專利名稱：有效建立經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改善經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(下文稱為iPS細(xì)胞)的建立效率的方法和因此的試劑，更具體而言涉及使用GLIS家族的成員和Klf家族的成員改善iPS細(xì)胞的建立效率的方法和因此的試劑等。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，小鼠和人iPS細(xì)胞已相繼建立。Takahashi和Yamanaka通過(guò)將0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因轉(zhuǎn)移到來(lái)自報(bào)道小鼠的成纖維細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，其在所述報(bào)道小鼠中將新霉素抗性基因敲入到Fbxl5基因座內(nèi)，并且迫使細(xì)胞表達(dá)該基因[Takahashi，K.和 Yamanaka，S.，Cell，126: 663-676(2006)]。Okita 等人成功建立了顯示與胚胎干(ES)細(xì)胞的那些幾乎相同的基因表達(dá)和后天修飾概況的iPS細(xì)胞(Nanog iPS細(xì)胞)，通過(guò) 產(chǎn)生具有綠色熒光蛋白(GFP)和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座內(nèi)的轉(zhuǎn)基因小鼠，所述Nanog的表達(dá)比Fbxl5的表達(dá)更局限于多能細(xì)胞中，迫使來(lái)自小鼠的成纖維細(xì)胞表達(dá)上述四種基因，并且選擇其為嘌呤霉素抗性的細(xì)胞和GFP陽(yáng)性細(xì)胞[Okita，K.等人，Nature,448: 313—317(2007)]。類似結(jié)果由其他團(tuán)體獲得[Wernig，Μ.等人，Nature，448:318-324(2007) ；Maherali,N.等人，Cell Stem Cell, I 55-70(2007)]。其后，揭示 iPS 細(xì)胞還可以用除c-Myc基因外的3種因子產(chǎn)生[Nakagawa, M.等人，Tfei. Biotethnol.，26··101-106(2008)]。此外，Takahashi等人[Takahashi，K.等k,Cell，131·. 861-872 (2007)]通過(guò)將與小鼠中使用的那些相同的4種基因引入人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)成功建立了 iPS細(xì)胞。另一方面，Yu等人使用Nanog和Lin28代替Klf4和c_Myc產(chǎn)生人iPS細(xì)胞[Yu, J.等人,Science,318: 1917-1920 (2007)] ο因此，已證實(shí)通過(guò)將限定因子轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞內(nèi)，可以在人和小鼠中產(chǎn)生就多能性而言與ES細(xì)胞可比較的iPS細(xì)胞。自那以后，已作出廣泛多樣的嘗試，以增加iPS細(xì)胞建立的效率，包括通過(guò)轉(zhuǎn)移TERT和SV40大T抗原(稱為人細(xì)胞永生化基因)連同四種因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc[Park, I. H.等k，Nature，451\ 141-146(2008)]建立的 iPS 細(xì)胞，伴隨 Nanog和 Lin28 加入前述四種因子建立的 iPS 細(xì)胞[Liao，J.等k’Cell Research，18·. 600-603 (2008)]，和伴隨UTFl加入前述四種或除c-Myc外的三種因子建立的iPS細(xì)胞[Zhao，Y.等人，CW7 StemCell，3·. 475-479(2008)]。然而，其中仍未達(dá)到良好改善的情況維持原狀。發(fā)明概述
本發(fā)明人進(jìn)行廣泛研究，不僅在多能細(xì)胞例如ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因中，還從更廣泛范圍的轉(zhuǎn)錄因子的基因文庫(kù)中，尋找可以用于建立iPS細(xì)胞的基因作為用于Klf4的替代物。通過(guò)將屬于GLIS家族的基因(例如GLIS1)、屬于PTX家族的基因(例如PITX2)、或DMRT樣家族B具有富含脯氨酸的C末端I基因(DMRTBl)，連同三種基因0ct3/4、Sox2和c-Myc —起轉(zhuǎn)移到小鼠和人表皮成纖維細(xì)胞，本發(fā)明人因此成功地有效建立iPS細(xì)胞，并且將這些轉(zhuǎn)錄因子鑒定為能夠在功能上取代Klf4的新核重編程物質(zhì)(于2009年2月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/208，853，和于2009年9月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/276， 123)。接下來(lái)，本發(fā)明人研究與Klf4組合使用的這些Klf4替代因子GLISl、PITX2和DMRTBl對(duì)iPS細(xì)胞建立的作用。作為出乎意料的結(jié)果，當(dāng)與Klf4組合時(shí)，PITX2和DMRTBl顯示出完全無(wú)附加效應(yīng)，而GLISl和Klf4的組合使用對(duì)小鼠和人細(xì)胞中的iPS細(xì)胞建立產(chǎn)生顯著協(xié)同作用。本發(fā)明人基于這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究，并且已發(fā)展了本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了下述
[I]改善iPS細(xì)胞建立效率的方法，其包括使下述(I)和(2)與體細(xì)胞接觸
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)。[2]根據(jù)上文[I]的方法，其中上文的物質(zhì)⑴包括GLIS家族鋅指I (GLISl)或編 碼GLISl的核酸。[3]根據(jù)上文[I]或[2]的方法，其中上文的物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。[4]包含下述⑴和⑵的iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)。[5]根據(jù)上文[4]的改進(jìn)劑，其中上文的物質(zhì)⑴包括GLISl或編碼GLISl的核酸。[6]根據(jù)上文[4]或[5]的改進(jìn)劑，其中上文的物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。[7]產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方法，其包括使下述⑴、⑵和(3)與體細(xì)胞接觸
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(3)通過(guò)與上文的物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)。[8]根據(jù)上文[7]的方法，其中上文的物質(zhì)(I)包括GLISl或編碼GLISl的核酸。[9]根據(jù)上文[7]或[8]的方法，其中上文的物質(zhì)⑵包括Klf4或編碼Klf4的核酸。[10]根據(jù)上文[7] - [9]中任一項(xiàng)的方法，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)選自O(shè)ct家族的成員、Sox家族的成員、Myc家族的成員、Lin28家族的成員、Nanog和編碼其的核酸。[11]根據(jù)上文[7] - [9]中任一項(xiàng)的方法，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4或編碼其的核酸。[12]根據(jù)上文[11]的方法，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4和Sox2或編碼其的核酸。[13]根據(jù)上文[11]的方法，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4、Sox2和c-Myc或編碼其的核酸。[14]用于來(lái)自體細(xì)胞的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的試劑，其包括下述⑴、⑵和(3):
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(3)通過(guò)與上文的物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)。
[15]根據(jù)上文[14]的試劑，其中上文的物質(zhì)⑴包括GLISl或編碼GLISl的核酸。[16]根據(jù)上文[14]或[15]的試劑，其中上文的物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。[17]根據(jù)上文[14] - [16]中任一項(xiàng)的試劑，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)選自O(shè)ct家族的成員、Sox家族的成員、Myc家族的成員、Lin28家族的成員、Nanog和編碼其的核酸。[18]根據(jù)上文[14] - [16]中任一項(xiàng)的試劑，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4或編碼其的核酸。[19]根據(jù)上文[18]的試劑，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4和Sox2或 編碼其的核酸。[20]根據(jù)上文[18]的試劑，其中上文的核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4、Sox2和c-Myc或編碼其的核酸。[21] iPS細(xì)胞，其包含下述(I)和(2):
(1)選自編碼GLIS家族的成員的外源核酸的一種或多種核酸，
(2)選自編碼Klf家族的成員的外源核酸的一種或多種核酸。[22]根據(jù)上文[21]的iPS細(xì)胞，其中將所述外源核酸整合到基因組中。[23]產(chǎn)生體細(xì)胞的方法，其包括處理根據(jù)上文[21]或[22]的iPS細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化成體細(xì)胞。[24]產(chǎn)生體細(xì)胞的方法，其包括下述⑴和(2):
(1)通過(guò)根據(jù)上文[7]- [13]中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生iPS細(xì)胞的步驟，和
(2)處理通過(guò)上文步驟(I)獲得的iPS細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化成體細(xì)胞的步驟。[25]下述(I)和⑵改善iPS細(xì)胞建立效率的用途
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)。[26]選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)改善iPS細(xì)胞建立效率的用途，其中該物質(zhì)連同選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)一起與體細(xì)胞接觸。[27]下述⑴、⑵和(3)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(3)通過(guò)與上文的物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)。[28]下述(I)和(2)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途
(1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，
(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，其中所述因子連同通過(guò)與上文的物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)一起與體細(xì)胞接觸。[29] (I)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途，其中所述物質(zhì)連同(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)、和通過(guò)與上文的物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)一起與體細(xì)胞接觸。[30]根據(jù)上文[21]或[22]的iPS細(xì)胞在產(chǎn)生體細(xì)胞中的用途。[31]根據(jù)上文[21]或[22]的iPS細(xì)胞，其中iPS細(xì)胞充當(dāng)產(chǎn)生體細(xì)胞中的細(xì)胞來(lái)源。如上所述，本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑能夠顯著改善來(lái)自體細(xì)胞的iPS細(xì)胞建立效率，并且因此在例如對(duì)于通過(guò)自體移植的人移植醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中有用。附圖簡(jiǎn)述
圖I是顯示用于通過(guò)功能縮小來(lái)自人Gateway 入門克隆(N. Goshima等人，Naturemethods, 2008)的入門克隆的步驟的示意圖。
圖2概述用于制備用于從轉(zhuǎn)錄因子的入門克隆篩選體細(xì)胞重編程因子的轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)的程序。圖3是通過(guò)借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒將總共4種不同基因即3種基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和G06 (基因密碼名稱GLIS1)、H08 (基因密碼名稱DMRTB1)或HlO (基因密碼名稱PITX2)轉(zhuǎn)移到Nanog-GFP小鼠表皮成纖維細(xì)胞內(nèi)獲得的GFP陽(yáng)性集落形態(tài)的照相表示?！癒lf-G6-1”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移G06(基因密碼名稱GLIS1)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克隆；“Klf-H8-2”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移H08(基因密碼名稱DMRTB1)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克?。弧癒lf-H10-l”和“Klf-ΗΙΟ”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移H10(基因密碼名稱PITX2)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克隆。PO顯示在集落建立時(shí)獲得的照片；P1顯示關(guān)于第一代(24個(gè)孔)的照片；P2顯示關(guān)于第二代(6個(gè)孔)的照片。對(duì)于每組三張照片，左側(cè)小圖顯示GFP陽(yáng)性集落的圖像，中間小圖顯示相位差圖像，并且右側(cè)小圖顯示GFP陽(yáng)性集落圖像和相位差圖像的重疊照片。僅Klf-HlO-I通過(guò)Reseed方法建立，而其他通過(guò)MSTO方法建立。圖4是在集落建立時(shí)，通過(guò)借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒將總共4種不同基因即3種基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和H)9(基因密碼名稱:IRX6)、G06(基因密碼名稱:GLIS1)、H08(基因密碼名稱DMRTB1)或HlO (基因密碼名稱PITX2)轉(zhuǎn)移到Nanog-GFP小鼠表皮成纖維細(xì)胞內(nèi)獲得的GFP陽(yáng)性集落形態(tài)的照相表示?！癒lf-F9”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移R)9(基因密碼名稱IRX6)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克?。弧癒lf-G6-l”和“Klf-G6-2”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移G06(基因密碼名稱GLIS1)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克??；“Klf-H8-l”和“Klf-H8-2”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移H08(基因密碼名稱DMRTB1)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克??；“Klf_H10”指示通過(guò)轉(zhuǎn)移HlO (基因密碼名稱PITX2)連同3種基因獲得的iPS細(xì)胞克隆?！癛eseed”顯示通過(guò)Reseed方法獲得的結(jié)果；“MST0”顯示通過(guò)MSTO方法獲得的結(jié)果。圖5 是關(guān)于 G6-1 (Klf-G6-1)、H8_2 (Klf-H8_2)和 HlO (Klf-HlO) iPS 細(xì)胞克隆的基因組PCR結(jié)果的照相表示，其中“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，并且“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合到PMXs內(nèi)的每種基因制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖6是除圖5中所示的那種外，對(duì)HlO (Klf-HlO) iPS細(xì)胞克隆的基因組PCR結(jié)果的照相表示。在圖6中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞，并且“質(zhì)?！敝甘就ㄟ^(guò)擴(kuò)增整合到PMXs內(nèi)的每種基因制備的陽(yáng)性對(duì)照。圖7 是關(guān)于 G6-l(Klf-G6-l)、H8-2 (Klf-H8_2)和 HlO (Klf-HlO) iPS 細(xì)胞克隆的RT-PCR結(jié)果的照相表示，其中“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞；“ES”和“iPS”指示小鼠ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞；“Sox2 RT-”是陰性對(duì)照。圖8是除圖7中所示的那種外，對(duì)HlO (Klf-HlO) iPS細(xì)胞克隆的RT-PCR結(jié)果的照相表示。在該圖中，“皮膚”指示用作體細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞；“ES”和“iPS”指示小鼠ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞；“Sox2 RT-”是陰性對(duì)照。圖9是計(jì)數(shù)通過(guò)將2種因子(0ct3/4、Sox2)或3種因子(0ct3/4、Sox2、Klf4)與G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或HlO (PITX2)的組合轉(zhuǎn)移到Nanog-GFP小鼠表皮成纖維細(xì)胞內(nèi)建立的iPS細(xì)胞(GFP陽(yáng)性細(xì)胞)集落的結(jié)果的圖示。概括了三次(對(duì)于僅對(duì)照四次)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖10顯示在感染后22天來(lái)自所示因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞的Nanog-GFP陽(yáng)性集落數(shù)目。圖11顯示在感染后22天來(lái)自所示因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞的Nanog-GFP陽(yáng)性集落比。該圖表顯示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值伴隨標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。林p〈0.01。 圖12顯示來(lái)自皮膚成纖維細(xì)胞(PO ;第O代)的Nanog-GFP陽(yáng)性集落。熒光圖像(左側(cè))；相位差圖像(中間)；合并圖像(右側(cè))。圖13顯示在感染后20天來(lái)自所示因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEFs的Nanog-GFP陽(yáng)性集落數(shù)目。在感染3天后，將成纖維細(xì)胞再種植到飼養(yǎng)細(xì)胞上。圖14顯示在感染后20天來(lái)自所示因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEFs的Nanog-GFP陽(yáng)性集落比。該圖表代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值伴隨標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。**: p〈0.01。圖15顯示來(lái)自MEFs (PO ;第O代)的Nanog-GFP陽(yáng)性集落。熒光圖像(左側(cè));相位差圖像(中間)；合并圖像(右側(cè))。圖16是計(jì)數(shù)通過(guò)將3種因子(0ct3/4、Sox2、c_Myc)與Klf4和/或G6 (GLISl)的組合轉(zhuǎn)移到成年表皮成纖維細(xì)胞(HDF)內(nèi)建立的iPS細(xì)胞(ES樣細(xì)胞)集落的結(jié)果的圖示，其中“104”和“105”分別指示關(guān)于再種植到飼養(yǎng)細(xì)胞上的5 X IO4細(xì)胞/100 mm皿和5 X IO5細(xì)胞/100 mm皿的結(jié)果。概括了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖17是計(jì)數(shù)通過(guò)將3種因子(0ct3/4、Sox2、c_Myc)與Klf4和/或G6 (GLISl)的組合轉(zhuǎn)移到成年表皮成纖維細(xì)胞(HDF)內(nèi)建立的非iPS細(xì)胞(非ES樣細(xì)胞)集落的結(jié)果的圖示，其中“ 104”和“ 105”分別指示關(guān)于再種植到飼養(yǎng)細(xì)胞上的5 X IO4細(xì)胞/100 mm皿和5X IO5細(xì)胞/100 mm皿的結(jié)果。概括了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖18是由0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和G6建立的iPS集落(ES樣集落)的相位差圖像的照相表示。圖19顯示在感染后約30天來(lái)自所示因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的人表皮成纖維細(xì)胞(上5 X IO4細(xì)胞，下5 X IO5細(xì)胞)的ESC樣集落數(shù)目。圖20顯示在感染后約30天來(lái)自所示因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的人表皮成纖維細(xì)胞(上5 X IO4細(xì)胞，下5 X IO5細(xì)胞)的ESC樣集落比。該圖表顯示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值伴隨標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。*: ρ〈0·05;**: ρ〈0·01。圖21顯示通過(guò)OSK + GLISl生成的人ESC樣集落。圖22顯示在建立的人iPS克隆中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的基因組-PCR分析。AHDF :成年表皮成纖維細(xì)胞。圖23顯示在通過(guò)OSK + GLISl生成的人iPSCs中ESC-標(biāo)記基因的RT-PCR分析。AHDF :成年表皮成纖維細(xì)胞；201B7 :通過(guò)OSKM生成的人iPS克隆。圖24顯示如通過(guò)DNA微陣列測(cè)定的，比較在由OSK + GLISl生成的iPSCs和成年HDFs之間(上)、和在OSK + GLISl轉(zhuǎn)導(dǎo)的iPSCs和OSKM轉(zhuǎn)導(dǎo)的iPSCs之間(下)的總體基因表達(dá)的散布圖。計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)(R2)。圖25顯示由OSK + GLISl生成的人iPSCs的畸胎瘤形成。圖26顯示在多種小鼠組織中GLISl的表達(dá)。從每種小鼠組織中分離的總RNA通過(guò)定量RT-PCR進(jìn)行檢查。該圖表顯示四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值伴隨標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。圖27顯示在暴露于GLISl shRNAs的皮膚成纖維細(xì)胞中內(nèi)源GLISl的定量RT-PCR分析。該圖表顯示二次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值伴隨平均誤差(誤差條)。圖28顯示GLISl shRNAs對(duì)通過(guò)3種重編程因子(OSK)的iPSC建立效率的作用。 在OSK連同或不連同GLISl ShRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)后四周，計(jì)數(shù)Nanog-GFP陽(yáng)性集落的數(shù)目。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了改善iPS細(xì)胞建立效率的方法，其包括在體細(xì)胞的核重編程步驟中，使
(I)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，和(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)(下文也稱為本發(fā)明的建立效率改善因子)與體細(xì)胞接觸。因?yàn)轶w細(xì)胞核重編程通過(guò)使核重編程物質(zhì)與體細(xì)胞接觸來(lái)達(dá)到，所以本發(fā)明還提供了產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方法，其包括使(3)通過(guò)與上文的物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)(下文也簡(jiǎn)稱為核重編程物質(zhì))連同上文的物質(zhì)(I)和(2) —起與體細(xì)胞接觸。此處，其中iPS細(xì)胞不能單獨(dú)由上文的物質(zhì)(3)(核重編程物質(zhì))建立，但當(dāng)核重編程物質(zhì)連同本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子一起與體細(xì)胞接觸時(shí)可以建立的情況，也視為“建立效率的改善”。(a)體細(xì)胞的來(lái)源
除哺乳動(dòng)物起源(例如人、小鼠、猴、牛、豬、大鼠、犬等)的生殖細(xì)胞外的任何細(xì)胞可以用作原材料用于在本發(fā)明中產(chǎn)生iPS細(xì)胞。例子包括角質(zhì)化上皮細(xì)胞(例如角質(zhì)化的表皮細(xì)胞)、粘膜上皮細(xì)胞(例如舌淺表的上皮細(xì)胞)、外分泌腺上皮細(xì)胞(例如乳腺細(xì)胞)、激素分泌細(xì)胞(例如腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞)、用于代謝或貯存的細(xì)胞(例如肝細(xì)胞)、構(gòu)成界面的內(nèi)膜上皮細(xì)胞(例如I型肺泡細(xì)胞)、閉膜管的內(nèi)膜上皮細(xì)胞(例如血管內(nèi)皮細(xì)胞)、具有轉(zhuǎn)運(yùn)能力的具有纖毛的細(xì)胞(例如氣道上皮細(xì)胞)、用于細(xì)胞外基質(zhì)分泌的細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞)、收縮細(xì)胞(例如平滑肌細(xì)胞)、血液和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞)、感覺(jué)相關(guān)細(xì)胞(例如桿狀細(xì)胞)、自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元(例如膽堿能神經(jīng)元)、感覺(jué)器官和外周神經(jīng)元的支持細(xì)胞(例如衛(wèi)星細(xì)胞)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如星形膠質(zhì)細(xì)胞)、色素細(xì)胞(例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)、其祖細(xì)胞(例如組織祖細(xì)胞)等。不存在關(guān)于細(xì)胞分化程度，從其中收集細(xì)胞的動(dòng)物年齡等的限制；甚至未分化的祖細(xì)胞(包括成體干細(xì)胞)和最終分化的成熟細(xì)胞可以類似地用作本發(fā)明中的體細(xì)胞來(lái)源。未分化的祖細(xì)胞的例子包括組織干細(xì)胞(成體干細(xì)胞)例如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞。作為體細(xì)胞來(lái)源的哺乳動(dòng)物個(gè)體的選擇并無(wú)特別限制；然而，當(dāng)獲得的iPS細(xì)胞待用于人中的再生醫(yī)學(xué)時(shí)，從預(yù)防移植物排斥的觀點(diǎn)來(lái)看，從具有與患者那種相同或基本上相同的HLA類型的患者或另一個(gè)人中收集體細(xì)胞是特別優(yōu)選的。如本文使用的，當(dāng)它們移植到使用免疫抑制劑等的患者時(shí)，“基本上相同的HLA類型”意指供體的HLA類型與患者那種匹配至移植細(xì)胞(其已通過(guò)誘導(dǎo)衍生自供體的體細(xì)胞的iPS細(xì)胞分化獲得)可以移入的程度。例如，它包括其中主要HLAs (例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三個(gè)主要基因座)是等同的(下文將應(yīng)用相同含義)等的HLA類型。當(dāng)獲得的iPS細(xì)胞不施用于(移植到)人，而是用作例如用于篩選評(píng)估患者的藥物敏感性或不良反應(yīng)的細(xì)胞來(lái)源時(shí)，同樣希望從具有與藥物敏感性或不良反應(yīng)關(guān)聯(lián)的相同遺傳多態(tài)性的患者或另一個(gè)人中收集體細(xì)胞。在實(shí)施核重編程的步驟前，從哺乳動(dòng)物中分離的體細(xì)胞可以根據(jù)細(xì)胞的選擇使用本身已知適合于其培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。此類培養(yǎng)基的例子包括但不限于，含有約5 - 20%胎牛血清(FCS)的最小必需培養(yǎng)基(MEM)、達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基等。當(dāng)轉(zhuǎn)移試劑例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體例如用于使體細(xì)胞接觸本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子和核重編程物質(zhì)(如果需要的話，和下文提 及的另一種iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑)時(shí)，有時(shí)優(yōu)選培養(yǎng)基已替換為無(wú)血清培養(yǎng)基，以便預(yù)防轉(zhuǎn)移效率減少。 (b)本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子
在本發(fā)明中，GLIS家族是具有五個(gè)C2H2 (Cys2-His2-類型)鋅指區(qū)的Kruppel樣鋅指家族，其以其與 Gli 轉(zhuǎn)錄因子[Glis= Gli 相似的，Kim，Y. S.等人，7； Biol. Chem. ,^77(34),30901-30913(2002)]的相似性命名。GLIS家族的成員為(membered)正或負(fù)控制在胚胎發(fā)育過(guò)程中多種基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。這個(gè)基因家族的成員例子包括但不限于GLIS家族鋅指I (GLISl)、GLIS2、GLIS3等，其中優(yōu)先給予GLISl。應(yīng)當(dāng)指出GLISl是在小鼠ES細(xì)胞中不表達(dá)的基因。盡管在本發(fā)明中使用的GLIS家族的成員可以是衍生自任選選擇的哺乳動(dòng)物(例如人、小鼠、大鼠、猴、牛、馬、豬、犬等)的細(xì)胞或組織[例如，胸腺、骨髓、脾、腦、脊髓、心臟、骨骼肌、腎、肺、肝、胰腺或前列腺的細(xì)胞或組織、其相應(yīng)前體細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等]的蛋白質(zhì)或編碼其的核酸，優(yōu)先給予衍生自人或小鼠細(xì)胞或組織的那些。關(guān)于人和小鼠起源的GLIS家族成員的氣基酸序列和cDNA序列的/[目息可以根據(jù)表I中所示的NCBI登記號(hào)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于cDNA序列信息能夠容易地分離編碼各自蛋白質(zhì)的核酸，且根據(jù)需要產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。表I
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Cl臟I Λ|c_ Κι ΜI
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GIJSlN\IJ l042<liS 丨 NDWlIOSTffi | MiJ75-159I與上文顯示的每種氨基酸序列具有90%或更多、優(yōu)選95%或更多、更優(yōu)選98%或更多、特別優(yōu)選99%或更多同一性，且具有與野生型蛋白質(zhì)那種等價(jià)的iPS細(xì)胞建立效率改善效應(yīng)的天然或人工突變蛋白質(zhì)，和編碼其的核酸，也可以用作本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子。此處，在改善iPS細(xì)胞建立效率中的效應(yīng)可以通過(guò)比較在其中僅指定重編程因子(例如2種因子Oct3/4和Sox’由2種因子和c-Myc組成的3種因子等)轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞的情況，和其中除轉(zhuǎn)移重編程因子外，還使本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子與體細(xì)胞接觸的情況之間出現(xiàn)的iPS細(xì)胞集落數(shù)目加以驗(yàn)證。關(guān)于本發(fā)明的GLIS家族的成員和編碼其的核酸，可以單獨(dú)使用屬于該家族的任何一種因子，或可以組合使用兩種或更多種。Klf(KrUppel樣因子)家族的成員為控制多種生物學(xué)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，所述生物學(xué)過(guò)程例如增殖、分化、發(fā)生和細(xì)胞凋亡[McConnell, B. B.等)κ，Bioassays，29··549-557 (2007)]，但其功能仍有待詳細(xì)闡明。這個(gè)基因家族的成員例子包括但不限于Κ1Π、Klf2.Klf4.Klf5等，其中優(yōu)先給予Klf4。如上所述，GLIS家族具有五個(gè)C2H2類型鋅指區(qū)，而Klf家族具有三個(gè)C2H2類型鋅指區(qū)。 Yamanaka等人假設(shè)相同四種基因(0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc)可以用屬于相同各自家族的其他基因代替，并且顯示即使當(dāng)Klf4替換為Klfl、Klf2或Klf5時(shí)，iPS 細(xì)胞也可以建立[W0 2007/069666 Al ；Nakagawa, Μ.等人，Nat. Biotethnol. ,26:101-106 (2008)]。當(dāng)ES細(xì)胞用視黃酸處理以誘導(dǎo)其分化時(shí)，不僅Klf4而且Klf2和Klf5減少其表達(dá)。注意到這個(gè)事實(shí)，Jiang等人的團(tuán)體近來(lái)同時(shí)敲低Klf2、Klf4和Klf5，并且發(fā)現(xiàn)在ES細(xì)胞中誘導(dǎo)分化，顯示Klf家族成員中的至少一些，例如Klf2和Klf5，可以在ES細(xì)胞中在功能上代替 Klf4[Jiang，J.等人，Nat. Cell Biol. ,10: 353-360(2008)]。他們繼續(xù)將Klf2或Klf5基因或其他轉(zhuǎn)錄因子或后生調(diào)節(jié)因子連同三種基因0ct3/4、Sox2和c_Myc一起轉(zhuǎn)移到MEF內(nèi)，證實(shí)Klf2和Klf5可以代替Klf4，并且發(fā)現(xiàn)Esrrb，類似于雌激素受體的孤兒核受體，也能夠代替 Klf4 [Feng, B.等人，Nat. Cell Biol. ,11 197-203(2009)]。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致Klfl、Klf2、Klf5和甚至Esrrb也具有在本文給出的實(shí)施例中證實(shí)的Klf4效應(yīng)(與GLIS家族組合使用的iPS細(xì)胞建立效率的改善)的觀念。盡管在本發(fā)明中使用的Klf家族的成員可以是衍生自任選選擇的哺乳動(dòng)物(例如人、小鼠、大鼠、猴、牛、馬、豬、犬等)的細(xì)胞或組織[例如，胸腺、骨髓、脾、腦、脊髓、心臟、骨骼肌、腎、肺、肝、胰腺或前列腺的細(xì)胞或組織、其相應(yīng)前體細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等]的蛋白質(zhì)或編碼其的核酸，優(yōu)先給予人或小鼠起源的那些。關(guān)于人和小鼠起源的Klf家族成員的氣基酸序列和cDNA序列的/[目息可以根據(jù)表2中所示的NCBI登記號(hào)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于cDNA序列信息能夠容易地分離編碼各自蛋白質(zhì)的核酸，且根據(jù)需要產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。表2
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與上文顯示的每種氨基酸序列具有90%或更多、優(yōu)選95%或更多、更優(yōu)選98%或更多、特別優(yōu)選99%或更多同一性，且具有與野生型蛋白質(zhì)那種等價(jià)的iPS細(xì)胞建立效率改善效應(yīng)的天然或人工突變蛋白質(zhì)，和編碼其的核酸，也可以用作本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子。關(guān)于本發(fā)明的Klf家族的成員和編碼其的核酸，可以單獨(dú)使用屬于該家族的任何一種因子，或可以組合使用兩種或更多種。假設(shè)經(jīng)歷核重編程的體細(xì)胞以足以改善建立效率的水平內(nèi)源表達(dá)GLIS家族的成員或Klf家族的成員中任何一個(gè)的組成成分中的一種或多種，其為本發(fā)明的上述iPS細(xì)胞建立效率改善因子，除去內(nèi)源表達(dá)的組成成分僅剩余組成成分的組合也可以包括在本發(fā)明中的“iPS細(xì)胞建立效率改善因子”的范圍中。以蛋白質(zhì)形式的本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞可以使用本身已知用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的方法來(lái)達(dá)到。此類方法包括例如使用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移試劑的方法，使用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(PTD)或細(xì)胞穿透肽(CPP)融合蛋白的方法，顯微 注射法等。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移試劑是商購(gòu)可得的，包括基于陽(yáng)離子脂質(zhì)的那些，例如BioPOTER蛋白質(zhì)遞送試劑(Gene Therapy Systems)、Pro-Ject 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移試劑(PIERCE)和ProVectin(IMGENEX);基于脂質(zhì)的那些，例如 Profect-1 (Targeting Systems);基于膜可穿透妝的那些，例如 Penetrain Peptide (Q biogene)和 Chariot Kit (Active Motif),利用HVJ包膜(滅活的日本血凝素病毒)的GenomONE (ISHIHARA SANGYO KAISHA,LTD.)等。轉(zhuǎn)移可以根據(jù)與這些試劑附著的方案來(lái)達(dá)到，通常程序如下所述。將本發(fā)明的蛋白質(zhì)的iPS細(xì)胞建立效率改善因子在合適溶劑(例如緩沖溶液例如PBS或HEPES)中稀釋，加入轉(zhuǎn)移試齊IJ，將混合物在室溫溫育約5 - 15分鐘，以形成復(fù)合物，在將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基后，將這種混合物加入細(xì)胞中，并且將細(xì)胞在37°C溫育一至數(shù)小時(shí)。其后，將培養(yǎng)基去除且替換為含血清培養(yǎng)基。開(kāi)發(fā)的PTDs包括使用蛋白質(zhì)的跨細(xì)胞結(jié)構(gòu)域的那些，例如果蠅衍生的AntP、HIV衍生的 TAT(Frankel, A.等人，Cell 55,1189-93 (1988)或 Green, Μ. & Loewenstein,P. M. 1179-88(1988))、Penetratin (Derossi，D.等人，7； Biol. Chem. 269,10444-50(1994))、Buforin II (Park, C. B.等Proc. Natl Acad. Sci. USA 97，8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. f^kFASEB J. 12,67-77 (1998))、MAP (模型兩親妝)(Oehlke, J. ^kBiochim. Biophys. Acta. 1414,127-39 (1998)) > K-FGF (Lin, Y.Z.等人7； Biol. Chem.之鄧，14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada，M.等人艙iareBiol. 5", 352-7 (2003))、月元病毒(Lundberg, P.等)κ Biochem. Biophys. Res. Coimun.之劃，85-90 (2002))、pVEC(Elmqui st，A.等 k Exp. Cell Res.之你，237-44 (2001))、Pep-I (Morris, M. C.等人Tfeiare Biotechnol. 19,1173-6 (2001)) > Pep-7 (Gao, C.等人Bioorg. Med. Chem. 10,4057-65 (2002)) > SynBl (Rousselle, C.等人Pharmacol.57,679-86 (2000)), HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res.仰，6551-6 (2000))、和HSV衍生的VP22。衍生自PTDs的CPPs包括聚精氨酸例如I IR {Cell Stem Cell,4, 381-384(2009))和 9R(CW7 Stem CWA A 472-476 (2009))。制備摻入本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的cDNA和PTD序列或CPP序列的融合蛋白表達(dá)載體，并且使用該載體執(zhí)行重組表達(dá)。將融合蛋白回收且用于轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移可以以與上文相同的方式執(zhí)行，除了不加入蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移試劑外。顯微注射，將蛋白質(zhì)溶液置于具有約I μ m的尖端直徑的玻璃針中且將溶液注射到細(xì)胞內(nèi)的方法，確保蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的其他有用方法包括電穿孔、半完整細(xì)胞法[Kano,F.等人ifeiAotfe inMolecular Biology，第 >22 卷，357-365 (2006)]、使用 Wr_t 肽的轉(zhuǎn)移[Kondo，E.等人，Cancer Ther. 3 (12)，1623-1630 (2004)]等。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移操作可以執(zhí)行一次或多次任選選擇的次數(shù)(例如一次或多次至10次或更少、或一次或多次至5次或更少等)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移操作可以重復(fù)執(zhí)行兩次或更多次(例如3次或4次)。關(guān)于重復(fù)轉(zhuǎn)移操作的時(shí)間間隔是例如6 - 48小時(shí)，優(yōu)選12 - 24小時(shí)。當(dāng)強(qiáng)調(diào)iPS細(xì)胞建立效率時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子不作為蛋 白質(zhì)使用，而是以編碼其的核酸的形式使用。核酸可以是DNA或RNA，并且可以是DNA/RNA嵌合體，其中優(yōu)先給予DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈的。在雙鏈的情況下，同樣可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA、或DNA/RNA雜交物。優(yōu)選地，核酸是雙鏈DNA，優(yōu)選cDNA。本發(fā)明的基于核酸的iPS細(xì)胞建立效率改善因子可以根據(jù)常規(guī)方法，克隆自例如衍生自人或其他哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、猴、豬、犬等)的細(xì)胞或組織[例如，胸腺、骨髓、脾、腦、脊髓、心臟、骨骼肌、腎、肺、肝、胰腺或前列腺的細(xì)胞或組織、其相應(yīng)前體細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等]的cDNA。本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞可以使用本身已知用于基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的方法來(lái)達(dá)到。將編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸插入包含能夠在宿主體細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的合適表達(dá)載體內(nèi)。有用的表達(dá)載體包括例如病毒載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和仙臺(tái)病毒、用于在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒(例如 pAl-1 l、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。待使用的載體的類型可以根據(jù)待獲得的iPS細(xì)胞的預(yù)期用途適當(dāng)選擇。有用的載體包括腺病毒載體、質(zhì)粒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、仙臺(tái)病毒載體等。在表達(dá)載體中使用的啟動(dòng)子的例子包括EFla啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、LTR啟動(dòng)子、CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子、RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動(dòng)子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶)啟動(dòng)子等，其中優(yōu)先給予EFl a啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、MoMuLV LTR、CMV啟動(dòng)子、SR a啟動(dòng)子等。需要時(shí)，除啟動(dòng)子外，表達(dá)載體還可以含有增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、可選標(biāo)記基因、SV40復(fù)制起點(diǎn)等?？蛇x標(biāo)記基因的例子包括二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。關(guān)于編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸，任何一種都可以單獨(dú)整合到表達(dá)載體上，并且以組合的某些可以整合到一種表達(dá)載體上。此外，一種或多種核酸可以連同一種或多種重編程基因一起整合到一種表達(dá)載體上。在上述程序中，當(dāng)本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子和重編程因子的基因組合整合到一種表達(dá)載體時(shí)，這些基因可以優(yōu)選經(jīng)由使得多順?lè)醋颖磉_(dá)成為可能的序列整合到表達(dá)載體內(nèi)。使用使得多順?lè)醋颖磉_(dá)成為可能的序列使得能夠更有效地表達(dá)在一種表達(dá)載體中整合的多種基因。使得多順?lè)醋颖磉_(dá)成為可能的有用序列包括例如口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO:9 ；PLoS ONE 3，e2532，2008，Stem Cells 25，1707，2007)、IRES 序列(美國(guó)專利號(hào)4，937，190)等，其中優(yōu)先給予2A序列。包含編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸的表達(dá)載體可以根據(jù)載體的選擇通過(guò)本身已知的技術(shù)引入細(xì)胞內(nèi)。在病毒載體的情況下，例如，將含有核酸的質(zhì)粒引入合適的包裝細(xì)胞(例如Plat-E細(xì)胞)或補(bǔ)充細(xì)胞系(例如293細(xì)胞)內(nèi)，將在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的病毒載體回收，并且通過(guò)適合于病毒載體的方法將載體感染至細(xì)胞。例如，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特定方法公開(kāi)于W02007/69666，6fe77，126,663-676 (2006)和Cell，131,861-872(2007)中。使用慢病毒載體的特定方法公開(kāi)于1917-1920 (2007)中。當(dāng)iPS細(xì)胞用作細(xì)胞來(lái)源用于再生醫(yī)學(xué)時(shí)，本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的表達(dá)(再激活)或其中外源基因潛在整合的位點(diǎn)附近存在的內(nèi)源基因的激活，增加由iPS細(xì)胞衍生的分化細(xì)胞再生的組織中癌發(fā)生的危險(xiǎn)。因此，編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸優(yōu)選是瞬時(shí)表達(dá)的，而不整合到細(xì)胞的染色體內(nèi)。從這個(gè)觀點(diǎn)來(lái)看，其整合到染色體內(nèi)是罕見(jiàn)的腺病毒載體的使用是優(yōu)選的。使用腺病毒載體的特定方法在^,945-949(2008)中描述。因?yàn)橄侔殡S病毒載體在整合到染色體內(nèi)的頻率中也是低的，并且就細(xì)胞毒性和炎癥可誘導(dǎo)性而言低于腺病毒載體，所以它可以作為另一種優(yōu)選載 體提及。因?yàn)橄膳_(tái)病毒載體能夠穩(wěn)定存在于染色體外，并且可以根據(jù)需要使用SiRNA降解且去除，所以它也是優(yōu)選利用的。關(guān)于仙臺(tái)病毒載體，可以使用7； Biol. Chem. ,282,27383-27391 (2007) ,/￥oc. Jpn. Acad.，Ser. S 滯，348-362 (2009)或 JP-B-3602058 中描述的那種。當(dāng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體時(shí)，即使轉(zhuǎn)基因的沉默已發(fā)生，它也可能變得再激活。因此，例如，可以優(yōu)選使用當(dāng)變得不需要時(shí)，其中編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸使用Cre-IoxP系統(tǒng)切掉的方法。即，具有預(yù)先安排在核酸兩個(gè)末端上的IoxP序列，將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)，其后使用質(zhì)粒載體或腺病毒載體允許Cre重組酶作用于細(xì)胞，并且可以切掉由IoxP序列夾心的區(qū)域。因?yàn)長(zhǎng)TR U3區(qū)域的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列可能通過(guò)插入突變上調(diào)其附近的宿主基因，所以更優(yōu)選避免通過(guò)基因組中剩余的IoxP序列外的LTR的內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)節(jié)而不是切掉，使用通過(guò)缺失該序列制備的3’自滅活的(SIN)LTR，或用例如SV40的多腺苷酸化序列代替該序列。使用Cre-IoxP序列和SIN LTR的特定方法公開(kāi)于Soldner 等人，CWA 964-977 (2009)，Chang 等人，汾e Cells,27\ 1042-1049(2009)
由
寸T O同時(shí)，作為非病毒載體，質(zhì)粒載體可以使用脂轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法、基因槍法等轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。使用質(zhì)粒作為載體的特定方法在例如Science，322,949-953 (2008)等中描述。當(dāng)使用質(zhì)粒載體、腺病毒載體等時(shí)，轉(zhuǎn)染可以執(zhí)行一次或多次任選選擇的次數(shù)(例如一次至10次、或一次至5次等)。當(dāng)將兩個(gè)或更多個(gè)種類的表達(dá)載體引入體細(xì)胞內(nèi)時(shí)，優(yōu)選將這些所有種類的表達(dá)載體同時(shí)引入體細(xì)胞內(nèi)；然而，即使在這種情況下，轉(zhuǎn)染也可以執(zhí)行一次或多次任選選擇的次數(shù)(例如一次至10次、一次至5次等)，優(yōu)選轉(zhuǎn)染可以重復(fù)執(zhí)行兩次或更多次(例如3次或4次)。此外，當(dāng)使用腺病毒或質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)基因可以整合到染色體內(nèi)；因此，最終需要通過(guò)DNA印跡或PCR證實(shí)基因插入染色體內(nèi)的不存在。為此，如同上述Cre-IoxP系統(tǒng)，使用其中轉(zhuǎn)基因整合到染色體內(nèi)的方法可以是有利的，其后去除基因。在另一個(gè)優(yōu)選模式的實(shí)施方案中，可以使用其中轉(zhuǎn)基因使用轉(zhuǎn)座子整合到染色體內(nèi)的方法，其后使用質(zhì)粒載體或腺病毒載體允許轉(zhuǎn)座酶作用于細(xì)胞，以便從染色體中完全消除轉(zhuǎn)基因。作為優(yōu)選轉(zhuǎn)座子的例子，可以提及piggyBac,衍生自鱗翅目昆蟲的轉(zhuǎn)座子等。使用piggyBac轉(zhuǎn)座子的特定方法公開(kāi)于 Kaji, K.等)k. Nature，458·. 771-775 (2009), Wolt jen 等人，yfeitfre，766-770(2009)中。另一種優(yōu)選的非整合型載體是附加型載體，其能夠在染色體外自復(fù)制。使用附加型載體的特定方法公開(kāi)于Yu等K’Science’ 324, 797-801 (2009)中。需要時(shí)，通過(guò)將編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸插入具有IoxP序列的附加型載體內(nèi)可以構(gòu)建表達(dá)載體，所述IoxP序列以相同方向置于對(duì)于附加型載體復(fù)制必需的載體組成成分的5’和3’側(cè)上，并且這可以轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞。
附加型載體的例子包括包含對(duì)于自復(fù)制所需的衍生自EBV、SV40等的序列作為載體組分的載體。對(duì)于自復(fù)制所需的載體組分通過(guò)復(fù)制起點(diǎn)和編碼結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)以控制復(fù)制的蛋白質(zhì)的基因具體例示；例子包括用于EBV的復(fù)制起點(diǎn)oriP和EBNA-I基因、和用于SV40的復(fù)制起點(diǎn)ori和SV40大T抗原基因。附加型表達(dá)載體含有控制編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。使用的啟動(dòng)子可以是如上所述的。需要時(shí)，附加型表達(dá)載體可以進(jìn)一步含有如上所述的增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、選擇標(biāo)記基因等。選擇標(biāo)記基因的例子包括二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因等。除噬菌體Pl衍生的野生型IoxP序列(SEQ ID NO: 10)夕卜，在本發(fā)明中有用的IoxP序列包括，當(dāng)以相同方向置于側(cè)接對(duì)于轉(zhuǎn)基因復(fù)制所需的載體組分的位置上時(shí)，能夠通過(guò)重組缺失側(cè)面為IoxP序列的序列的任選選擇的突變型IoxP序列。此類突變型IoxP序列的例子包括在5’重復(fù)中突變的lox71(SEQ ID N0:11)、在3’重復(fù)中突變的lox66 (SEQ IDNO: 12)、以及在間隔物部分中突變的lOX2272和1οχ511。盡管置于載體組分的5’和3’側(cè)上的兩個(gè)IoxP序列可以是等同或不等同的，但在間隔物部分中突變的兩個(gè)突變型IoxP序列必須是等同的(例如一對(duì)loX2272序列、一對(duì)1οχ511序列)。優(yōu)先給予在5’重復(fù)中突變的突變型IoxP序列(例如1οχ71)、和在3’重復(fù)中突變的突變型IoxP序列(例如1οχ66)的組合。在這種情況下，由于重組在染色體上剩余的IoxP序列具有在5’側(cè)和3’側(cè)上在重復(fù)中的雙重突變，并且因此不太可能由Cre重組酶識(shí)別，從而減少由于不需要的重組引起染色體中的缺失突變的危險(xiǎn)。當(dāng)突變型IoxP序列1οχ71和1οχ66組合使用時(shí)，各自可以置于上述載體組分的5’和3’側(cè)的任何上，但突變型IoxP序列以這樣的方向插入，從而使得突變位點(diǎn)將位于各自IoxP序列的外部末端是必需的。兩個(gè)IoxP序列各自以相同方向置于對(duì)于轉(zhuǎn)基因復(fù)制必需的載體組成成分(即復(fù)制起點(diǎn)、或編碼結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)以控制復(fù)制的蛋白質(zhì)的基因序列)的5’和3’側(cè)上。側(cè)面為IoxP序列的載體組成成分可以是復(fù)制起點(diǎn)、或編碼結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)以控制復(fù)制的蛋白質(zhì)的基因序列、或兩者。附加型載體可以使用脂轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法、基因槍法等引入細(xì)胞內(nèi)。具體地，例如，可以使用在797-801(2009)中和其他地方描述的方法。
對(duì)于轉(zhuǎn)基因復(fù)制所需的載體組分是否已從iPS細(xì)胞中去除可以通過(guò)執(zhí)行DNA印跡分析或PCR分析加以證實(shí)，使用包含在載體組分中和/或在IoxP序列附近的核苷酸序列的核酸作為探針或引物，用從iPS細(xì)胞中分離的附加體部分作為模板，且測(cè)定條帶的存在或不存在或所檢測(cè)條帶的長(zhǎng)度。附加體部分可以通過(guò)本領(lǐng)域顯而易見(jiàn)的方法進(jìn)行制備；例如，可以使用在797-801(2009)中和其他地方描述的方法。(C)核重編程物質(zhì)
在本發(fā)明中，“核重編程物質(zhì)”指當(dāng)轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞時(shí)，或當(dāng)連同本發(fā)明的建立效率改善因子[(I)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，和(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)]一起與體細(xì)胞接觸時(shí)，能夠誘導(dǎo)由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的任何一種或多種物質(zhì)，其可以由任何物質(zhì)例如蛋白質(zhì)因子或編碼其的核酸(包括整合到載體中的形式)、或低分子化合物組成。作為其為蛋白質(zhì)因子或編碼其的核酸的已知核重編程物質(zhì)，例如，下述組合是優(yōu)選的(下文，僅顯示關(guān)于蛋白質(zhì)因子的名稱)。(I) 0ct3/4> Klf4> c-Myc
(2)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2(Sox2可替換為 Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7 或 Soxl8 ；Klf4可替換為Klfl、Klf2或Klf5 ;c-Myc可替換為T58A (活性突變體)或L-Myc)
(3)0ct3/4、Klf4> c-Myc> Sox2、Fbxl5、Nanog、ERas> TclI
(4)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40 大 T 抗原(下文 SV40LT)
(5)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT, HPV16 E6
(6)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT, HPV16 E7
(7)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16E6、HPV16 E7
(8)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT, Bmil
[對(duì)于關(guān)于上文所示因子的更多信息，參見(jiàn)WO 2007/069666 (對(duì)于關(guān)于在上文的組合
(2)中 Sox2 替換為 Soxl8 和 Klf4 替換為 Klfl 或Klf5 的信息,參見(jiàn)Tfeiare Biotechnology,26,101-106(2008));對(duì)于組合 “0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2”，還參 β Cell, 126,663-676(2006)，Cell, 2J2,861-872 (2007)等;對(duì)于組合 “0ct3/4、Klf2 (或 Klf5)、c-Myc,Sox2”，還參見(jiàn)艙i. Cell Biol. ,77,197-203(2009);對(duì)于組合“0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2、hTERT、SV40 LT ”，還參見(jiàn)艙141-146(2008).]
(9)0ct3/4、Klf4、Sox2 (參% Nature Biotechnology, 26,101-106 (2008))
(10)0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28 (參見(jiàn) Science, 318,1917-1920 (2007))
(11)0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT(參見(jiàn) Stem Ce I Is,26,1998-2005(2008))
(12)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28(SMCW7Research 7^(2008)600-603)
(13)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT (參見(jiàn) Stem Ce I Is, 26,1998-2005 (2008))
(14)0ct3/4、Klf4(參I Nature 454: 646-650 (2008) , Cell Stem Cell, 2,525-528(2008)))
(15)0ct3/4、c-Myc(參見(jiàn)艙iare 必￥: 646-650 (2008))
(16)0ct3/4、Sox2(參見(jiàn)艙141-146(2008)，W02008/118820)
(17)0ct3/4、Sox2、Nanog (參見(jiàn) W02008/118820)
(18)0ct3/4、Sox2、Lin28 (參見(jiàn) W02008/118820)(19)Oct3/4> Sox2、c-Myc> Esrrb (此處，Esrrb 可以用 Essrrg 代替，參見(jiàn)yfei· CellBiol.，77，197-203(2009))
(20)Oct3/4、Sox2、Esrrb (參見(jiàn)艙i. Cell Biol. , 77,197-203 (2009))
(21)Oct3/4、Klf4、L-Myc(參見(jiàn) /"roc. Natl. Acad. Sci. USA., 107(32),14152-14157(2010))
(22)0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc, Lin28 (參見(jiàn) W02011/016588)
(23)0ct3/4、Nanog
(24)0ct3/4(^77136 \ 411-419 (2009)、08436，在線公開(kāi)的doi:10. 1038(2009)
(25)0ct3/4、Klf4、c-Myc,Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT (參見(jiàn) Science，324·.797-801(2009))
在上文的(1)-(25)中，0ct3/4可以替換為Oct家族的另一個(gè)成員，例如OctlA、0ct6等。Sox2(或Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7、Soxl8)可以替換為Sox家族的另一個(gè)成員，例如Sox7等。此外，假設(shè)c-Myc或Lin28包括在上文的組合(1)-(25)中作為核重編程物質(zhì)，L-Myc或Lin28B可以分別代替c_Myc或Lin28使用。當(dāng)上文的因子(1)-(25)的組合包括Klf家族的成員時(shí)，與本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子組合使用的“核重編程物質(zhì)”適當(dāng)?shù)厥呛谐齂lf家族的這些成員外的因子的那種。當(dāng)上文的組合(1)-(25)不包括Klf家族的成員時(shí)，與本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子組合使用的核重編程物質(zhì)可以是因子的組合。除上述核重編程物質(zhì)外，進(jìn)一步包含另一種任選選擇的物質(zhì)的組合也適當(dāng)?shù)赜米鞅景l(fā)明中的“核重編程物質(zhì)”。假設(shè)經(jīng)歷核重編程的體細(xì)胞以足以引起核重編程的水平內(nèi)源表達(dá)上文的(1)-(25)中任何一個(gè)的組成成分中的一種或多種，除去一種或多種組成成分的僅剩余組成成分的組合也可以包括在本發(fā)明中的“核重編程物質(zhì)”的范圍中。在這些組合中，例如選自O(shè)ct家族的成員、Sox家族的成員、Myc家族的成員、Lin28家族的成員和Nanog中的一種或多種物質(zhì)是優(yōu)選的核重編程物質(zhì)，其中更大的優(yōu)先給予0ct3/4 和 Sox2 的組合，0ct3/4、Sox2 和 c_Myc 的組合，0ct3/4、Sox2 和 L-Myc 的組合，或0ct3/4、Sox2、L-Myc 和 Lin28 的組合。雖然促進(jìn)iPS細(xì)胞的建立，但c-Myc還促進(jìn)非iPS轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(部分重編程的細(xì)胞、無(wú)能(nullipotent)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的生成。本發(fā)明人不僅證實(shí)共表達(dá)GLISl與0ct3/4、Sox2和Klf4顯著促進(jìn)來(lái)自小鼠和人成年皮膚成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞建立，還揭示與c-Myc不同，GLISl不促進(jìn)非iPS轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的上述發(fā)生。因此，特別優(yōu)選使用GLISl而不使用O-Myc0關(guān)于上述每種蛋白質(zhì)因子的小鼠和人cDNA序列的信息根據(jù)WO 2007/069666 (在該出版物中，Nanog描述為ECAT4。關(guān)于Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg和L-Myc的小鼠和人cDNA序列信息可以分別通過(guò)參考下述NCBI登記號(hào)獲得)中提及的NCBI登記號(hào)可獲得；本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地分離這些cDNAs。 基因名稱小鼠人 Lin28 NM_145833 NM_024674 Lin28b NM_001031772 NM_001004317EsrrbNM_011934NM_004452
EsrrgNM_011935NM_001438
L-MycNM_008506NM_00103308I。用于作為核重編程物質(zhì)使用的蛋白質(zhì)因子可以通過(guò)下述進(jìn)行制備將所獲得的cDNA插入合適的表達(dá)載體內(nèi)，將載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)，且從培養(yǎng)細(xì)胞或其條件化培養(yǎng)基中回收重組蛋白質(zhì)因子。同時(shí)，當(dāng)編碼蛋白質(zhì)因子的核酸用作核重編程物質(zhì)時(shí)，將所獲得的cDNA插入病毒載體、附加型載體或質(zhì)粒載體內(nèi)，其方式與本發(fā)明的基于核酸的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的上述情況相同，以構(gòu)建對(duì)其實(shí)施核重編程步驟的表達(dá)載體。需要時(shí)，也可以利用上述Cre-IoxP系統(tǒng)或piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。當(dāng)編碼兩種或更多種蛋白質(zhì)因子的兩種或更多種核酸作為核重編程物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞時(shí)，不同的核酸可以通過(guò)分開(kāi)的載體攜帶，或多個(gè)核酸可以串聯(lián)連接以獲得多順?lè)醋虞d體。在后面一種情況下，為了允許有效的多順?lè)醋颖磉_(dá)，希望將口蹄疫病毒的2A自切割肽插入核酸之間(參見(jiàn)例如，Science, 322,949-953,2008)。 當(dāng)物質(zhì)是蛋白質(zhì)因子時(shí)，核重編程物質(zhì)與體細(xì)胞的接觸可以(a)以與本發(fā)明的上述蛋白質(zhì)iPS細(xì)胞建立效率改善因子相同的方式達(dá)到，或當(dāng)物質(zhì)是編碼蛋白質(zhì)因子的核酸時(shí)，(b)以與本發(fā)明的上述基于核酸的iPS細(xì)胞建立效率改善因子相同的方式達(dá)到。(c)當(dāng)核重編程物質(zhì)是低分子化合物時(shí)，與體細(xì)胞的接觸可以通過(guò)下述來(lái)達(dá)到將低分子化合物以合適濃度溶解于水性或非水溶劑中，將溶液加入適合于培養(yǎng)從人或其他哺乳動(dòng)物中分離的體細(xì)胞的培養(yǎng)基[含有約5 - 20%胎牛血清(FCS)的最小必需培養(yǎng)基(MEM)、達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI 1640培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基等]中，從而使得核重編程物質(zhì)濃度將落入足以引起體細(xì)胞中的核重編程且不引起細(xì)胞毒性的范圍中，且將細(xì)胞培養(yǎng)給定時(shí)期。核重編程物質(zhì)濃度取決于使用的核重編程物質(zhì)種類而改變，并且適當(dāng)?shù)剡x擇在約O. InM -約100 nM的范圍上。接觸的持續(xù)時(shí)間并無(wú)特別限制，只要它足以引起細(xì)胞的核重編程；通常，核重編程物質(zhì)可以允許共存在于培養(yǎng)基中，直至陽(yáng)性集落出現(xiàn)。(d)其他iPS細(xì)胞津立效率改講劑
近年來(lái)，改善常規(guī)低的iPS細(xì)胞建立效率的多種物質(zhì)已相繼提出。當(dāng)連同本發(fā)明的上述iPS細(xì)胞建立效率改善因子一起與體細(xì)胞接觸時(shí)，其他iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑預(yù)期進(jìn)一步升高iPS細(xì)胞建立效率。其他iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑的例子包括但不限于，除了 VPA外的組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑[例如低分子抑制劑例如曲古抑菌素A(TSA)、丁酸鈉、MC 1293和M344，基于核酸的表達(dá)抑制劑例如針對(duì)HDAC的siRNAs和shRNAs (例如HDACI siRNASmartpooI (Millipore)、針對(duì) HDACl 的 HuSH 29 聚體 shRNA 構(gòu)建體(OriGene)等)等]，蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[例如5’ -氮雜胞苷(5’ -azaC) [Nat. Biotechnol. r26{l):795-797(2008)]，G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[例如低分子抑制劑例如BIX-01294 (CW7Stem Cell, 2·. 525-528 (2008))、基于核酸的表達(dá)抑制劑例如針對(duì)G9a的siRNAs和shRNAs [例如 G9a siRNA (人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等]，L-通道 |丐激動(dòng)劑(例如 Bayk8644) [Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008) ]，p53 抑制劑[例如針對(duì) p53的 siRNA、shRNA、顯性失活突變體等{Cell Stem J, 475-479 (2008)) ；Nature 460，1132-1135 (2009)) ]，Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)激活物(例如可溶性 Wnt3a) [Cell Stem Cell, 3,132-135 (2008) ]，2i/LIF [2i是絲裂原激活蛋白質(zhì)激酶信號(hào)傳導(dǎo)和糖原合酶激酶_3的抑制劑，PloS Biology, 6 (10)，2237-2247 (2008) ]，ES 細(xì)胞特異性 miRNA[例如 miR-302-367徽(Mol. Cell. Biol. doi:10. 1128/MCB. 00398-08) ；miR-302 W (2008) 14: I - 10)；miR-291-3p、miR-294 和 miR-295 0Vat Biotechnol. 27: 459-461 (2009)]等。如上所述，基于核酸的表達(dá)抑制劑可以是容納編碼siRNA或shRNA的DNA的表達(dá)載體的形式。在核重編程物質(zhì)的上述組成成分中，例如SV40大T也可以包括在iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑的范圍中，因?yàn)樗鼈兪菍?duì)于體細(xì)胞的核重編程非必需的輔助因子。雖然核重編程的機(jī)制仍不明了，但除對(duì)于核重編程必需的因子外，輔助因子視為核重編程物質(zhì)還是iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑無(wú)關(guān)緊要。因此，因?yàn)轶w細(xì)胞核重編程過(guò)程視為起因于核重編程物質(zhì)和iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑與體細(xì)胞接觸的總體事件，所以它看起來(lái)不一定是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員區(qū)分兩者必需的。當(dāng)改進(jìn)劑分別是(a)蛋白質(zhì)因子、(b)編碼蛋白質(zhì)因子的核酸、或(C)低分子化合物時(shí)，iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑與體細(xì)胞的接觸可以以與本發(fā)明的上述iPS細(xì)胞建立效率改善因子和核重編程物質(zhì)相同的方式來(lái)達(dá)到。 iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑包括本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子可以與核重編程物質(zhì)同時(shí)與體細(xì)胞接觸，并且任何一種可以預(yù)先接觸，只要與在不存在該物質(zhì)的情況下獲得的效率相比較，來(lái)自體細(xì)胞的iPS細(xì)胞建立效率顯著改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，當(dāng)核重編程物質(zhì)是編碼蛋白質(zhì)因子的核酸并且iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑是化學(xué)抑制劑時(shí)，在基因轉(zhuǎn)移處理后將細(xì)胞培養(yǎng)給定時(shí)間長(zhǎng)度后，iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑可以加入培養(yǎng)基中，因?yàn)楹酥鼐幊涛镔|(zhì)涉及從基因轉(zhuǎn)移處理到蛋白質(zhì)因子的大量表達(dá)的給定時(shí)滯長(zhǎng)度，而iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑能夠快速作用于細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核重編程物質(zhì)和iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑都以病毒或質(zhì)粒載體的形式使用時(shí)，例如，兩者可以同時(shí)引入細(xì)胞內(nèi)。(e)通過(guò)培養(yǎng)條件改善津立效率
iPS細(xì)胞建立效率可以進(jìn)一步通過(guò)在低氧條件下在用于體細(xì)胞的核重編程過(guò)程中培養(yǎng)細(xì)胞得到改善(參見(jiàn)CW7 Stem化77、5、第237-241頁(yè)(2009))。如本文提及的，術(shù)語(yǔ)“低氧條件”意指在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的環(huán)境氧濃度顯著低于大氣中的那種。特別地，可以提及涉及比在5-10% C02/95-90%空氣氣氛(其通常用于普通細(xì)胞培養(yǎng))中的環(huán)境氧濃度更低的氧濃度的條件；例子包括涉及18%或更少的環(huán)境氧濃度的條件。優(yōu)選地，環(huán)境氧濃度是15%或更少(例如14%或更少、13%或更少、12%或更少、11%或更少等)、10%或更少(例如9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少等)、或5%或更少(例如4%或更少、3%或更少、2%或更少等)。環(huán)境氧濃度優(yōu)選是O. 1%或更多(例如O. 2%或更多、O. 3%或更多、O. 4%或更多等)、
O.5%或更多(例如O. 6%或更多、O. 7%或更多、O. 8%或更多、O. 95%或更多等)、或1%或更多(例如I. 1%或更多、I. 2%或更多、I. 3%或更多、I. 4%或更多等)。盡管可以使用在細(xì)胞環(huán)境中產(chǎn)生低氧狀態(tài)的任何方法，但最容易的方法是在允許調(diào)整氧濃度的CO2溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞，并且這代表合適情況。允許調(diào)整氧濃度的CO2溫箱是從多個(gè)制造商商購(gòu)可得的(例如由 Thermo scientific, Ikemoto Scientific Technology,Juji Field, Wakenyaku制造的用于低氧培養(yǎng)的CO2溫箱等)。在低氧條件下開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間并無(wú)特別限制，只要與正常氧濃度相比較(20%)，iPS細(xì)胞建立效率未阻止得到改善。盡管培養(yǎng)可以在體細(xì)胞與本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子和核重編程物質(zhì)接觸前、或與接觸同時(shí)或在接觸后開(kāi)始，但優(yōu)選例如在低氧條件下的培養(yǎng)正好在體細(xì)胞與本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子和核重編程物質(zhì)接觸后、或在接觸后的給定時(shí)間間隔[例如I - 10(例如2、3、4、5、6、7、8或9)天]后開(kāi)始。在低氧條件下細(xì)胞培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間并無(wú)特別限制，只要與正常氧濃度相比較(20%)，iPS細(xì)胞建立效率未阻止得到改善；例子包括但不限于3天或更多、5天或更多、7天或更多或10天或更多、和50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少等的時(shí)期。在低氧條件下優(yōu)選的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間取決于環(huán)境氧濃度而改變；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)使用的氧濃度適當(dāng)?shù)卣{(diào)整培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如果iPS細(xì)胞候選集落用藥物抗性作為指數(shù)進(jìn)行選擇，那么優(yōu)選在開(kāi)始藥物選擇前從低氧條件恢復(fù)正常氧濃度。此外，用于在低氧條件下的細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)選開(kāi)始時(shí)間和優(yōu)選培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間還取決于使用的核重編程物質(zhì)的選擇、在正常氧濃度下的iPS細(xì)胞建立效率等而改變。
(f)iPS細(xì)胞的選擇和鑒定
在與本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子和核重編程物質(zhì)(和另一種iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑)接觸前，細(xì)胞可以例如在適合于培養(yǎng)ES細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在小鼠細(xì)胞的情況下，用作為分化抑制因子的白血病抑制因子(LIF)加入普通培養(yǎng)基執(zhí)行培養(yǎng)。同時(shí)，在人細(xì)胞的情況下，希望堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(LIF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)代替LIF加入。通常，細(xì)胞在作為飼養(yǎng)細(xì)胞、用放射或抗生素處理以終止細(xì)胞分裂的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的共存下培養(yǎng)。通常，STO細(xì)胞等通常用作MEFs，但對(duì)于誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，通常使用 SNL 細(xì)胞[McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073 - 1085(1990)]等。與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)可以在與本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子和核重編程物質(zhì)接觸前、在接觸時(shí)或在接觸后(例如1-10天后)開(kāi)始。iPS細(xì)胞的候選集落可以通過(guò)用藥物抗性和報(bào)道分子活性作為指示劑的方法，并且還通過(guò)基于形態(tài)學(xué)的肉眼檢測(cè)的方法進(jìn)行選擇。作為前者的例子，使用重組細(xì)胞選擇對(duì)于藥物抗性和/或報(bào)道分子活性陽(yáng)性的集落，其中藥物抗性基因和/或報(bào)道基因靶向在多能細(xì)胞中特異性高度表達(dá)的基因的基因座(例如Fbxl5、Nanog、0ct3/4等，優(yōu)選Nanog或0ct3/4)。作為此類重組細(xì)胞的例子，可以提及其中β geo (其編碼β -半乳糖苷酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白)基因敲入Fbxl5基因基因座中的小鼠衍生的MEF和TTF (Takahashi & Yamanaka, 7激，663-676 (2006))，或其中綠色熒光蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog基因基因座中的轉(zhuǎn)基因小鼠衍生的MEF和TTF (Okita等人，tore，《S，313-317 (2007))等。同時(shí)，通過(guò)形態(tài)學(xué)的肉眼檢查用于選擇候選集落的方法包括例如由Takahashi等人在7J7，861-872 (2007)中描述的方法。盡管使用報(bào)道細(xì)胞的方法是方便和有效的，但當(dāng)iPS細(xì)胞制備用于人治療的目的時(shí)，通過(guò)肉眼檢查的集落選擇從安全性觀點(diǎn)來(lái)看是希望的。所選集落的細(xì)胞作為iPS細(xì)胞的鑒定可以如上所述通過(guò)對(duì)于Nanog(或0ct3/4)報(bào)道分子的陽(yáng)性應(yīng)答(嘌呤霉素抗性、GFP陽(yáng)性等)，以及通過(guò)可見(jiàn)ES細(xì)胞樣集落的形成加以證實(shí)；然而，為了增加準(zhǔn)確度，可以執(zhí)行測(cè)試?yán)鐗A性磷酸酶染色，分析多種ES細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，和將所選細(xì)胞轉(zhuǎn)移至小鼠且證實(shí)畸胎瘤形成。
當(dāng)編碼本發(fā)明的iPS細(xì)胞建立效率改善因子的核酸轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞時(shí)，所獲得的iPS細(xì)胞是不同于常規(guī)已知iPS細(xì)胞的新細(xì)胞，因?yàn)樵谄渲泻型庠春怂?。特別地，如果當(dāng)外源核酸使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞，那么外源核酸通常整合到所獲得的iPS細(xì)胞的基因組中，從而使得含有外源核酸的特征穩(wěn)定保留。(r)關(guān)于iPS細(xì)胞的使用應(yīng)用
因此建立的iPS細(xì)胞可以用于多種目的。例如，通過(guò)利用就多能干細(xì)胞例如ES細(xì)胞而言報(bào)道的分化誘導(dǎo)的方法(例如分化誘導(dǎo)的方法包括對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞在JP-A-2002-291469中描述的方法，對(duì)于胰腺干樣細(xì)胞在JP-A-2004-121165中描述的方法，和對(duì)于造血細(xì)胞在JP-T-2003-505006中描述的方法；通過(guò)胚狀體形成的分化誘導(dǎo)的方法包括在JP-T-2003-523766中描述的方法)，可以由iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化成多種細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞、血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰島素分泌細(xì)胞等)。因此，使用從相同或基本上相同的HLA類型的患者或另一個(gè)人中收集的體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞將使得通過(guò)自體移植的干細(xì)胞療法成為可能，其中iPS細(xì)胞分化成所需細(xì)胞(即，患者的受累器官的細(xì)胞，對(duì)疾病具有療效的細(xì)胞等)，將其移植給患者。此外，因?yàn)檎J(rèn)為由iPS細(xì)胞分化的功能細(xì)胞(例如肝 細(xì)胞)比相應(yīng)的現(xiàn)有細(xì)胞系更好地反映在體內(nèi)功能細(xì)胞的實(shí)際狀態(tài)，所以它們還可以適當(dāng)?shù)赜糜隗w外篩選藥物候選化合物的有效性和毒性等。本發(fā)明在下文借助于下述實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述，然而，本發(fā)明決不限于下述實(shí)施例。
實(shí)施例參考實(shí)施例I :篩選新重編程因子
通過(guò)圖I中所示的方法，廣泛人基因的約20000個(gè)克隆基于由Goshima等人生成的人Gateway 入門克隆進(jìn)行排序(使用由N. Goshima等人在艙iare eiAoofe, 2008中描述的文庫(kù)；由Y. Maruyama等人在Acid Res. , 2009中公開(kāi)的數(shù)據(jù)庫(kù))。具體地，針對(duì)用NCBI RefSeq登記的37900個(gè)序列(24200種基因)，對(duì)人Gateway 入門克隆中的含有全長(zhǎng)ORF的約50000個(gè)克隆實(shí)施BLASTP搜索，其中標(biāo)準(zhǔn)是80%或更多的覆蓋度和95%或更多的氨基酸同一性。因此構(gòu)建由不涉及N類型和F類型各自中的序列重疊的約20000個(gè)入門克隆組成的子文庫(kù)，所述N類型具有其在3’末端上的終止密碼子，所述F類型缺乏終止密碼子。這些約20000個(gè)排序的入門克隆通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分類成蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子、GPCRs及其他克??；構(gòu)建由轉(zhuǎn)錄因子的入門克隆組成的子文庫(kù)(覆蓋超過(guò)50%的所有人轉(zhuǎn)錄因子)(圖I)。如圖2中所示，通過(guò)與pMXs-GW目的載體的LR反應(yīng)對(duì)于來(lái)自轉(zhuǎn)錄因子的這個(gè)子文庫(kù)的每個(gè)入門克隆制備表達(dá)克隆DNA。將這種反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至大腸埃希桿菌(Escherichia coli)DH5 α，隨后將其克隆以構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)文庫(kù)(用于重編程因子篩選的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)文庫(kù))。人0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因各自也整合到相同PMXs-Gff內(nèi)，以構(gòu)建各自的表達(dá)克隆。由這種DNA生成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒且用于下述實(shí)驗(yàn)中。使用來(lái)自Nanog-GFP 小鼠[Okita 等k,Nature, 448, 313-317 (2007)]的表皮成纖維細(xì)胞執(zhí)行誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)使用兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行涉及在用作飼養(yǎng)細(xì)胞的MSTO上的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的系統(tǒng)(用絲裂霉素C處理以終止其細(xì)胞分裂的SNL細(xì)胞)[下文MSTO法，CWA 2激，663-676(2006)]，和涉及感染而不使用飼養(yǎng)細(xì)胞，隨后為細(xì)胞再種植和在MSTO上的后續(xù)培養(yǎng)的系統(tǒng)[下文Reseed法，艙tore Biotech.，26，第101-106頁(yè)(2008)]。對(duì)于第一次篩選，使用24孔板誘導(dǎo)iPS細(xì)胞。將Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞種植到明膠(Reseed法)或MSTO(MSTC^i)上。第二天，將成纖維細(xì)胞用由多種質(zhì)粒制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(第O天)。具體地，將成纖維細(xì)胞用三種基因0ct3/4、SoX2和c-Myc和選自上述轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)的一種基因以1:1:1:1的比感染。對(duì)于陰性對(duì)照，將成纖維細(xì)胞用三種基因0ct3/4、Sox2和c-Myc以1:1:1的比感染。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，將成纖維細(xì)胞用四種基因 0ct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 以 1:1:1:1 的比感染。將成纖維細(xì)胞用10% FBS/DMEM培養(yǎng)直至在感染后第2天，并且在第3天和以后用ES培養(yǎng)基[Cell, 126，663-676 (2006)]培養(yǎng)。當(dāng)成纖維細(xì)胞最初種植到明膠(Reseed法)上時(shí)，在第3天時(shí)將它們?cè)俜N植到MSTO上。其后，在每?jī)商鞂⑴囵B(yǎng)基替換為相同培養(yǎng)基的新鮮供應(yīng)的同時(shí)，在第21天時(shí)開(kāi)始嘌呤霉素選擇，并且在第28天時(shí)檢查細(xì)胞。因此，GFP陽(yáng)性集落在摻入連同三種基因一起轉(zhuǎn)移的每種基因[樣品F09 (基因密碼名稱IRX6)、樣品G06 (基因密碼名稱GLIS1)、樣品H08 (基因密碼名稱DMRTB1)、和樣品HlO (基因密碼名稱PITX2)]的孔中出現(xiàn)，證實(shí)小鼠iPS細(xì)胞的建立。當(dāng)再次使用6孔板嘗試iPS誘 導(dǎo)時(shí)，GFP陽(yáng)性集落同樣出現(xiàn)；獲得再現(xiàn)性。在集落形成和第一代和第二代時(shí)獲得的GFP陽(yáng)性iPS細(xì)胞集落的照片圖像和相位差圖像顯示于圖3和4中。這些結(jié)果證實(shí)這四種因子作為能夠代替Klf4的新重編程因子的鑒定。當(dāng)使用MEF (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)或HDF (人表皮成纖維細(xì)胞)代替成年小鼠皮膚成纖維細(xì)胞執(zhí)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)，同樣建立iPS細(xì)胞(GFP陽(yáng)性集落)。參考實(shí)施例2 :建立的小鼠iPS細(xì)胞的分析
使用 Gentra Puregene Cell Kit (QIAGEN)提取基因組，并且使用 PCR 酶(Takara ExTaq)和在參考實(shí)施例I中建立的iPS細(xì)胞執(zhí)行基因組-PCR。結(jié)果顯示于圖5和6中。在建立的所有iPS細(xì)胞中，證實(shí)在基因組上僅轉(zhuǎn)基因的存在和在基因組上其他基因的不存在。對(duì)于G6-1克隆(基因密碼名稱GLIS1)，用于轉(zhuǎn)移的c-Myc不插入基因組上(圖5)。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體直到插入基因組上才穩(wěn)定表達(dá)，所以認(rèn)為這個(gè)克隆G6-1已建立，具有僅三種因子0ct3/4、Sox2和GLISl的表達(dá)。接下來(lái)，使用Rever Tra Ace試劑盒(Takara)執(zhí)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示于圖7和8中。在參考實(shí)施例I中建立的所有iPS細(xì)胞表達(dá)ES細(xì)胞特異性標(biāo)記基因Nanog、0ct3/4,Sox2,Rexl和ECATl。這些結(jié)果證實(shí)使用新重編程因子建立的細(xì)胞作為iPS細(xì)胞的鑒定。實(shí)施例I:用組合使用的G6和Klf4建立小鼠iPS細(xì)胞
(a)組合使用的G6和Klf4對(duì)小鼠iPS細(xì)胞的建立效率的作用
進(jìn)行研究以測(cè)定當(dāng)使用與Klf4組合的在參考實(shí)施例I中鑒定的G6(基因密碼名稱GLIS1)、H8(基因密碼名稱:DMRTB1)和HlO (基因密碼名稱:PITX2)(其為能夠代替Klf4的新重編程因子)時(shí)，iPS細(xì)胞是否可以建立。使用如參考實(shí)施例I中的Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞通過(guò)Reseed法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用于基因轉(zhuǎn)移的基因的組合顯示于下文。(I) 0ct3/4、Sox2
(2)0ct3/4、Sox2、G6(基因密碼名稱GLIS1)
(3)0ct3/4、Sox2、H8(基因密碼名稱:DMRTBI)(4)0ct3/4、Sox2、H10(基因密碼名稱PITX2)
(5)0ct3/4、Sox2、Klf4
(6)0ct3/4、Sox2、Klf4、G6
(7)0ct3/4、Sox2、Klf4、H8
(8)Oct3/4、Sox2、Klf4、H10。通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMXs-0ct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-G6、pMXs-H8、pMXs-ΗΙΟ)分開(kāi)轉(zhuǎn)移至 Plat-E 細(xì)胞(Morita，S.等人，Gene Ther. 7,1063-1066)制備用于重編程的逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述Plat-E細(xì)胞在前一天已經(jīng)以2. 5 X IO6細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)皿(Falcon)種植。使用的培養(yǎng)肉湯是DMEM/10% FCS [補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM(Nacalaitesque)，并且細(xì)胞在37°C、5% CO2下培養(yǎng)。
為了促進(jìn)載體轉(zhuǎn)移，將27 μ L FuGene6轉(zhuǎn)染試劑置于300 μ L Opti-MEM IReduced-Serum Medium(Invitrogen)中，并且允許細(xì)胞在室溫靜置5分鐘。隨后，加入9μ g每種表達(dá)載體，并且允許細(xì)胞在室溫進(jìn)一步靜置15分鐘，這之后將它們加入Plat-E培養(yǎng)肉湯中。在第2天時(shí)，將Plat-E上清液替換為培養(yǎng)基的新鮮供應(yīng)。在第3天時(shí)，將培養(yǎng)上清液回收且通過(guò)O. 45 μ m無(wú)菌濾器(Whatman)過(guò)濾,并且將聚凝胺(Nacalai)以4 μ g/mL加入以獲得病毒液體。通過(guò)從小鼠背/腹部皮膚中取出真皮，并且在明膠覆蓋的皿上培養(yǎng)，獲得使用的Nanog-GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。使用的培養(yǎng)肉湯是DMEM/10% FCS，并且將成纖維細(xì)胞以8. O X IO5細(xì)胞/皿種植至100 mm皿(Falcon)，并且在37 °C、5% CO2下培養(yǎng)。第二天，將每種逆轉(zhuǎn)錄病毒液體[上文的組合(1)-(8)中的任何]加入，以通過(guò)過(guò)夜感染轉(zhuǎn)移基因。在病毒感染后第二天時(shí)，將逆轉(zhuǎn)錄病毒液體去除且替換為DMEM/10% FCS，并且使用DMEM/10% FCS培養(yǎng)細(xì)胞直至感染后第3天。在感染后第3天時(shí)，將培養(yǎng)基去除，并且通過(guò)加入10 mL PBS將細(xì)胞洗滌。在PBS去除后，將0. 25%胰蛋白酶/I mM EDTA(Invitrogen)加入，并且允許反應(yīng)在37°C進(jìn)行約5分鐘。在細(xì)胞浮起后，通過(guò)加入ES細(xì)胞培養(yǎng)基[補(bǔ)充有15%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100 μ M非必需氨基酸(Invitrogen)、100 μ M 2-疏基乙醇(Invitrogen)、50 U/mL 青霉素(Invitrogen)和 50 Ug/mL 鏈霉素(Invitrogen)的DMEM(Nacalai Tesque)]將它們懸浮,并且種植至具有先前對(duì)其種植的飼養(yǎng)細(xì)胞的100 mm皿。使用的飼養(yǎng)細(xì)胞是用絲裂霉素C處理以終止其細(xì)胞分裂的SNL細(xì)胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. CW7，62，1073 - 1085 (1990)]。在每?jī)商鞂S 細(xì)胞培養(yǎng)基替換為相同培養(yǎng)基的新鮮供應(yīng)的同時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)直至可見(jiàn)集落出現(xiàn)；在感染后26 - 28天，計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性集落。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于表3和圖9中(圖9是表3中所示結(jié)果的圖示；四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果僅對(duì)于對(duì)照顯示)。"CU
權(quán)利要求
1.一種改善iPS細(xì)胞建立效率的方法，其包括使下述(I)和(2)與體細(xì)胞接觸 (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中上文的所述物質(zhì)(I)包括GLIS家族鋅指I(GLISl)或編碼GLISl的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中上文的所述物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。
4.一種iPS細(xì)胞建立效率改進(jìn)劑，其包含下述(I)和(2): (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的改進(jìn)劑，其中上文的所述物質(zhì)(I)包括GLISl或編碼GLISl的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的改進(jìn)劑，其中上文的所述物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。
7.—種產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方法，其包括使下述(I)、(2)和(3)與體細(xì)胞接觸 (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (3)通過(guò)與上文的所述物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中上文的所述物質(zhì)(I)包括GLISl或編碼GLISl的核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中上文的所述物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7- 9中任一項(xiàng)的方法，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)選自O(shè)ct家族的成員、Sox家族的成員、Myc家族的成員、Lin28家族的成員、Nanog和編碼其的核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7- 9中任一項(xiàng)的方法，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4或編碼其的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4和Sox2或編碼其的核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4、Sox2和C-Myc或編碼其的核酸。
14.一種用于從體細(xì)胞的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的試劑，其包括下述(I)、(2)和(3): (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (3)通過(guò)與上文的所述物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑，其中上文的所述物質(zhì)(I)包括GLISl或編碼GLISl的核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的試劑，其中上文的所述物質(zhì)(2)包括Klf4或編碼Klf4的核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求14- 16中任一項(xiàng)的試劑，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)選自O(shè)ct家族的成員、Sox家族的成員、Myc家族的成員、Lin28家族的成員、Nanog和編碼其的核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求14- 16中任一項(xiàng)的試劑，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4或編碼其的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4和Sox2或編碼其的核酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑，其中上文的所述核重編程物質(zhì)(3)包括0ct3/4、Sox2和C-Myc或編碼其的核酸。
21.—種iPS細(xì)胞，其包含下述⑴和⑵ (1)選自編碼GLIS家族的成員的外源核酸的一種或多種核酸， (2)選自編碼Klf家族的成員的外源核酸的一種或多種核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的iPS細(xì)胞，其中將所述外源核酸整合到基因組中。
23.—種產(chǎn)生體細(xì)胞的方法，其包括處理根據(jù)權(quán)利要求21或22的iPS細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化成體細(xì)胞。
24.一種產(chǎn)生體細(xì)胞的方法，其包括下述(I)和(2): (1)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求7- 13中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生iPS細(xì)胞的步驟，和 (2)處理通過(guò)上文的步驟(I)獲得的iPS細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化成體細(xì)胞的步驟。
25.下述(I)和(2)改善iPS細(xì)胞建立效率的用途 (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)。
26.選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)改善iPS細(xì)胞建立效率的用途，其中所述物質(zhì)連同選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)一起與體細(xì)胞接觸。
27.下述⑴、⑵和(3)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途 (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (3)通過(guò)與上文的所述物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)。
28.下述⑴和⑵產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途 (1)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)， (2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)，其中所述因子連同通過(guò)與上文的所述物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)一起與體細(xì)胞接觸。
29.(I)選自GLIS家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途，其中所述物質(zhì)連同(2)選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)、和通過(guò)與上文的所述物質(zhì)(I)和(2)組合能夠由體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的核重編程物質(zhì)一起與體細(xì)胞接觸。
30.根據(jù)權(quán)利要求21或22的iPS細(xì)胞在產(chǎn)生體細(xì)胞中的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求21或22的iPS細(xì)胞，其中所述iPS細(xì)胞充當(dāng)產(chǎn)生體細(xì)胞中的細(xì)胞來(lái) 源。
全文摘要
提供的是改善iPS細(xì)胞建立效率的方法，其包括使選自GLIS家族的成員(例如GLIS1)和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)、和選自Klf家族的成員和編碼其的核酸的一種或多種物質(zhì)與體細(xì)胞接觸的步驟，可以通過(guò)該方法獲得的、包含編碼GLIS家族的成員或Klf家族的成員的外源核酸的iPS細(xì)胞，和通過(guò)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化產(chǎn)生體細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102782122SQ201180009618
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月16日
發(fā)明者五島直樹(shù), 前川桃子, 山中伸彌, 望月宏美, 河村義史 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué), 日本生物信息協(xié)會(huì), 獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所