如上)制備的其中含有乳鏈球菌素的第一液體組合物具有大于1. 5M的最終無機鹽濃度的所得最終液體乳鏈球菌素組合物具有若干缺陷
·它是渾濁的；
·它的純度低于通過進行本發(fā)明的方法制備的其中含有乳鏈球菌素的第一液體組合物具有小于等于1. 5M的最終無機鹽濃度的最終液體乳鏈球菌素組合物；
·它的抗菌活性低于通過進行本發(fā)明的方法制備的其中含有乳鏈球菌素的第一液體組合物具有小于等于1. 5M的最終無機鹽濃度的最終液體乳鏈球菌素組合物；和
·它的沉淀風險高于通過進行本發(fā)明的方法制備的其中含有乳鏈球菌素的第一液體組合物具有小于等于1. 5M的最終無機鹽濃度的最終液體乳鏈球菌素組合物。
本發(fā)明的液體乳鏈球菌素組合物與現(xiàn)有技術(shù)已知的液體乳鏈球菌素制劑相比具有至少一個下列優(yōu)點
·本發(fā)明的組合物與現(xiàn)有技術(shù)的液體乳鏈球菌素組合物相比具有更好的抗菌效力；和/或
·本發(fā)明的組合物基本上不含鹽，諸如無機鹽，如NaCl，并且基本上不含其它非-乳鏈球菌素組分。因此，在食品應用中，本發(fā)明組合物的使用不會妨礙食物基質(zhì)，從而不會帶來不希望的味道和/或結(jié)構(gòu)的反應和變化；和/或
·本發(fā)明的組合物可以是澄清的，即具有低濁度(介于O和100FNU之間)。這樣的組合物不會妨礙其要應用的產(chǎn)品的顏色和/或透明度。
根據(jù)另一實施方式，本發(fā)明的組合物還包含至少一種額外的功能化合物，這種化合物包括但不限于，額外的抗菌化合物，諸如酸，例如山梨酸、丙酸、苯甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、肉桂酸或這些酸中任意一種的鹽，葡萄糖氧化酶，游霉素，溶菌酶，多-L-賴氨酸，制霉菌素，魯斯霉素，兩性霉素B，菲律平(filipin)，片球霉素，脂肪酸或其酯(尤其是己酸或辛酸和它們的酯(如癸酸單甘油酯)或月桂酸及其酯(如月桂酸單甘油酯或月桂精氨酸酯))；表面活性劑，例如SDS、吐溫、脂肪酸；pH調(diào)節(jié)劑，諸如HCl或NaOH或緩沖劑，例如磷酸鹽或乙酸鹽；防凍劑，諸如丙三醇或丙二醇；增稠劑，例如黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、 黃蓍膠、結(jié)冷膠(gellan gum)、刺槐豆膠、卡拉膠、rhamxan膠、藻酸鹽、淀粉、羧甲基纖維素 、 羧乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙二醇。在低于PH 7的條件下，酒花酸、特別是β酒花酸變得越來越不穩(wěn)定(由于它們的高 PKa)。這意味著，具有低于約5的pH的組合物在加工和儲存期間需要一些手段來保持酒花酸免于沉淀。一旦酒花酸在低PH環(huán)境中沉淀了，那么它們會形成即使升高pH也非常難以再水化的大晶體。因而，酒花酸如果被運送到低PH溶液中則可能損失它們的抗菌活性。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物包含增稠劑。增稠劑的存在具有使酒花酸懸浮在組合物中的效果，以及防止形成不溶解的結(jié)晶沉淀物的效果。在將本發(fā)明的組合物添加到食物組合物(通常具有大于5. OpH的食物)時，懸浮的酒花酸然后會快速再溶解，并且與乳鏈球菌素一起表現(xiàn)抗菌協(xié)同效應。此外，本發(fā)明的組合物可以包含減少或消除起泡的試劑。 這種額外的化合物可以以固體或液體形式添加到本發(fā)明的組合物中，并且可以在使用前事先充分混合或直接使用。在本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物中使用至少一種額外的抗菌化合物 /防腐劑以期在微生物學方面進一步穩(wěn)定該組合物，因而可以有益于該組合物的保存期。
存在于含水液體組合物中的乳鏈球菌素的活性可以通過去除雜質(zhì)得以大幅增加。 此外，乳鏈球菌素在含水組合物的溶解速率可以通過雜質(zhì)(諸如無機鹽)的去除得以增加。 乳鏈球菌素可以部分結(jié)合到雜質(zhì)上，從而得到防腐活性不可利用的乳鏈球菌素。換句話說， 乳鏈球菌素在雜質(zhì)的存在下具有有限的生物利用率。本文中使用的術(shù)語“生物利用率”是指，乳鏈球菌素在液體、半固體或固體制劑中的利用率、量(例如濃度)或活性。雜質(zhì)諸如非乳鏈球菌素蛋白質(zhì)或其他非乳鏈球菌素組分、細胞壁碎片和鹽對乳鏈球菌素的溶解速率具有不利影響。發(fā)現(xiàn)存在于這種液體制劑中的少于大約50 %的乳鏈球菌素在這些雜質(zhì)存在的情況下可作為防腐劑。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)存在于商購乳鏈球菌素產(chǎn)品中。商購乳鏈球菌素通常包含5-25 %的非乳鏈球菌素蛋白質(zhì)和細胞碎片。這些雜質(zhì)源于乳鏈球菌素的生產(chǎn)過程。在發(fā)酵之后的回收、純化或再生中通常使用的鹽仍存在于最終的乳鏈球菌素制劑中。
另一方面，本發(fā)明涉及含有增稠劑的乳鏈球菌素的含水懸浮液。該組合物還應當包含至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物。當然，也可以使用兩種或更多種不同的增稠劑。此外，該懸浮液還可以包含酒花酸和/或酒花酸衍生物的任意組合。術(shù)語酒花酸和酒花酸衍生物具有以上定義的含義。本發(fā)明的懸浮液包含O. 01至5%、優(yōu)選O. 05至 2.5%、更優(yōu)選O.1至1.0%、最優(yōu)選O. 15至O. 5%、具體O. 2至O. 3% (w/w)的乳鏈球菌素。 本發(fā)明的懸浮液包含O. 0000001至25%、優(yōu)選O. 000001至15%、優(yōu)選O. 000001至10%、優(yōu)選 O. 00001 至 5%、更優(yōu)選 O. 0005 至 1%、最優(yōu)選 O. 0002 至 O. 9%、具體 O. 001 至 O. 5% (w/ w)的酒花酸、酒花酸衍生物或其組合。本發(fā)明的懸浮液包含O. 01至5%、優(yōu)選O. 05至5%、 優(yōu)選O.1至5 %、更優(yōu)選O. 2至5 %、甚至更有選O. 3至5 %、最優(yōu)選O. 4至5 %、具體O. 5至 5% (w/w)的增稠劑。所述增稠劑選自黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、黃蓍膠、結(jié)冷膠(gellan gum)、刺槐豆膠、卡拉膠、rhamxan膠、藻酸鹽、淀粉、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、輕丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚丙二醇組成的組。在優(yōu)選的實施方式中，增稠劑是樹膠(gum)，諸如黃原膠。根據(jù)本發(fā)明的懸浮液的pH為約2至約12， 優(yōu)選約2至約11，更優(yōu)選約2至約10，甚至更優(yōu)選約2至約9，還要更優(yōu)選約2至約8，最優(yōu)選約2至約7，具體約2至約6。本發(fā)明的懸浮液是穩(wěn)定的。本文中使用的“穩(wěn)定懸浮液” 是指物理上穩(wěn)定的懸浮液，即在室溫PH5下儲存9天之后具有50%或更小、優(yōu)選40%或更少、更優(yōu)選30 %或更少、甚至更優(yōu)選20 %或更少、最優(yōu)選10 %或更少、具體O %的沉降。懸浮液的物理穩(wěn)定性可以通過本領(lǐng)域已知的方法，例如本文所示的沉降試驗(參見實施例5) 測量?！?br> 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的懸浮液還包含至少一種額外的功能化合物，所述功能化合物選自由額外的抗菌化合物、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑和防凍劑組成的組。適當?shù)念~外抗菌化合物的實例是酸，例如山梨酸、丙酸、苯甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、肉桂酸或這些酸中任意一種的鹽，葡萄糖氧化酶，游霉素，溶菌酶，多-L-賴氨酸，制霉菌素，魯斯霉素，兩性霉素B，菲律平(filipin)，片球霉素，脂肪酸或其酯，尤其是己酸或辛酸和它們的酯(如癸酸單甘油酯)或月桂酸及其酯(如月桂酸單甘油酯或月桂精氨酸酯)。適當表面活性劑的實例是SDS、吐溫、脂肪酸，這僅僅舉例一小部分。適當pH調(diào)節(jié)劑的實例是HCl或NaOH或緩沖劑，例如磷酸鹽或乙酸鹽。適當防凍劑的實例是丙三醇或丙二醇。本發(fā)明的懸浮液可以包含減少或消除起泡的試劑。這種額外的化合物可以以固體或液體形式添加到本發(fā)明的組合物中，并且可以在使用前事先充分混合或直接使用。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的懸浮液的方法，所述方法包括如下步驟a)將乳鏈球菌素、增稠劑和至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物單獨地或以粉末組合物形式添加到含水溶液(例如水)中，并且b)混合從而得到懸浮液。如果需要，該懸浮液的PH可以被調(diào)節(jié)至約2至約12，優(yōu)選約2至約11，更有選約2至約10，甚至更優(yōu)選約2至約9，還要甚至更優(yōu)選約2至約8，最優(yōu)選約2至約7，具體約2至約6?？蛇x地，本發(fā)明的懸浮液在最終用在食品中之前，其可以進行巴氏消毒或過濾滅菌。這可以例如在混合步驟之后直接進行。優(yōu)選地，巴氏消毒或滅菌在低PH(例如小于3的pH)下進行，以防乳鏈球菌素熱變性。預先巴氏消毒的懸浮液與使用粉末狀的乳鏈球菌素相比具有顯著的優(yōu)點。粉末狀的乳鏈球菌素通常必須由最終用戶進行再水化、標準化和巴氏消毒，然后它才可被添加到預加工的食品中。由于存在細菌污染的風險，所以未滅菌的粉末不能直接添加到未經(jīng)歷任何額外的加工以消除細菌污染的食品中。經(jīng)巴氏消毒或過濾滅菌的懸浮液本質(zhì)上是無菌的，所以它可以被直接添加到預加工(即預烹調(diào)的)食品(例如即食肉類、奶酪或醬汁)中，而無需任何進一步的烹調(diào)步驟。這不僅方便了食品加工，還是確保較大抗菌效力的方式。一些工廠當再水化乳鏈球菌素時不具有有效控制PH的能力。當這些工廠在較高的PH水平(尤其> 5)下對這種再水化的乳鏈球菌素進行熱巴氏消毒時，由于乳鏈球菌素的熱變性而導致抗菌活性顯著損耗。本發(fā)明的乳鏈球菌素懸浮液避免了這個問題，并且減少了不適當?shù)脑偎蜆藴驶娘L險。
乳鏈球菌素、酒花酸和/或酒花酸衍生物、和增稠劑可以單獨地添加到含水溶液中。它們可以是粉末形式或是液體形式(例如乳鏈球菌素可以以液體發(fā)酵制劑形式添加)。 或者，乳鏈球菌素、酒花酸和/或酒花酸衍生物、和增稠劑可以以一種粉末組合物的形式存在，這種粉末組合物可以添加到含水溶液中。因此，在進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及一種粉末組合 物，其包含乳鏈球菌素、至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物和增稠劑。乳鏈球菌素和/或酒花酸和/或酒花酸衍生物和/或增稠劑可以與上述額外的功能化合物一起添加到含水溶液中，然后混合，從而獲得懸浮液?；蛘?，額外的功能化合物可以在已經(jīng)獲得了含有乳鏈球菌素、酒花酸和酒花酸衍生物、和增稠劑的懸浮液之后添加。在進一步的實施方式中，乳鏈球菌素被首先添加到含水溶液中，此后添加增稠劑以及酒花酸和/ 或酒花酸衍生物，并且混合該溶液從而獲得懸浮液。在進一步的實施方式中，增稠劑和額外的功能化合物被先后添加到含水溶液中，此后添加乳鏈球菌素以及酒花酸和/或酒花酸衍生物，并且混合該溶液從而獲得懸浮液。在也是進一步的實施方式中，額外的功能化合物被首先添加到含水溶液中，接著添加酒花酸和/或酒花酸衍生物、增稠劑和/或乳鏈球菌素。 相關(guān)化合物的每種添加次序都是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的含水懸浮液在制備用于處理食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的處理液中的用途。所述處理液可以通過如下制備將含水溶液與本發(fā)明的懸浮液混合。 食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的處理可以通過噴射、浸潰、浸入、刷涂進行，這里僅僅列舉了一小部分。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物或懸浮液在食物、飼料或農(nóng)用產(chǎn)品之中和/或之上作為防腐劑的用途。此后，術(shù)語“懸浮液”還包括由本發(fā)明的懸浮液制備的處理液。本發(fā)明的組合物和懸浮液并不具有與粉末制品相關(guān)的那些不足它們更容易使用(容易加入)，并且在使用它們時沒有粉塵形成。此外，在將乳鏈球菌素粉末溶解在溶劑中時發(fā)生的起泡和溶解問題也得以抑制。為了保存食品的乳鏈球菌素的有效水平在I至 1500IU/g或O. 025至37. 5ppm的乳鏈球菌素的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的組合物和懸浮液可以單獨使用，也可以與其他抗菌組合物組合使用，所述其他抗菌組合物例如為含有有機酸或其鹽、溶菌酶的組合物。這些抗菌組合物可以在應用本發(fā)明的組合物或懸浮液之前、期間或之后應用到食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品上。
在另一方面中，本發(fā)明涉及含有I至1000升的本發(fā)明的組合物或懸浮液的容器。 該容器可以是瓶子、袋子或罐，這里僅僅列舉了一小部分。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種保存食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的方法，其中本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物或懸浮液用在、例如施加在各產(chǎn)品之中和/或之上。乳鏈球菌素組合物和懸浮液可以通過噴射、浸潰、浸入、刷涂來施加，這里僅僅列舉了一小部分。在底物/產(chǎn)品是液體或半液體的情況下，所述組合物和懸浮液可以直接加入。該組合物或懸浮液甚至可以在它們施加的底物上留下涂層、例如抗菌涂層?？蛇x地，在進一步的步驟中，產(chǎn)品還可以進行巴氏消毒/滅菌。這個步驟當然也可以在施加本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物或懸浮液之前進行。所有類型的食品都可以采用本發(fā)明的組合物或懸浮液進行處理。所述食品可以是乳類食品；包含或衍生自蛋(例如液體蛋)、肉(尤其是禽肉，例如新宰殺的禽肉)、蔬菜、 甲殼動物和魚的食品；米制品，諸如煮沸的米制品；烘焙食品；飲料；冷藏食品；透明食品如果凍基食品，如果凍甜點；果汁；涂抹食品；果醬；罐裝水果和其他罐裝產(chǎn)品；其中表面上涂覆有本發(fā)明的組合物或懸浮液的食品。乳類食品包括但不限于，加工奶酪、乳、凍奶油、奶類甜品、冰淇淋混合物、調(diào)料和酸乳酪。本發(fā)明的組合物和懸浮液還可用于處理食品包裝和加工設(shè)備，并且可以包含在用于包裝食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的包裝材料之中/之上。本發(fā)明的組合物和懸浮液還可用作清潔食品表面和食品加工工廠的烹調(diào)器具以及在其中進行食物的準備或供應的任何區(qū)域(諸如醫(yī)院、療養(yǎng)院、餐廳尤其是快餐廳、熟食店等等)的消毒劑。 根據(jù)本發(fā)明的組合物和懸浮液能夠長時間抑制產(chǎn)品中的細菌生長，例如抑制至少約I天、2 天、3天、4天、5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、 65 天、70 天、75 天、80 天、85 天、90 天、95 天、100 天、150 天、200 天、250 天、300 天、400 天、 500天、600天、700天、800天、900天，優(yōu)選為至少約1000天。根據(jù)本發(fā)明的組合物和懸浮液可用于抑制細菌生長，例如革蘭氏陽性菌(如Staphylococcus、Streptococcus、Listeria、 Bacillus、Clostridium 和 Coryneform 菌)的生長。
因此，含有本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物和懸浮液的食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品也是本發(fā)明的一部分。
另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)固體(例如粉末)乳鏈球菌素組合物的方法，所述方法包括如下步驟使 本發(fā)明的液體乳鏈球菌素組合物進行例如干燥步驟、凍干步驟、結(jié)晶步驟(如果需要接著過濾或離心)或沉淀步驟(如果需要接著過濾或離心)，這里僅僅列舉了一小部分。這些步驟可以在上述用于制備本發(fā)明的乳鏈球菌素組合物的方法的步驟c、d 或pH調(diào)節(jié)步驟之后立即進行。它們還可以在本發(fā)明的液體乳鏈球菌素組合物已經(jīng)儲存了一段時間之后進行。所得固體/粉末乳鏈球菌素組合物可以與含有其他適當化合物(諸如上述額外的功能化合物)的粉末組合物混合。
通過以下實施例進一步闡述本發(fā)明，但是這些實施例不應構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。實施例
實施例1
液體乳鏈球菌素組合物的制備
制備如下液體乳鏈球菌素組合物
組合物A :將含有2.5% w/w的乳鏈球菌素和至少50 % w/w的NaCl的7克乳鏈球菌素粉末 Nisaplin (Danisco,Denmark)溶解在 63.1 克的 HCl 水溶液(pH 2. 0-3. O)中。 隨后，添加28. 5克丙三醇和1. 4克β酒花酸(40% w/v ；Steiner, USA)。最終的組合物具有3. 0-4. 5的pH，該組合物的總質(zhì)量為100克。組合物中的最終無機鹽濃度為約3. 5% w/ W。最終的乳鏈球菌素組合物為O. 175% w/w,而最終的酒花酸濃度為O. 56% w/w。
組合物B :將含有2.5% w/w的乳鏈球菌素和至少50 % w/w的NaCl的7克乳鏈球菌素粉末 Nisaplin (Danisco,Denmark)溶解在 63.1 克的 HCl 水溶液(pH 5. 5-6. 5)中。 隨后，添加28. 5克丙三醇和1. 4克β酒花酸(40% w/v ；Steiner, USA)。最終的組合物具有3. 0-4. 5的pH，該組合物的總質(zhì)量為100克。組合物中的最終無機鹽濃度為約3. 5% w/ W。最終的乳鏈球菌素組合物為O. 175% w/w,而最終的酒花酸濃度為O. 56% w/w。
組合物C和D :將含有2. 5 % w/w的乳鏈球菌素和至少50 % w/w的NaCl的10克乳鏈球菌素粉末Nisaplin (Danisco,Denmark)溶解在具有O. 2M磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的緩沖水溶液中(pH約6 ;總體積100ml)。隨后，將混合物混合約15分鐘。將混合物在 10°C、4500xg下離心15分鐘，從而獲得含有乳鏈球菌素的小粒(pellet)。隨后，將小粒溶解在檸檬酸水溶液(PH2. 0-3. O ;總體積100ml)中。將混合物混合15分鐘。將所得含有乳鏈球菌素的溶液在10°C、4500xg下離心15分鐘以去除剩余的固體組分，從而獲得液體乳鏈球菌素組合物。液體乳鏈球菌素組合物的pH為2. O至3. 5 (組合物C)或者該pH通過添加 NaOH被調(diào)節(jié)至5. O和6. 5的pH(組合物D)。隨后，向70.1克的組合物C或組合物D中， 添加28. 5克丙三醇和1. 4克β酒花酸(40% w/v ；Steiner,USA)。組合物的總質(zhì)量為100 克。組合物中的最終無機鹽濃度為約3. 5% w/w 。最終的乳鏈球菌素組合物為O. 175% w/ w,而最終的酒花酸濃度為O. 56% w/w。
組合物E和F :組合物E和F的制備與組合物C和D的制備相同，不同之處在于小粒被溶解在pH 2. O至3. O的HCl水溶液中。液體乳鏈球菌素組合物的pH為2. O至3. 5 (組合物E)或者該pH通過添加NaOH被調(diào)節(jié)至5. O和6. 5的pH (組合物F)。隨后，向70.1克的組合物E或組合物F中，添加28. 5克丙三醇和1. 4克β酒花酸(40% w/v ；Steiner, USA)。 組合物的總質(zhì)量為100克。組合物中的最終無機鹽濃度為約3. 5% w/w。最終的乳鏈球菌素組合物為O. 175% w/w，而最終的酒花酸濃度為O. 56% w/w。
組合物G和H :將含有2. 5% w/w的乳鏈球菌素和至少50% w/w的NaCl的10克乳鏈球菌素粉末Nisaplin (Danisco, Denmark)溶解在HCl水溶液中(ρΗ2· 0-3. O ;總體積100ml)。將所得混合物在pH 2. O至3. O的HCl水溶液中滲析24小時。然后，將滲析的混合物在10°C、4500xg下離心15分鐘，從而獲得液體乳鏈球菌素組合物。隨后，將28. 5克丙三醇和1. 4克β酒花酸(40% w/v ；Steiner, USA)添加到70.1克的所得液體乳鏈球菌素組合物中。該pH通過添加HCl而被調(diào)節(jié)至2. O至3. 5的pH(組合物G)或該pH由于β 酒花酸的添加而被調(diào)節(jié)至5. O和6. 5的ρΗ(組合物H)。該組合物基本上不含無機鹽。最終的乳鏈球菌素濃度為O. 175% w/w，而最終的酒花酸濃度為O. 56% w/w。所得組合物用在如下實驗中。
實施例2
MIC 試驗
為了 MIC試驗，由在Iso Sensitest Broth (Oxoid)中30°C下過夜培養(yǎng)生長獲得新培養(yǎng)的Micrococcus luteus細胞(B212)。在生理鹽水中制備具有6. 6 X IO5菌群形成單位 (CFU) /ml的原料懸浮液。將30 μ I的各原料溶液添加到30ml的Iso Sensitest Broth中 (懸浮液A)。然后，將100 μ I的懸浮液轉(zhuǎn)移到第一 96孔微滴定盤的每個孔中。根據(jù)實施例I制備乳鏈球菌素組合物。在標準微量培養(yǎng)基稀釋試驗中使用100 μ I的乳鏈球菌素組合物以確定各乳鏈球菌素組合物的最小抑制濃度(MIC)。在各個實驗中，比較組合物A和C 對于新培養(yǎng)的Staphylococcus aureus (ATCC 27661)的MIC濃度。該實驗以與上述實驗相同的方式進行，不同之處在于，所制備的原料懸浮液包含1. 3X107CFU/ml。
表I中列舉出的結(jié)果表明，組合物C、D、E和F與組合物A、B和H相比在2. O至3. 5 的pH下和在5. O和6. 5的pH下對M.1uteus具有遠遠更高的活性(即更低的MIC)。組合物C和E的MIC與組合物A的MIC相比低約8至約250倍(所有組合物都具有2. O至3. 5 的pH);而組合物D和F的MIC與組合物B和H的MIC相比低約15至約500倍。
在各個實驗中，比較組合物A和C對于新培養(yǎng)的Staphylococcus aureus (ATCC 27661)的MIC濃度。該實驗以與上述實驗相同的方式進行，不同之處在于，所制備的原料懸浮液包含1. 3 X 107CFU/ml。結(jié)果表明，組合物C對于所測革蘭氏陽性微生物的MIC與組合物A的MIC相比低約2倍(參見表2)。
實施例3
液體乳鏈球菌素組合物在飲料應用中的用途
在這個實驗中，測試組合物A和C在飲料應用中降低不同污染微生物的活細胞數(shù)的能力。根據(jù)實施例1制備組合物A和C。所用飲料是來自Bavaria, Colombia的麥芽飲料Pony。為了這個實驗，由在Plate Count Broth (Difco)中30°C下過夜培養(yǎng)生長獲得新培養(yǎng)的 Listeria monocytogenes 細胞(LM35b)和 Leuconostoc mesenteroide 細胞。在生理鹽水中分別制備具有6.1 X IO5和7.1 X 105CFU/ml的原料懸浮液。將100 μ I的各原料溶液添加到IOml被組合物A或C抑制的飲料中。所測試的乳鏈球菌素濃度分別為在10°C和 25°C下對 Listeria monocytogenes 細胞的 O. 5ppm,以及在 10°C和 25°C下對 Leuconostoc mesenteroides細胞的4ppm或8ppm。對于每種微生物,不含乳鏈球菌素的對照組被包括在內(nèi)。樣品在10°C或25°C下培養(yǎng)，并且利用已知方法以不同時間間隔測量微生物的總細胞數(shù) (以 CFU/ml 計)。
結(jié)果示于表3、4和5中。結(jié)果清楚地表明了，與組合物A相比，所測試的兩種微生物的活細胞數(shù)被組合物C降低得更多。該結(jié)果還表明了，與組合物A相比，組合物C可以更快速地將總活細胞數(shù)降低至檢測限(即10CFU/ml)以下。
實施例4
在這個實驗中，測試組合物A和C在食物應用模型中降低Listeria monocytogenes的活細胞數(shù)的能力。根據(jù)實施例1制備組合物A和C。該應用模型是由 Friesche Vlag獲得的半脫脂UHT乳。為了這個實驗，由在Plate Count Broth (Difco)中 30°C下過夜培養(yǎng)生長獲得新培養(yǎng)的Listeria monocytogenes細胞(LM35b)。在生理鹽水中分別制備具有6.1 X 107CFU/ml的原料懸浮液。將100 μ I的原料溶液添加到IOml被組合物A或C抑制的乳中。所測試的乳鏈球菌素濃度為6. 25和12. 5 μ g/ml。不含乳鏈球菌素的對照組被包括在內(nèi)。樣品在10°C下培養(yǎng)，并且利用已知方法以不同時間間隔測量微生物的總細胞數(shù)(以CFU/ml計)。
結(jié)果(參見表6)清楚地表明了，與組合物A相比，組合物C在食物應用模型中對 Listeria monocytogenes的長出具有更高的抑制作用。
實施例5
穩(wěn)定乳鏈球菌素/酒花酸懸浮液的制備
制備含有7 % w/w乳鏈球菌素粉末(Silver Elephant,中國，含有2. 5 % w/w乳鏈球菌素和至少50 % w/w NaCl)、28· 5 % w/w丙三醇、1. 4 % w/w β酒花酸(40 % w/v ; Steiner, USA)和63% w/w水的含水懸浮液。向這些懸浮液中,添加不同量的各種增稠劑。 采用HCl和NaOH溶液將pH設(shè)定在pH2或pH5。懸浮液的物理穩(wěn)定性在室溫下儲存9天之后通過分析含有47. 5ml的懸浮液的50ml試管中沉降線(sedimentation front)的高度來進行分析。制備沒有增稠劑的懸浮液作為對照。
結(jié)果列出表7中。所有懸浮液的乳鏈球菌素濃度為0. 175% w/w。所有懸浮液的酒花酸濃度為0.56% w/w。沉降表達為所觀測到的分離層百分比。0%表示沒有沉降出現(xiàn)，因而該懸浮液具有良好的物理穩(wěn)定性。該結(jié)果表明，在PH2下，該懸浮液在以至少0.1% (w/ w)的濃度使用黃原膠時是物理穩(wěn)定的，而在pH5下，該懸浮液在以至少0. 2% (w/w)的濃度使用黃原膠時是物理穩(wěn)定的。該結(jié)果進一步表明了，在PH2和pH5下，該懸浮液在使用CMC、 藻酸鹽或HPMC時都不是物理穩(wěn)定的。
表1:乳鏈球菌素/酒花酸組合物對M. luteus的MIC值，以μ g/ml計
權(quán)利要求
1.一種用于制備液體乳鏈球菌素組合物的方法，所述方法包括如下步驟 a)將粉末乳鏈球菌素與含水溶液混合，從而制成具有3.5至12的pH并且具有小于或等于1. 5M的最終無機鹽濃度的含有乳鏈球菌素的第一液體組合物， b)通過離心、過濾或其任意組合將固體化合物從所制備的含有乳鏈球菌素的第一液體組合物中離析出來， c)使離析出的固體化合物與具有約I至約3的pH的溶液接觸，從而制成第二液體乳鏈球菌素組合物， d)可選地，從所述第二液體乳鏈球菌素組合物中去除固體化合物， 其特征在于，所述方法還包括添加至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括將所述第二液體乳鏈球菌素組合物的pH調(diào)節(jié)至所需值的步驟。
3.能通過權(quán)利要求1或2的方法獲得的液體乳鏈球菌素組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其對Micrococcusluteus B212具有小于或等于O.05 μ g/ml的最小抑菌濃度(MIC)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的組合物，其具有1.5至5的pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任意一項的組合物，其中所述組合物具有100:1至1: 100的鹽對乳鏈球菌素比。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任意一項的組合物，其中，所述組合物包含O.00001至5%(w/w)量的酒花酸、酒花酸衍生物或其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任意一項的組合物，還包含至少一種選自如下的化合物額外的抗菌化合物、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、防凍劑、消泡劑和增稠劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中所述化合物是山梨酸的鹽。
10.一種含水懸浮液，其具有2至12的pH并且包含乳鏈球菌素、樹膠和至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的懸浮液，其包含O.01至5% (w/w)的乳鏈球菌素和O. 05至5%(w/w)的樹膠和0.0000001至25% (w/w)的酒花酸、酒花酸衍生物或其組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的懸浮液，其中所述樹膠是黃原膠。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任意一項的懸浮液，還包含至少一種選自如下的化合物額外的抗菌化合物、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、消泡劑和防凍劑。
14.一種用于制備權(quán)利要求10至13中任意一項的懸浮液的方法，所述方法包括如下步驟 a)將乳鏈球菌素、樹膠和至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物單獨地或以粉末組合物形式添加到含水溶液中， b)混合從而得到懸浮液；以及 c)如果需要，將該懸浮液的pH調(diào)節(jié)至2至12。
15.用在權(quán)利要求14的方法中的粉末組合物,其包含乳鏈球菌素、樹膠和至少一種選自酒花酸和酒花酸衍生物的化合物。
16.權(quán)利要求10至13中任意一項所述的含水懸浮液在制備用于處理食物、飼料或農(nóng)用產(chǎn)品的處理液中的用途。
17.權(quán)利要求3至9中任意一項所述的組合物或權(quán)利要求10至13中任意一項所述的懸浮液在食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品之中和/或之上作為防腐劑的用途。
18.一種用于保存食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的方法，其中，將權(quán)利要求3至9中任意一項所述的組合物或權(quán)利要求10至13中任意一項所述的懸浮液施加到所述食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品O
19.一種生產(chǎn)固體乳鏈球菌素組合物的方法，其包括使權(quán)利要求3至9中任意一項所述的組合物進行干燥步驟、凍干步驟、結(jié)晶步驟或沉淀步驟的步驟。
20.一種食物、飼料或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求3至9中任意一項所述的組合物或權(quán)利要求10至13中任意一項所述的懸浮液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有高抗菌活性的液體抗菌組合物。本發(fā)明還涉及用于制備這種液體抗菌組合物的方法以及它們在食品中作為防腐劑的用途。
文檔編號A23L3/3463GK103002733SQ201180010185
公開日2013年3月27日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月17日
發(fā)明者約翰尼斯·馬丁努斯·雅各布斯·威瑟爾, 本·魯多爾夫·翰·德, 威廉·羅伯特·金 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司