專利名稱：與木質(zhì)素結(jié)合降低的碳水化合物結(jié)合組件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate binding module)。更具體地，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出與木質(zhì)素結(jié)合降低的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件。 本發(fā)明還涉及包含經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶、包含編碼經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾糖苷酶的核苷酸序列的基因構(gòu)建體，以及包含經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素或半纖維素底物的用途。
背景技術(shù)：
地球上多于50%的有機碳發(fā)現(xiàn)于植物的細(xì)胞壁中。植物細(xì)胞壁主要由以下化合物組成纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。這些化合物總稱為“木質(zhì)纖維素”，它們是發(fā)酵成乙醇或其他高值產(chǎn)品的糖和其他有機分子的潛在來源。
由于纖維素乙醇在環(huán)境方面的有利且可持續(xù)的性質(zhì)，將木質(zhì)纖維素(或木質(zhì)纖維素類生物質(zhì))轉(zhuǎn)化為乙醇已成為新興能源政策的關(guān)鍵特征。針對纖維素轉(zhuǎn)化開發(fā)了數(shù)種技術(shù)。本文關(guān)注的方法是對木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)進(jìn)行增加其對水解酶的敏感性的預(yù)處理， 然后使預(yù)處理過的木質(zhì)纖維素經(jīng)酶促水解成糖并且將這些糖發(fā)酵成乙醇或其他高值的有機分子(如丁醇)。常用的預(yù)處理方法包括稀 酸蒸汽爆破(美國專利No. 4，461，648)、氨冷凍爆破(AFEX ；Holtzapple等，1991)和有機溶劑萃取(美國專利No. 4，409，032)。水解和發(fā)酵系統(tǒng)可以是分開的(順次水解和發(fā)酵；SHF)或者同時發(fā)生的(同時糖化和發(fā)酵；SSF)。 在所有情況下，半纖維素和纖維素都被分解成可發(fā)酵的糖，同時將木質(zhì)素分離并且可用作固體燃料或其他有機分子的來源。
經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的酶促水解用纖維素酶進(jìn)行。術(shù)語纖維素酶廣義上指催化纖維素聚合物中連接單個葡萄糖單元之β-1，4-糖苷鍵的水解的一類糖苷水解酶(或糖苷酶)。催化機制涉及內(nèi)切葡聚糖酶(酶學(xué)委員會編號Ε. C. 3. 2.1. 4)、纖維二糖水解酶 (E. C. 3. 2.1. 91)和β -葡糖苷酶(E. C. 3. 2.1. 21)的協(xié)同作用。內(nèi)切葡聚糖酶水解纖維素鏈中部可及的糖苷鍵，而纖維二糖水解酶從這些鏈末端逐步釋放纖維二糖。β -葡糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖，并且從而使得纖維二糖水解酶的產(chǎn)物抑制最小化。所述酶共同作為可以水解纖維素底物的系統(tǒng)來運作。
纖維素酶和水解多糖或寡糖的其他糖苷水解酶或糖苷酶通常具有相似的組件結(jié)構(gòu)，其由通過柔性接頭肽連接起來的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件(CBM)組成。已知許多半纖維素酶(如木聚糖酶(E. C. 3. 2.1. 8)、甘露聚糖酶 (E. C. 3. 2.1. 78)和阿拉伯呋喃糖苷酶(E. C. 3. 2.1. 55))具有通過柔性接頭連接催化結(jié)構(gòu)域與CBM的相似組件結(jié)構(gòu)。半纖維素酶是催化以下鍵的水解的酶半纖維素的木聚糖骨架多糖中的糖苷鍵，或木聚糖骨架中的木糖單元與骨架所連接的其他糖之間的糖苷鍵。
催化結(jié)構(gòu)域是催化底物中糖苷鍵水解的獨立結(jié)構(gòu)域。已分離和表征了許多糖苷水解酶催化結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域通常(但不一定總是)是兩個結(jié)構(gòu)域中較大的一個。將具有相同的三維結(jié)構(gòu)和催化機制(但不一定具有相同的底物特異性)的糖苷水解酶劃分為家族(Davies和Henrissat, 1995)。迄今為止，已有超過150個糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase,GH)家族。纖維素酶存在于許多GH家族中，包括但不限于第5、6、7、8、9、12、44、 45、48、51、61和74家族；在第5、8、10、11和43家族中有木聚糖酶；在第5、26和113家族中有甘露聚糖酶；在第3、43、51、54和62家族中有阿拉伯呋喃糖苷酶；在第I和3家族中有 β-葡糖苷酶。
此外，接頭肽是伸長且具柔性的結(jié)構(gòu)，其保持催化結(jié)構(gòu)域相對于CBM的空間定向 (Shen等，1991 ；Receveur等,2002 ；Boisset等，1995)。不論是細(xì)菌還是真菌來源，纖維素酶和半纖維素酶中天然接頭肽的長度為6至60個氨基酸不等。這些肽的化學(xué)性質(zhì)和氨基酸組成相似(如果不是具體序列相似)，其中在接頭肽的氨基酸中，氨基酸絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸所占比例大于50% (綜述見Gilkes等，1991)。接頭還包含幾個常見類型的帶電殘基，它們都帶負(fù)電(如Glu或Asp)或都帶正電(如Lys、Arg或His)。絲氨酸和蘇氨酸殘基可被O-連接聚糖修飾，在真菌中所述O-連接聚糖主要為甘露糖(Fagerstam等，1984)。小角X射線或動態(tài)光散射的結(jié)果表明，接頭肽的糖基化有利于較伸長的構(gòu)象，其改變催化結(jié)構(gòu)域和CBM的相對位置。
碳水化合物結(jié)合組件(CBM)通常(但不一定總是)小于催化結(jié)構(gòu)域。CBM的作用是使酶與碳水化合物底物接近并且長時間接觸，以及增加底物降解的速率。在參與碳水化合物底物降解的多種酶(包括纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、殼多糖酶等)中發(fā)現(xiàn)了 CBM。因此，CBM能夠識別并結(jié)合結(jié)晶纖維素、非結(jié)晶纖維素、殼多糖、β-1， 3-葡聚糖、混合的β -1，3-1，4葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和淀粉。
正如催化結(jié)構(gòu)域那樣，CBM采用多種結(jié)構(gòu)來控制其底物結(jié)合親和性，從而也可根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系劃分為家族。迄今為止已有59種已知的CBM家族(參見URL cazy. org/fam/acc CDM.html)。在過去的二十年中已進(jìn)行了許多研究來闡明CBM的功能和結(jié)構(gòu) (Boraston 等，2004 ；Hashimoto 2006 和 Shoseyov 等，2006 綜述)?！?br> 本申請涉及第I家族CBM。這些CBM幾乎僅發(fā)現(xiàn)于真菌酶中，其包括由以下生產(chǎn)的纖維素酶和半纖維素酶木霉屬(Trichoderma ssp·)、曲霉屬(Aspergillus ssp.) > 肉座菌屬(Hypocrea ssp·)、腐質(zhì)霉屬(Humicola ssp·)、脈抱菌屬(Neurospora ssp·)、 Orpinomyces ssp.、赤霉菌屬(Gibberella ssp·)、裸胞殼屬(Emericella ssp·)、毛殼屬 (Chaetomium ssp·)、金抱屬(Chrysosporium ssp·)、鍵刀菌屬(Fusarium ssp·)、青霉菌屬(Penicillium ssp. )、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌屬(Phanerochaete ssp·)、栓菌屬(Trametes ssp.)、埃杜拉香 (Lentinula edodes)、Gleophyllum trabeiu>Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、煤油霉菌(Amorphotheca resinae)、白冬抱酵母(Leucosporidium scotti)、雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)、疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces lanuginosa)、嗜熱側(cè)抱霉(Sporotrichum thermophile)和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophilum)。
最初第I家族CBM被鑒定為真菌纖維素酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或CBD)。第I 家族CBM包含約40個氨基酸并且可存在于酶的N端或C端。第I家族CBM具有小的楔形 β-夾心結(jié)構(gòu)，具有包含以約10埃的距離間隔開的三個芳香族氨基酸(通常為色氨酸)的平坦結(jié)合表面(Kraulis等，1989 ；Mattinen等，1997)。這些芳香族殘基有助于通過與底物表面的范德華接觸來與結(jié)晶底物(如纖維素和殼多糖)的表面結(jié)合(Mattinen等，1997 ; Reinikainen 等，1992, Tormo 等，1996)。
經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的酶促水解在纖維素乙醇生產(chǎn)中是低效步驟，并且其成本是商業(yè)可行性的主要障礙之一。廣泛認(rèn)為提高纖維素酶的酶活性或者增加纖維素酶生產(chǎn)效率可能顯著地節(jié)約成本。
木質(zhì)素對纖維素酶系統(tǒng)的負(fù)面影響已被大量記載。已證明從硬木(白楊)中移除木質(zhì)素增加酶促水解的產(chǎn)糖率(Kong等，1992)。相似地，已證明從軟木(花旗松)中移除木質(zhì)素改善纖維素的酶促水解，該作用是由于酶對纖維素的可及性提高(Mooney等，1998)。 其他小組已證實從里氏木霉(Trichoderma reesei)純化的纖維素酶與分離的木質(zhì)素結(jié)合(Chernoglazov等，1988)，并且已推測出酶-木質(zhì)素相互作用中不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用 (Palonen等，2004)。當(dāng)將木質(zhì)素加回到純纖維素系統(tǒng)中時，觀察到里氏木霉纖維素酶與木質(zhì)素結(jié)合并且失活(Escoffier等，1991)。另一研究表明木質(zhì)素對纖維素酶無任何顯著影響(Meunier-Goddik和Penner, 1999)。而另外的報道提出，一些半纖維素酶可以抵抗木質(zhì)素及木質(zhì)素分解產(chǎn)物，甚至被其活化(Kaya等，2000)。盡管如此，通常公認(rèn)木質(zhì)素嚴(yán)重限制纖維素的酶促水解。
已證明從里氏木霉純化的纖維素酶結(jié)合分離的木質(zhì) 素(Chernoglazov等，1988)。 進(jìn)一步的工作表明所有的三個結(jié)構(gòu)域(催化核心、接頭和CBM)都結(jié)合木質(zhì)素(Palonen等， 2004)。例如，天然狀態(tài)下僅有催化結(jié)構(gòu)域而無CBM的來自于腐質(zhì)霉屬的Cel7B與木質(zhì)素完全結(jié)合(Berlin等，2005)。相似地，沒有CBM的木霉Cel5A核心不結(jié)合酶促產(chǎn)生的木質(zhì)素而結(jié)合堿提取的木質(zhì)素，其程度小于與全長蛋白質(zhì)的結(jié)合(Palonen等，2004)。據(jù)報道，CBM 參與木質(zhì)素結(jié)合。例如，從木霉Cel7A中去除CBM基本上消除了與堿提取的木質(zhì)素和通過酶促水解制備的木質(zhì)素剩余物的結(jié)合(Palonen等，2004)。
木質(zhì)素抗性纖維素酶的缺乏是將纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖(包括葡萄糖)從而生產(chǎn)乙醇和其他產(chǎn)品進(jìn)行工業(yè)化的巨大障礙。木質(zhì)素抗性酶的開發(fā)必須保留其分解纖維素的活性。已提出多種方法以降低木質(zhì)素對纖維素酶系統(tǒng)的負(fù)面影響。已證明非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白；BSA)阻止纖維素酶與木質(zhì)素表面的相互作用(Yang和Wyman， 2006，美國公開 No. 2004/0185542A1、美國公開 No. 2006/0088922A1、W005024037A2、A3, W009429474A1)。其他化學(xué)阻斷劑和表面活性劑表現(xiàn)出相似的作用(Tu等，2007 ;美國專利 No. 7，354，743)。
經(jīng)修飾的糖苷酶和修飾方法已有廣泛描述。在大多數(shù)情況下，突變被特異性地針對酶的催化結(jié)構(gòu)域。例如，已報道里氏木霉Cel7A和Cel6A催化結(jié)構(gòu)域的變體具有提高的熱穩(wěn)定性(美國專利 No. 7，375，197、W02005/028636、美國公開 No. 2007/0173431、 公開 No. 2008/167214、TO2006/074005、公開 No. 2006/0205042、美國專利 No. 7，348，168、 W02008/025164)。特別地，在第6家族纖維素酶中用脯氨酸替換相當(dāng)于里氏木霉CelA6第 413位的位置上的氨基酸(如，黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)Cel6A中的S407P突變)使熱穩(wěn)定性增加(W0 2008/025164)。已證明相當(dāng)于里氏木霉Cel6A和其他第6家族纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)第103、136、186、365和410位的位置上的突變引起葡萄糖抑制降低(美國公開No. 2009/0186381A1)。針對紡織應(yīng)用，已產(chǎn)生了抵抗蛋白酶和用于洗滌劑之表面活性劑的變體(W0 99/01544、WO 94/07998和美國專利No. 6，114，296)。
最近，已報道表現(xiàn)出與木質(zhì)素相互作用減少或者由木質(zhì)素引起的失活降低的經(jīng)修飾纖維素酶。例如，W02010/012102報道了相當(dāng)于里氏木霉Cel6A(TrCel6A)和其他第6家族纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域中129、322、363、365和410位的位置上的突變使木質(zhì)素存在下的水解活性增加。相似地，W02009/149202公開了帶有突變的纖維素酶變體，其在相當(dāng)于紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina) Cel6A 接頭肽和催化結(jié)構(gòu)域的 63、77、129、147、153、161、194、 197、203、237、247、254、281、285、289、294、327、339、344、356、378 和 382 位的位置上移除正電荷或引入負(fù)電荷。這種纖維素酶變體表現(xiàn)出與乙醇或熱處理的木質(zhì)素親和力降低。
僅在很少的情況下，接頭肽被鑒定為發(fā)揮關(guān)鍵作用或作為修飾目標(biāo)。對腐質(zhì)霉的第45家族內(nèi)切葡聚糖酶的接頭肽進(jìn)行修飾以降低蛋白質(zhì)水解(W0 94/07998、美國專利No. 6，114，296)，對木霉Cel7A的接頭肽進(jìn)行修飾以提高熱穩(wěn)定性(美國專利 No. 7，375，197)。美國公開No. 2010/0221778A1報道，降低接頭肽的等電點和/或增加其 Ser/Thr比的突變也可增加木質(zhì)素的存在下的水解活性。
對經(jīng)修飾的CBM的報道相對較少。在一個例子中，Linder等(1995)證明里氏木霉Cel7A的第I家族CBM中結(jié)合表面上酪氨酸殘基的突變顯著降低其與纖維素的結(jié)合，而結(jié)合表面上其他高度保守但非芳香族的氨基酸的突變所導(dǎo)致的纖維素結(jié)合降低程度較小。 在另一個例子中，報道了將楔形結(jié)構(gòu)“尖端”的酪氨酸(相當(dāng)于TrCel6A-CBM中的Tyr33)替換為組氨酸引起與纖維素的PH依賴性結(jié)合(Linder等，1999)。然而，盡管已觀察到第I家族CBM與木質(zhì)素相互作用，但未有開發(fā)與木質(zhì)素結(jié)合降低之經(jīng)修飾的第I家族CBM的報道。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的碳水化合物結(jié)合組件。更具體地，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出與木質(zhì)素結(jié)合降低的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件。本發(fā)明還涉及包含經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶、包含編碼經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾糖苷酶的核苷酸序列的基因構(gòu)建體，以及包含經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素或半纖維素底物的用途。
本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其與木質(zhì)素的結(jié)合降低， 并且不僅能使包含經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾糖苷酶對木質(zhì)素的結(jié)合降低，還能使所述酶在木質(zhì)素的存在下的底物水解活性增加。這種經(jīng)修飾的糖苷酶還可以更容易地從水解反應(yīng)結(jié)束時存在的任何剩余木質(zhì)素中回收并再利用。
本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其在選自10、11、12、14、 17、21、24、29、31、33和37的一個或更多個位置上包含氨基酸替換。包含氨基酸替換的一個或更多個位置通過將第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID NO 30所示的里氏木霉Cel6A碳水化合物結(jié)合組件(TrCel6A-CBM)的氨基酸序列進(jìn)行比對來確定。本發(fā)明的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件包含與SEQ ID NO 30約50%至約99. 9%相同的氨基酸序列，并且能夠與結(jié)晶纖維素結(jié)合。例如，本發(fā)明的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件包含與SEQ ID NO :30約60%至約99. 9%相同、或與SEQ ID NO :30約75%至約 99. 9%相同的氨基酸序列。
在一個替代實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件包含將選自11、12、14、17、24、29和31的一個或更多個位置上的堿性或電中性氨基酸替換為酸性氨基酸，并且與SEQ ID NO :30有約50%至約99. 9%的同一性且具有與結(jié)晶纖維素結(jié)合的能力。例如，11、12、14、17、24、29和31中的一個或更多個位置上的氨基酸被替換為天冬氨酸。
此外，本發(fā)明的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件包含選自10、21、33和37 的一個或更多個位置上的氨基酸替換，并且與SEQ ID NO :30有約50%至約99. 9%的同一性且具有與結(jié)晶纖維素結(jié)合的能力。例如，將第10位上氨基酸替換為絲氨酸，將第21位的氨基酸替換為芳香族氨基酸如酪氨酸，將第33位的氨基酸替換為天冬酰胺，將第37位的氨基酸替換為芳香族氨基酸如酪氨酸。
本發(fā)明還涉及包含由一個或更多個接頭肽功能性連接的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶，所述一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件中至少一個是以上限定的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件。經(jīng)修飾的糖苷酶相對于親本糖苷酶表現(xiàn)出在木質(zhì)素的存在下水解活性的增加和/或木質(zhì)素結(jié)合的減少， 所述親本糖苷酶包含經(jīng)由相同的一個或更多個接頭肽連接的衍生出所述經(jīng)修飾的碳水化合物結(jié)合組件的親本第I家族碳水化合物結(jié)合組件、相同的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和相同的一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件。
本發(fā)明經(jīng)修飾的糖苷酶中的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域可以是纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、β -葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域和輔助成分催化結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明經(jīng)修飾的糖苷酶中的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域可以是野生型催化結(jié)構(gòu)域或相對于野生型催化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸替換、插入或缺失的經(jīng)修飾催化結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明經(jīng)修飾的糖苷酶中的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域可以是第5、6、7、8、9、12、 44、45、48、51、61 和74家族糖苷水解酶的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域。例如，纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可包含里氏木霉Cel7A第1-436位氨基酸(SEQ ID NO :124)、里氏木霉Cel6A第83-447位氨基酸(SEQ IDNO :1)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens) Avi2 第 97-460 位氨基酸(SEQID NO 2)、黃孢原毛平革菌Cel6A第81-440位氨基酸(SEQ ID NO 3)。例如，纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以包含具有一個或更多個氨基酸替換的里氏木霉Cel6A第83-447位氨基酸(TrCel6A， SEQ ID NO 1),所述氨基酸替換選自 Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、 K129E、L136V、L1361、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G2131D、A322D、Q363E、G365D、G365E、 G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q、R410S 和 S413P。
本發(fā)明經(jīng)修飾的糖苷酶中的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域還可以是第5、8、10、11、26、 43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域，第I或3家族糖苷水解酶的 β_葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域，或者是輔助成分催化結(jié)構(gòu)域如膨脹因子(swollenin)、CIP或擴展蛋白(expansin)催化結(jié)構(gòu)域。例如，β -葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域可以是具有一個或更多個氨基酸替換的SEQ ID No :100的里氏木霉Cel3A，所述氨基酸替換選自V43X、V66X、S72X、 V101X、T235X、N248X、F260X、N369X、A386X 和 I543X。
本發(fā)明經(jīng)修飾的糖苷酶中，除經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件外的一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件可以是野生型碳水化合物結(jié)合組件，或者是相對于野生型催化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸替換、插入或缺失的經(jīng)修飾碳水化合物結(jié)合組件。相似地，本發(fā)明經(jīng)修飾的糖苷酶中的一個或更多個接頭肽可以是野生型接頭肽，或者是相對于野生型接頭肽包含氨基酸替換、插入或缺失的經(jīng)修飾接頭肽。例如，一個或更多個接頭肽可以是約6至約60個氨基酸長的經(jīng)修飾接頭肽，其中至少50%的氨基酸為脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，而且所述接頭肽包含一個或更多個氨基酸替換、插入或缺失，以使得與衍生出經(jīng)修飾接頭肽的親本接頭肽相比，其計算等電點減小和/或酪氨酸絲氨酸比例增加。這種經(jīng)修飾接頭肽使得經(jīng)修飾的糖苷酶與包含親本接頭肽的親本糖苷酶相比，在木質(zhì)素的存在下水解活性增加和 /或木質(zhì)素結(jié)合降低。
經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件、催化結(jié)構(gòu)域、其他碳水化合物結(jié)合組件或接頭肽中的任一個或全部都可以來源于一種或更多種真菌糖苷酶，產(chǎn)生所述真菌糖苷酶的生物包括但不限于木霉屬、曲霉屬、肉座菌屬、腐質(zhì)霉屬、脈孢菌屬、Orpinomyces ssp.、 赤霉菌屬、裸胞殼屬、毛殼屬、金孢屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌屬、栓菌屬、埃杜·拉香 、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、羅倫隱球酵母、出芽短梗霉、煤油霉菌、白冬孢酵母、雅致小克銀漢霉、疏棉狀嗜熱絲孢菌、嗜熱毀絲霉和嗜熱側(cè)孢霉。
本發(fā)明還涉及包含編碼上述經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾糖苷酶的核苷酸序列的基因構(gòu)建體，并且涉及包含用于表達(dá)和分泌第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾糖苷酶的基因構(gòu)建體的遺傳修飾微生物。所述遺傳修飾微生物可以是細(xì)菌、 酵母菌或絲狀真菌，如鏈霉菌屬(Streptomyces)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬 (Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、肉座菌屬(Hypocrea)、木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬 (Aspergillus)、鍵刀菌屬(Fusarium)、脈抱菌屬(Neurospora)、金抱霉屬(Chrysoporium) 或毀絲霉屬(Myceliophthora)。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)上述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾的糖苷酶的方法，其包括以下步驟在誘導(dǎo)經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾的糖苷酶表達(dá)和分泌的條件下，對包含編碼經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾糖苷酶的基因構(gòu)建體的遺傳修飾微生物進(jìn)行培養(yǎng)，以及從培養(yǎng)基中回收經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾的糖苷酶。生產(chǎn)上述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾的糖苷酶的方法可包括用編碼經(jīng)修飾纖維素酶的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明還涉及將纖維素或半纖維素底物水解成糖的方法，其包括使底物與上述經(jīng)修飾的糖苷酶接觸。在該方法的一個實施方案中，纖維素或半纖維素底物可以是預(yù)處理過的木質(zhì)纖維素底物。在該方法的另一個實施方案中，經(jīng)修飾的糖苷酶與親本糖苷酶相比表現(xiàn)出從該方法所得回收率的改善，所述親本糖苷酶包含相同的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、 一個或更多個接頭肽和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件，其中一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件中的至少一個是衍生出經(jīng)修飾糖苷酶中的經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件的親本第I家族碳水化合物結(jié)合組件。
將纖維素或半纖維素底物水解成糖的方法可以以連續(xù)、半連續(xù)或分批補料方法進(jìn)行。此外，將纖維素或半纖維素底物水解成糖的方法后可進(jìn)行糖到醇或糖醇的微生物發(fā)酵。


圖1是從里氏木霉中純化的纖維素酶成分的SDS-PAGE和Western印跡分析。圖 A示出SDS-PAGE后經(jīng)純化的Cel7A、Cel6A、Cel7B和Cel5A的考馬斯亮藍(lán)染色。平行分析木霉纖維素酶混合物以進(jìn)行比較。圖B示出在SDS-PAGE分離和電轉(zhuǎn)移到PVDF膜之后，這些樣品的成分特異性Western印跡(在每個印跡圖的左下角或右下角標(biāo)明)。
圖2示出木質(zhì)素對含有和不含有CBM的里氏木霉Cel7A(Cel7A和Cel7A核心 (Cel7Acore))的作用。圖A示出50°C在木質(zhì)素的存在下里氏木霉Cel7A蛋白質(zhì)和Cel7A活性的損失，圖B示出50°C在木質(zhì)素的存在下，Cel7Acore蛋白質(zhì)和Cel7Acore活性的損失。 將Cel7A和木瓜蛋白酶處理過的Cel7A(Cel7AC0re)與酸提取的木質(zhì)素一起孵育長達(dá)96小時。在整個實驗中的不同時間點取樣測量上清液(不含木質(zhì)素)中的Cel7A和Cel7ACore 蛋白質(zhì)濃度。還在木質(zhì)素漿液中測量了剩余Cel7A和Cel7ACore對預(yù)處理過的小麥秸桿隨時間的活性。
圖3示出將里氏木霉Cel7A的CBM添加到里氏木霉Cel3A中增加Cel3A的木質(zhì)素結(jié)合和與木質(zhì)素相關(guān)的失活。50°C下，將Cel3A(圖A)和Cel3A_CBM(圖B)與酸提取的木質(zhì)素一起孵育長達(dá)96小時。在整個實驗中的不同時間點取樣測量各自上清液(不含木質(zhì)素)中這些蛋白質(zhì)的濃度。還在它們各自的木質(zhì)素漿液中測量其隨時間的剩余活性。
圖4示出木質(zhì)素對含有和不含有CBM的里氏木霉Cel6A(Cel6A和Cel6Acore)的作用。圖A示出30°C在木質(zhì)素的存在下，Cel6A蛋白質(zhì)和Cel6A活性的損失，圖B示出30°C在木質(zhì)素的存在下 Cel6ACore蛋白質(zhì)和Cel6ACore活性的損失。30°C下,將Cel6A(圖A)和用木瓜蛋白酶處理產(chǎn)生的Cel6ACore(圖B)與酸提取的木質(zhì)素一起孵育長達(dá)96小時。隨時間測量各自的上清液中這些蛋白質(zhì)的濃度以及它們對預(yù)處理過的小麥秸桿的剩余活性。
圖5繪出分別指導(dǎo)從重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)和分泌天然和經(jīng)修飾 HiAvi2 和 PcCel6A 的質(zhì)粒載體 YEp352/PGK91_l_ a ss_NKE_HiAvi2 (圖 A)和 YEp352/PGK91-l-a ss-NKE-PcCel6A-S407P(圖 B)。
圖6繪出指導(dǎo)從重組釀酒酵母中表達(dá)和分泌親本和經(jīng)修飾的TrCel6A的質(zhì)粒載體 YEp352/PGK91-l ANhel-a ss-TrCel6A-S413P。
圖7包括兩個散點圖。圖A是實施例1Ob中描述的高通量測定中，經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素的存在下的酶活性(+BSA活性)相對于未處理木質(zhì)素的存在下的酶活性(-BSAS 性)的散點圖。數(shù)據(jù)涉及對以下濾液的篩選包含親本和經(jīng)修飾HiAvi2纖維素酶的微孔板培養(yǎng)物(實施例9)的濾液，或空載體轉(zhuǎn)化體的濾液。圖B是實施例1Oc中描述的高通量測定中，經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素的存在下的酶活性(+BSA)相對于未處理木質(zhì)素的存在下的酶活性(-BSA活性)的散點圖。數(shù)據(jù)涉及對以下濾液的篩選包含親本(PcCel6A-S407P)和經(jīng)修飾PcCel6A纖維素酶的微孔板培養(yǎng)物(實施例9)的濾液，或空載體轉(zhuǎn)化體的濾液。
圖8示出實施例1Oa中描述的高通量測定中，經(jīng)BSA處理的木質(zhì)素的存在下的酶活性(+BSA活性)相對于未處理的木質(zhì)素的存在下的酶活性(-BSA活性)的散點圖。數(shù)據(jù)涉及對以下濾液的篩選包含親本(TrCel6A-S413P)和經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的微孔板培養(yǎng)物(實施例9)的濾液，或者空載體轉(zhuǎn)化體的濾液。
圖9繪出指導(dǎo)從重組里氏木霉表達(dá)和分泌天然和經(jīng)修飾TrCel7A糖苷酶的載體 pTrCe17A-pyr4-TV。
圖10繪出來自TrCel6A、HiAvi2和PcCel6A_S407P易錯PCR文庫的兩類經(jīng)修飾糖苷酶(即木質(zhì)素抗性“命中(hits)”和非選擇性但具活性的糖苷酶)中CBM結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸替換的分布。將氨基酸改變分為引入正電荷的那些變化(即將中性氨基酸轉(zhuǎn)化為堿性氨基酸，如His、Lys或Arg)或引入負(fù)電荷的那些變化(即將中性氨基酸轉(zhuǎn)化為Glu或Asp)。
圖11證明通過移除或封閉原位木質(zhì)素，從預(yù)處理過的木質(zhì)纖維素中回收的野生型TrCel7A糖苷酶增加。將具有增加水平的TrCel3A β -葡糖苷酶的里氏木霉纖維素酶混合物與預(yù)處理過的小麥秸桿(WS)、經(jīng)次氯酸鹽漂白預(yù)處理的小麥秸桿(bWS)和用牛血清白蛋白預(yù)孵育以封閉木質(zhì)素的預(yù)處理過的小麥秸桿(BSA-WS) —起孵育。在整個水解時程中收集樣品上清液并且測定葡萄糖和TrCe17A的濃度。在轉(zhuǎn)化率為O. 98時，與WS對照相比， 涉及bWS和BSA-WS的反應(yīng)中上清液中存在更多的TrCel7A。
圖12示出TrCel7A(PCB entry laz6)中第I家族CBM的結(jié)構(gòu)，以及根據(jù) TrCe17A(PDB entry laz6)中第 I 家族 CBM 的結(jié)構(gòu)計算的 TrCe16A, HiAvi2 和 PcCel6A 中 CBM的結(jié)構(gòu)。β-折疊結(jié)構(gòu)顯示為帶。相當(dāng)于在TrCel7A CBM中觀察到的參與纖維素結(jié)合之氨基酸的氨基酸用灰色棍結(jié)構(gòu)繪出，而與木質(zhì)素相互作用的那些氨基酸用黑色球棍結(jié)構(gòu)示出。與木質(zhì)素和纖維素相互作用的殘基也用黑色球棍結(jié)構(gòu)示出。
圖 13 不出從 ProSite URL expasy. ch/cg1-bin/aligner psa = PS00562&color-l&maxinsert = 10&linelen = O 中獲得的 34 種第 I 家族 CBM 的 Clustal W比對。
圖14示出圖13中CBM序列對之間的氨基酸序列同一性。
圖15示出TrCel6A、HiAvi2、PcCel6A和TrCe17A中第I家族CBM的比對。使用實施例4的方法發(fā)現(xiàn)的在木質(zhì)素結(jié)合降低的經(jīng)修飾第I家族CBM中被替換的氨基酸用粗體表/Jn ο
圖16示出如實施例4中所述，在與木質(zhì)素一起孵育24小時之后，親本(WT)和經(jīng)修飾PcCel6A糖苷酶的相對剩余活性。
圖17示出如實施例4中所述測定的親本(WT)和經(jīng)修飾TrCel6A糖苷酶的相對木質(zhì)素解離常數(shù)(K1)。
圖18示出如實施例4中所述測定的親本(WT)和經(jīng)修飾TrCel7A糖苷酶的相對木質(zhì)素解離常數(shù)(K1)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的碳水化合物結(jié)合組件。更具體地，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出與木質(zhì)素結(jié)合降低的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件。本發(fā)明還涉及包含經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶、包含編碼經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件或經(jīng)修飾糖苷酶的核苷酸序列的基因構(gòu)建體、以及包含經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾的糖苷酶在木質(zhì)素的存在下水解纖維素或半纖維素底物的用途。
本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其與木質(zhì)素的結(jié)合降低， 并且不僅能使包含經(jīng)修飾第I家族碳水化合物結(jié)合組件的經(jīng)修飾糖苷酶對木質(zhì)素的結(jié)合降低，還能使所述酶在木質(zhì)素的存在下的底物水解活性增加。
以下描述是只是通過舉例的方式描述本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，而不限制實施本發(fā)明所必需的特征的組合。提供的標(biāo)題并非意在限制本發(fā)明的多個實施方案。術(shù)語如 “包含”、“包括”、“含有”并非意于限制。此外，除非另有說明，不使用數(shù)量詞時包括復(fù)數(shù)的情況，并且“或”是指“和/或”。除非本文中另有限定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。
第I家族碳水化合物結(jié)合組件
碳水化合物結(jié)合組件或CBM是糖苷水解酶和識別并結(jié)合多糖的其他蛋白質(zhì)的非催化結(jié)構(gòu)域。CBM常常發(fā)現(xiàn)于含有降解不可溶多糖的糖苷水解酶的真菌和細(xì)菌蛋白中。但是，在不包含糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域但是參與不可溶多糖(如纖維素)降解的蛋白質(zhì)中也鑒定到CBM0這些包括但不限于Cipl (Foreman等,2003)和膨脹因子(Saloheimo等,2002)。根據(jù)氨基酸序列相似性將CBM劃分成家族；目前有59個CBM家族(http://www. cazy. org/ Carbohydrate-Binding-Modules. html)。在這些CBM中，已證明不同成員識別結(jié)晶纖維素、 非結(jié)晶纖維素、殼多糖、β_葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和淀粉。有時將與纖維素結(jié)合的CBM稱為術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“CBD”。第I家族CBM對于結(jié)晶纖維素具有高結(jié)合親和力，而其他家族的CBM對于非晶纖維素或單鏈多糖具有高結(jié)合親和力(Boraston等, 1004)。
正如Shoseyov等(2006)歸納的，已研究了 CBM的碳水化合物結(jié)合活性以用于許多應(yīng)用。例如，已證明分離的CBM在纖維素纖維的非水解性破壞和纖維性質(zhì)的改變中發(fā)揮作用。此外，CBM已用于生物技術(shù)應(yīng)用中，其作為親和標(biāo)簽用于重組的融合蛋白的生物特異性親和純化，或用于使通常不包含CBM的酶靶向天然纖維(例如使氧化酶靶向織物表面)。 CBM還用作表征纖維表面或檢測植物細(xì)胞壁中的多糖的分析工具。已開發(fā)CBM 二聚體作為新的纖維素交聯(lián)蛋白，已證實其有效增強紙的機械性質(zhì)或改變其表面性質(zhì)。最后，當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時，已證明CBM增加纖維素生物合成和/或生長的速率。
在真菌中，CBM是同源的并且是第I家族CBM(CBMl)的成員。里氏木霉纖維素酶、 半纖維素酶和相關(guān)蛋白質(zhì)中的CBM序列見表I。四個半胱氨酸是高度保守的并且形成兩個二硫鍵。三個芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸)也是保守的，它們形成平面并且經(jīng)由范德華相互作用與纖維素聚合物的葡萄糖單元直接相互作用。第I家族CBM對結(jié)晶纖維素有高結(jié)合親和力。
第I家族CBM在本文中被定義為根據(jù)CAZy系統(tǒng)(參見http://www. cazy. org/ Carbohydrate-Binding-Modules. html作為參考)劃分為第I家族CBM的任何蛋白質(zhì)序列。 第I家族CBM可與SEQ ID NO :30所示里氏木霉Cel6A (也稱作纖維二糖水解酶II或CBH 2) CBM的氨基酸序列有約50%的氨基酸序列同一性。例如，第I家族CBM可與SEQ ID NO 30 所提供的里氏木霉TrCel6A有約50%、60%、70%、80%、90%或95%的氨基酸同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)給定CBM的氨基酸序列可通過添加、缺失或替換一個或更多個氨基酸進(jìn)行修飾并且仍被認(rèn)為是CBM。
當(dāng)CBM位于分泌的糖苷酶的N端時,本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)當(dāng)給CBM的氨基酸編號時，不考慮構(gòu)成分泌信號肽的氨基酸。本文中，第I家族CBM中氨基酸的編號從相當(dāng)于 TrCel6A(SEQ ID NO 1)中第一個谷氨酰胺(Q)的位置上開始。
表1:里氏木霉蛋白質(zhì)中第I家族CBM的序列
酶CBM 序列(缺失SEQ ID No ) kE氏木霉Cel 6Λ CBM (a a 3-39) 的同一性%CBHl (Tr€el7A)PTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPY YSQCL (SEQ ID NO: 27)63.9CBH2 (TrCeMA)QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSN DYYSQCL(SEQ ID N0:30)100.0EGl (TrCel7B)CTQTHWGQCGGIGYSGCKTCTSGTTCQYSND YYSQCL(SEQIDNOrll)63.9E02 (TrCelSA)AQQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNP YYAQCI(SEQ ID NO:12)61.1HG4 (TrCel61A)PTQTLYGQCGGSGYSGPTRCAPPATCSTLNPY YAQCL(SEQ ID NO: 14)52.8EG5 (TrCeMSA)GQQTLYGQCGGAGWTGPrrCQAPGTCKVQN QWYSQCL(SEQ ID NO: 15)50.0TrCeI74AGHYAQCGGIGWTGPTQCVAPYVCQKQNDYY YQ (SEQ ID NO: 40)56 0CiplHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQC L(SEQIDNO:42)61 ICip2WGQCGG1GWSGPTTCVGGAYCVSYNPYY (SEQ ID NO: 43)64.0膨脹因子ALFGQCGGIGWSGTTCCVAGAQCSFVNDWYS QCL (SEQ ID NO44)58.3ManDALYGQCGGSGYTGPTCCAQGTCIYSNTWTSQCL (SEQ ID No: 41)65.0AxelPTQTHWGOCGGQGW^rGPTQCESGTTCQVISQ WYSQCL (SEO ID NO: 7)70.0
如圖13所示，第I家族纖維結(jié)合域中的一級氨基酸序列高度保守。目前已知的 34種真菌來源第I家族CBM氨基酸序 列的多重比對表明，大多數(shù)天然第I家族CBM與包含 TrCe16A第I家族CBM的3_39位氨基酸有約45%至約100%的氨基酸序列同一性，并且與至少一個其他第I家族CBM有約40%至約95%的氨基酸序列同一性(圖14)。
使用人工比對或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何序列比對算法，可以容易地通過比對兩種序列的氨基酸來確定序列同一性。圖13和14中分別示出的比對和同一性計算使用在BioEdit軟件版本7. O. 9.0(2007年6月27日)中提供的具有缺省設(shè)置的ClustalW 多重比對工具來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他比對算法包括但不限于BLAST算法 (BLAST 和 BLAST 2. O ；Altschul 等，1997 和 1990)、Smith&ffaterman(1981)公開的算法、 Needleman&ffunsch (1970)的同源比對算法、Pearson&Lipman (1988)的\搜索相似性方法、 計算機執(zhí)行的這些算法(在 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup, 575Science Dr.，Madison, ffis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)，或者人工比對和目測。
“經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件”或“經(jīng)修飾的第I家族CBM”意指結(jié)合結(jié)晶纖維素并且在選自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一個或更多個位置上包含氨基酸替換的第I家族CBM，所述位置通過將第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID NO 30中所示里氏木霉Cel6A碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列進(jìn)行比對來確定。本文中所用的經(jīng)修飾的第I家族CBM不包括天然CBM。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，蛋白質(zhì)(如CBM)與其配體或底物(如纖維素)的結(jié)合可以通過建立結(jié)合等溫線進(jìn)行定量。在這些實驗中，添加到包含恒量底物或配體的溶液或懸液中的蛋白質(zhì)的吸收率會隨著所添加蛋白質(zhì)量的增加而增加，直至底物被蛋白質(zhì)飽和為止。在 Linder 等(1995 和 1999)、Mattinen 等(1997)和 Reinikainen 等(1992)中描述了使用結(jié)合等溫線來評價和定量第I家族CBM與纖維素結(jié)合的方法。可以使用Nidetzky 等(1994)的方法或者使用實施例4和14中提供的方法評價和定量包含親本或經(jīng)修飾的第 I家族CBM的糖苷酶與纖維素底物的結(jié)合。
例如，經(jīng)修飾的第I家族CBM可以在選自11、12、14、17、24、29和31的一個或更多個位置上包含將堿性或電中性氨基酸替換為酸性氨基酸的替換。本文中所限定的“堿性氨基酸”是指組氨酸、賴氨酸或精氨酸中的任何一種，“酸性氨基酸”是指天冬氨酸或谷氨酸中的任何一種，“電中性氨基酸”是指不是堿性或酸性氨基酸的任何一種氨基酸。
經(jīng)修飾的第I家族CBM還在選自10、21、33和37的一個或更多個位置上包含氨基酸替換。例如，將第10位的氨基酸替換為絲氨酸，將第21位的氨基酸替換為芳香族氨基酸如酪氨酸，將第33位的氨基酸替換為天冬酰胺，將第37位的氨基酸替換為芳香族氨基酸如酪氨酸。
經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID NO 30有約50% 至約99. 9%或其間任何量的氨基酸序列同一性。例如，經(jīng)修飾的第I家族CBM的氨基酸序列可以與 SEQ ID NO :30 有約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或 9 9. 9%的氨基酸序列同一性?！耙吧汀被颉疤烊弧钡贗家族CBM是指在自然界發(fā)現(xiàn)的沒有任何氨基酸替換、插入或缺失的第I家族CBM。
應(yīng)理解的是，經(jīng)修飾的第I家族CBM可來源于野生型第I家族CBM或已包含另外的氨基酸替換的第I家族CBM。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的第I家族CBM由核酸序列編碼，該核酸序列可以使用遺傳物質(zhì)或期望的經(jīng)修飾第I家族CBM或相應(yīng)親本第I家族CBM特有的核酸或氨基酸序列信息生成。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，使用改變氨基酸序列的一種或更多種分子生物學(xué)技術(shù)， 這種遺傳物質(zhì)或序列信息可以用于生成編碼期望的經(jīng)修飾第I家族CBM的核酸序列，所述分子生物學(xué)技術(shù)包括但不限于定點誘變、盒式誘變、隨機誘變、合成寡核苷酸構(gòu)建體、克隆、 亞克隆、PCR擴增、體外合成和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他基因工程技術(shù)。應(yīng)理解的是，經(jīng)修飾第I家族可來源于任何親本第I家族CBM，即其可來源于天然或“野生型”第I家族CBM 或已包含另外的氨基酸替換的第I家族CBM。
例如，經(jīng)修飾的第I家族CBM可表現(xiàn)出與木質(zhì)素結(jié)合的降低。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件可以使糖苷酶與木質(zhì)素的結(jié)合降低或者木質(zhì)素存在下的底物水解活性增加，所述糖苷酶包含由一個或更多個接頭肽連接的經(jīng)修飾的第 I家族碳水化合物結(jié)合組件、一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件。
為了本發(fā)明的目的，“親本第I家族CBM”或“親本第I家族碳水化合物結(jié)合組件” 是不包含經(jīng)修飾第I家族CBM中的氨基酸替換的第I家族CBM。因此，親本第I家族CBM可以是在另外的位置包含通過基因工程或其他技術(shù)引入的氨基酸替換且能夠與纖維素結(jié)合的第I家族CBM。親本第I家族CBM還可以是野生型第I家族CBM。或者，在生產(chǎn)經(jīng)修飾的第I家族CBM之后，隨后經(jīng)修飾的第I家族CBM可進(jìn)一步被修飾為包含另外的氨基酸替換。
經(jīng)修飾的糖苷酶
本文所用的糖苷酶包含一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件(CBM)，它們由定位在結(jié)構(gòu)域之間的一個或更多個接頭肽連接。一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個CBM和一個或更多個接頭肽彼此可以是同源的(即屬于自然界中分離的同一種糖苷酶)，或者與至少一個其他結(jié)構(gòu)域是異源的(即從相同或不同生物來源的兩種或更多種不同的天然糖苷酶中分離)。一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個CBM和一個或更多個接頭肽的氨基酸序列可以是“天然的”或“野生型”(即與自然界中產(chǎn)生的未經(jīng)修飾的糖苷酶中所發(fā)現(xiàn)的一樣)，或者它們可以通過修飾其氨基酸序列“來源”于的天然或野生型糖苷酶。術(shù)語“糖苷酶”可以與術(shù)語“糖苷水解酶”互換使用。
糖苷酶可包含另外的功能結(jié)構(gòu)域(如黏結(jié)蛋白、對接素(dockeri n)或纖連蛋白樣 (Fn3)結(jié)構(gòu)域)并且仍然被認(rèn)為是糖苷酶。
可從其分離或衍生一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個CBM和一個或更多個接頭肽的糖苷酶的實例包括來自于多種微生物的糖苷酶，所述微生物如木霉屬、曲霉屬、肉座菌屬、腐質(zhì)霉屬、脈孢菌屬、Orpinomyces ssp.、赤霉菌屬、裸胞殼屬、毛殼屬、金孢屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌屬、栓菌屬、埃杜拉香燕、Gleophyllum trabeiu>Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus>Geomyces pannorum、羅倫隱球酵母、 出芽短梗霉、煤油霉菌、白冬孢酵母、雅致小克銀漢霉、疏棉狀嗜熱絲孢菌、嗜熱側(cè)孢霉或嗜熱毀絲霉。本發(fā)明的實施不限于可從其得到一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個CBM 和一個或更多個接頭肽的糖苷酶。
本文所用的“經(jīng)修飾的糖苷酶”是包含一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個 CBM和一個或更多個接頭肽的糖苷酶，其中一個或更多個CBM中的至少一個是在選自10、 11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一個或更多個位置上包含氨基酸替換的經(jīng)修飾的第 I家族CBM并且表現(xiàn)為結(jié)合結(jié)晶纖維素且與SEQ ID NO :30有約50%至約99. 9%同一性。 一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域可以是野生型或經(jīng)修飾的催化結(jié)構(gòu)域，一個或更多個接頭肽可以是野生型或經(jīng)修飾的接頭肽。本文所用術(shù)語“經(jīng)修飾的糖苷酶”不包括天然糖苷酶。
本文所用“親本糖苷酶”是除至少一個或更多個CBM是衍生出經(jīng)修飾糖苷酶中的經(jīng)修飾第I家族CBM的親本第I家族CBM之外，包含與經(jīng)修飾的糖苷酶相同的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個CBM和一個或更多個接頭肽的糖苷酶。此外，除親本糖苷酶中的親本第I家族CBM在選自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一個或更多個位置上不包含氨基酸替換之外，其與經(jīng)修飾的糖苷酶中的經(jīng)修飾的第I家族CBM相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的是，相對于天然催化結(jié)構(gòu)域、CBM或接頭肽，一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個CBM、親本第I家族CBM和一個或更多個接頭肽可以包含氨基酸替換、插入或缺失， 前提是這些氨基酸替換也存在于經(jīng)修飾的糖苷酶中。
在本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖苷酶中，一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域可以是纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、β -葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域或輔助蛋白催化結(jié)構(gòu)域。
“纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域”被定義為能夠切割纖維素聚合物中的β -1，4_糖苷鍵的任何結(jié)構(gòu)域。纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是內(nèi)切葡聚糖酶(EC3. 2.1. 4)，其切割纖維素聚合物中的內(nèi)部β_1，4-糖苷鍵以降低聚合物的聚合度和/或釋放寡糖。纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域還可以是外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3. 2.1. 91)，其從纖維素聚合物的末端釋放小的寡糖，主要是纖維二糖。纖維素聚合物可以是天然纖維素，如由植物或藻類或其他生物產(chǎn)生的纖維素，并且可以是純的或者是植物生物質(zhì)中的幾種成分之一，其也包含木質(zhì)素和半纖維素。纖維素聚合物還可以是纖維素衍生物，如羧甲基纖維素或羥乙基纖維素。纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族GH的成員。例如，纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可包含里氏木霉Cel7A第1-436位氨基酸(SEQ ID NO :124)、里氏木霉Cel6A的 83-447位氨基酸(SEQ ID NO :1)、特異腐質(zhì)霉Avi2的97-460位氨基酸(SEQ ID N0:2)，或黃孢原毛平革菌Cel6A的81-440位氨基酸(SEQ ID NO :3)。例如，纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可包含用一個或更多個氨基酸替換的里氏木霉Cel6A的83-447位氨基酸(SEQ ID NO :1)，其中一個或更多個氨基酸替換選自 Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E L136V、L1361、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G231D、A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、 G3 65S、R410A、R410F、R410L、R410Q 和 R410S。
“半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域”被定義為能夠切割半纖維素聚合物中的β -1，4_糖苷鍵的任何結(jié)構(gòu)域。例如，半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是木聚糖酶(E. C. 3. 2.1. 8)、β-甘露聚糖酶(E. C. 3. 2.1. 78)或阿拉伯呋喃糖苷酶(E. C. 3. 2.1. 55)?；蛘撸肜w維素酶催化結(jié)構(gòu)域可以是第5、8、10、11、26、43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的成員。
“ β -葡糖苷酶”催化結(jié)構(gòu)域被定義為能夠從小的β -1，4-連接寡糖(如纖維二糖) 產(chǎn)生葡萄糖的任何結(jié)構(gòu)域。β -葡糖苷酶(E. C. 3. 2.1. 21)可以是第I或3家族糖苷水解酶的成員。例如，3-葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域可以是具有選自￥43乂、￥66乂、572乂、￥10以、了235父、 Ν248Χ、F260X、Ν369Χ、Α386Χ和Ι543Χ的一個或更多個氨基酸替換的里氏木霉Cel3A(SEQ ID NO :100)，它使得TrCel3A β -葡糖苷酶的穩(wěn)定性和/或催化效率提高(美國公開 No. 2010/0093040Α1 和美國公開 No. 2010/0304438Α1)。
最后，“輔助蛋白催化結(jié)構(gòu)域”包括與纖維素相互作用以利于纖維素水解的蛋白質(zhì)，其包括但不限于Cipl、Cip2、膨脹因子和擴展蛋白。輔助蛋白催化結(jié)構(gòu)域還包含有助于水解木質(zhì)纖維素的其他蛋白質(zhì)，如乙酰木聚糖酯酶(E. C. 3.1.1. 72)、阿魏酸酯酶 (E. C. 3.1.1. 73)和纖維二糖脫氫酶(E. C.1.1. 99. 18)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的是，給定催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可以通過插入、缺失或替換一個或更多個氨基酸進(jìn)行修飾并且仍然被認(rèn)為是纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域。
CBM和催化結(jié)構(gòu)域常常通過接頭肽分隔開。術(shù)語“接頭肽”應(yīng)理解為位于兩個功能結(jié)構(gòu)域之間并且包含約6至約60個氨基酸的氨基酸段?？梢允褂萌鏐ae等(2008)和 Suyama等(2003)描述的模型從氨基酸序列信息中鑒定接頭肽。Gilkes等(1991)介紹了該定義中涵蓋的多種纖維素酶以及其他細(xì)菌和真菌蛋白質(zhì)的接頭序列。相對于非接頭序列，接頭肽通常是堿性肽，特別是富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸。如Gilkes等(1991)的表I中所示，在細(xì)菌和真菌糖苷水解酶(木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶)的全部接頭肽序列中，脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸占氨基酸的50%以上。為了本文中限定的目的，接頭肽可被定義為天然的、發(fā)現(xiàn)于催化結(jié)構(gòu)域與CBM、兩個催化結(jié)構(gòu)域、兩個CBM之間或另一個功能域與催化結(jié)構(gòu)域或CBM之間的約6至約60個氨基酸的段，其中至少50%為脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。在接頭肽中，脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸可以占氨基酸的501601701801 90%或100% ((脯氨酸+蘇氨酸+絲氨酸數(shù))/接頭中的氨基酸數(shù)X 100%)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的是，給定接頭的氨基酸序列可以通過插入、缺失或替換一個或更多個氨基酸進(jìn)行修飾并且仍然被認(rèn)為是接頭肽。
除以上定義的經(jīng)修飾的第I家族CBM之外，經(jīng)修飾的糖苷酶可包含另外的CBM。這些另外的CBM可來源于使用CAZy系統(tǒng)(參見http://www. cazy. org/ Carbohydrate-Binding-Modules. html)確定的 59 個 CBM 家族中的任一個。
最后，經(jīng)修飾的糖苷酶可包含其他結(jié)構(gòu)域，包括但不限于纖連蛋白樣(Fn3)結(jié)構(gòu)域、黏結(jié)蛋白、對接素或其他碳水化合物(例如淀粉酶、葡糖淀粉酶、殼多糖酶等)活性結(jié)構(gòu)域。
測量木質(zhì)素結(jié)合
上述親本或經(jīng)修飾的第I家族CBM或者親本和經(jīng)修飾的糖苷酶與木質(zhì)素的結(jié)合程度可以通過下述過程測定將CBM或糖苷酶與純化的木質(zhì)素一起預(yù)孵育一段時間，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定方法測量溶液和/或木質(zhì)素-蛋白質(zhì)漿液中的剩余蛋白質(zhì)濃度和/或酶活性。圖16中示出包含第6家族纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和親本或經(jīng)修飾第I家族CBM的親本和經(jīng)修飾糖苷酶在與木質(zhì)素一起孵育24小時之后的相對剩余活性。
如果純化的木質(zhì)素不可溶，那么通過離心或過濾可以很容易地將蛋白質(zhì)-木質(zhì)素復(fù)合物從包含未結(jié)合蛋白質(zhì)的溶液主體中分離出來?？梢酝ㄟ^酸提取、堿提取、有機溶劑提取或用水解酶酶促消化木質(zhì)纖維素來從木質(zhì)纖維素原料(下面描述的)中純化木質(zhì)素。對親本和經(jīng)修飾的第I家族CBM或·糖苷酶的相對結(jié)合的測定不依賴于木質(zhì)素純化方法、木質(zhì)素來源或用于檢測溶液中蛋白質(zhì)的測定方法。實施例4中提供了測量親本和經(jīng)修飾第I家族CBM，以及親本和經(jīng)修飾糖苷酶的相對結(jié)合的方法。
親本和經(jīng)修飾的第I家族CBM或親本和經(jīng)修飾的糖苷酶與木質(zhì)素的相對結(jié)合可以這樣測定如實施例4中所述，計算經(jīng)修飾的第I家族CBM或糖苷酶的木質(zhì)素解離常數(shù) Og，然后除以對親本CBM或糖苷酶計算的木質(zhì)素解離常數(shù)Og。圖17和18中示出包含第6或7家族纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域的經(jīng)修飾糖苷酶的相對&值。
經(jīng)修飾的糖苷酶因木質(zhì)素而失活的減少可以這樣測定在存在和不存在木質(zhì)素的情況下，測量底物(如偶氮鍵葡聚糖或纖維素)的降解，然后得到木質(zhì)素存在時的活性與木質(zhì)素不存在時的活性之比。這種水解反應(yīng)中存在的木質(zhì)素可以是不溶底物的一部分(如預(yù)處理過的木質(zhì)纖維素中)，或者是以可溶或不可溶形式分離。如果木質(zhì)素被分離或純化，那么木質(zhì)素對經(jīng)修飾或親本糖苷酶的失活通過測量等價水解反應(yīng)的活性來測定，其中反應(yīng)之一包含足夠量的木質(zhì)素以降低糖苷酶活性?；蛘撸ㄟ^包被非特異性蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白(BSA))、表面活性劑或其他化學(xué)品將分離的木質(zhì)素處理滅活能力降低，它們可以以與未處理木質(zhì)素相同的量加入到對照反應(yīng)中。如果木質(zhì)素是不可溶底物的一部分，那么木質(zhì)素對經(jīng)修飾或親本糖苷酶的失活這樣測定得到對漂白底物(從其中移除木質(zhì)素，例如，通過氧化劑如二氧化氯)的糖苷酶活性與對包含木質(zhì)素之未漂白底物的糖苷酶活性的比例。 與親本糖苷酶相比，經(jīng)修飾的糖苷酶因木質(zhì)素而失活的降低表現(xiàn)出更高的活性比(未處理的分離的木質(zhì)素?zé)o木質(zhì)素或處理的木質(zhì)素)。實施例10中提供了在存在木質(zhì)素酶的情況下，分別包含親本和經(jīng)修飾第I家族CBM的親本和經(jīng)修飾糖苷酶的相對活性的測量方法。
有幾種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測量經(jīng)修飾和親本糖苷酶的底物水解活性的測定法。例如，纖維素或半纖維素的水解可以通過測量還原糖的酶依賴性釋放來監(jiān)測，還原糖在隨后進(jìn)行的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)或化學(xué)酶促測定(如二硝基水楊酸(DNS)反應(yīng))中定量。多糖的水解還可以通過色譜方法來監(jiān)測，該色譜方法對通過酶作用釋放的可溶性單糖、二糖和寡糖進(jìn)行分離和定量。此外，可以將可溶性比色底物摻入瓊脂培養(yǎng)基中，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)并分泌親本或經(jīng)修飾纖維素酶的宿主微生物。在這種瓊脂板測定中，纖維素酶的活性通過在表達(dá)和分泌活性纖維素酶的單個微生物菌落周圍的有色或無色環(huán)來檢測。然而應(yīng)理解的是，本發(fā)明的實施并不限于評價經(jīng)修飾糖苷酶的活性的方法。
在木質(zhì)素漿液中預(yù)孵育之后，可以測定第I家族CBM的存在和不存在對纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域(例如第7家族和第6家族催化結(jié)構(gòu)域)或第3家族β-葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和底物水解活性的影響。圖2、3和4的數(shù)據(jù)表明，第I家族CBM的存在大大增加了水解反應(yīng)中木質(zhì)素對溶液中蛋白質(zhì)的截留，但是對其附接的催化結(jié)構(gòu)域的水解活性影響很小。此外，圖11表明帶有野生型第I家族CBM的Cel7A從其中底物不含木質(zhì)素或者木質(zhì)素被非特異性蛋白質(zhì)“封閉”的水解反應(yīng)中更易回收。在存在未處理木質(zhì)素(-BSA)和經(jīng)處理木質(zhì)素(+BSA)的情況下，通過實施例10所述的親本與經(jīng)修飾糖苷酶的對比研究來測定包含親本或經(jīng)修飾第I家族CBM的親本和經(jīng)修飾糖苷酶的纖維素水解活性。結(jié)果示于下表2中。包含第I家族CBM的所有經(jīng)修飾的糖苷酶均表現(xiàn)出木質(zhì)素結(jié)合至少20%的降低(I高出20% )，和/或在存在未處理木質(zhì)素的情況下的活性與存在BSA處理之木質(zhì)素的情況下的活性之比高出11% (土BSA活性比增加 10% )。
表2 :包含經(jīng)修飾的第I家族CBM并且在木質(zhì)素的存在下表現(xiàn)出增強的水解活性 (相對于親本糖苷酶)的經(jīng)修飾糖苷酶
權(quán)利要求
1.經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其在選自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一個或更多個位置上包含氨基酸替換，所述位置通過比對第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQID N0:30所示里氏木霉(Trichoderma reesei) Cel6A碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列來確定，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件顯示出與結(jié)晶纖維素結(jié)合并且包含與SEQ ID NO :30具有約50%至約99. 9%同一性的氨基酸序列。
2.經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其在選自11、12、14、17、24、29和31的一個或更多個位置上包含替換為酸性氨基酸的氨基酸替換，所述位置通過比對第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID N0:30所示里氏木霉Cel6A碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列來確定，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件顯示出與結(jié)晶纖維素結(jié)合并且包含與SEQ ID NO :30具有約50%至約99. 9%同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中所述酸性氨基酸是天冬氨酸。
4.經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其在選自10、21、33和37的一個或更多個位置上包含氨基酸替換，所述位置通過比對第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID NO :30所示里氏木霉Cel6A碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列來確定，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件顯示出與結(jié)晶纖維素結(jié)合并且包含與SEQ IDNO :30具有約50 %至約99. 9 %同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中將所述第10位上的氨基酸替換為絲氨酸，將所述第21位上的氨基酸替換為芳族氨基酸，將所述第33位上的氨基酸替換為天冬酰胺，以及將所述第37位上的氨基酸替換為芳族酸性氨基酸。
6.權(quán)利要求5所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中將所述第21位上的氨基酸替換為酪氨酸，以及將所述第37位上的氨基酸替換為酪氨酸。
7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID NO 30具有約60%至約99. 9% 同一性。
8.權(quán)利要求1至6中任一項所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列與SEQ ID NO 30具有約75%至約99. 9% 同一性。
9.權(quán)利要求1至8中任一項所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件顯示出對木質(zhì)素的結(jié)合降低。
10.權(quán)利要求1至9中任一項所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件，其中所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件使糖苷酶對木質(zhì)素的結(jié)合降低，所述糖苷酶包含由一個或更多個接頭肽連接的所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件、一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件。
11.經(jīng)修飾的糖苷酶，其包含一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件，其中 (a)所述一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件通過一個或更多個接頭肽功能性連接；以及(b)所述一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件中的至少一個是權(quán)利要求1至8中任一項所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件， 與親本糖苷酶相比，所述經(jīng)修飾的糖苷酶顯示出木質(zhì)素存在下的水解活性升高和/或?qū)δ举|(zhì)素的結(jié)合降低，所述親本糖苷酶包含由相同的一個或更多個接頭肽連接的衍生出所述經(jīng)修飾的碳水化合物結(jié)合組件的親本第I家族碳水化合物結(jié)合組件、相同的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域和相同的一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件。
12.權(quán)利要求11所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域選自纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域、β -葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域和輔助成分催化結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求12所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域是第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族糖苷水解酶的成員；所述半纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域是第5、8、10、11、26、43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的成員，所述β-葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域是第I或3家族糖苷水解酶的成員；以及所述輔助成分催化結(jié)構(gòu)域是膨脹因子、CIP或擴展蛋白催化結(jié)構(gòu)域。
14.權(quán)利要求13所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域是第6或7家族糖苷水解酶的成員。
15.權(quán)利要求14所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO :1(里氏木霉Cel6A)第83-447位氨基酸、SEQ ID NO :124(里氏木霉Cel7A)第1-436位氨基酸、SEQ ID N0:2(特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens) Avi2)第 97-460 位氨基酸,或 SEQID No :3(黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) Cel6A)第 81-440 位氛基酸。
16.權(quán)利要求15所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域包含含有選自以下的一個或更多個氨基酸替換的SEQ ID NO :1(里氏木霉Cel6A)第83-447位氨基酸Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E、L136V、L1361、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G2131D、A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q 和 R410S。
17.權(quán)利要求12所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述β-葡糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域是包含選自以下的一個或更多個氨基酸替換的SEQ ID No :100的里氏木霉Cel3A :V43X、V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、F260X、N369X、A386X 和 I543X。
18.權(quán)利要求12所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域來自真菌糖苷酶。
19.權(quán)利要求18所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述真菌糖苷酶來自木霉屬(Trichoderma ssp.)、曲霉屬(Aspergillus ssp.)、肉座菌屬(Hypocrea ssp.)、腐質(zhì)霉屬(Humicola ssp.)、脈抱菌屬(Neurospora ssp. )、Orpinomyces ssp.、赤霉菌屬(Gibberella ssp·)、裸胞殼屬(Emericella ssp.)、毛殼屬(Chaetomium ssp·)、金抱屬(Chrysosporium ssp·)、鍵刀菌屬(Fusarium ssp·)、青霉菌屬(Penicillium ssp·)、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌屬(Phanerochaete ssp.)、檢菌屬(Trametes ssp.)、埃杜拉香 (Lentinula edodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、煤油霉菌(Amorphotheca resinae)、白冬抱酵母(Leucosporidium scotti)、雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)、疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces lanuginosa)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophilum)或嗜熱側(cè)抱霉(Sporotrichum thermophile)。
20.權(quán)利要求19所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述真菌糖苷酶來自里氏木霉。
21.權(quán)利要求11至20中任一項所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域是野生型催化結(jié)構(gòu)域，或相對于野生型催化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸替換、插入或缺失的經(jīng)修飾的催化結(jié)構(gòu)域。
22.權(quán)利要求11至20中任一項所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中除所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件之外的所述一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件是野生型碳水化合物結(jié)合組件，或相對于野生型催化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸替換、插入或缺失的經(jīng)修飾的碳水化合物結(jié)合組件。
23.權(quán)利要求11至20中任一項所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述一個或更多個接頭肽是野生型接頭肽，或相對于野生型催化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸替換、插入或缺失的經(jīng)修飾的接頭妝。
24.權(quán)利要求23所述的經(jīng)修飾的糖苷酶，其中所述一個或更多個接頭肽是約6至約60個氨基酸長的經(jīng)修飾的接頭肽，并且其中至少約50%的氨基酸是脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，所述經(jīng)修飾的接頭肽相對于衍生出所述經(jīng)修飾的接頭肽的親本接頭肽包含一個或更多個導(dǎo)致以下結(jié)果的氨基酸替換、插入或缺失， (a)所述接頭肽的計算等電點降低；或 (b)所述接頭肽中蘇氨酸絲氨酸的比例增加；或 (c)(a)和(b) 二者； 所述經(jīng)修飾的接頭肽使所述經(jīng)修飾的糖苷酶與親本糖苷酶相比，木質(zhì)素存在下的水解活性升高和/或?qū)δ举|(zhì)素的結(jié)合降低，所述親本糖苷酶包含位于相同纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域與碳水化合物結(jié)合組件之間的所述親本接頭。
25.基因構(gòu)建體，其包含編碼權(quán)利要求1至10中任一項所述之經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的核酸序列。
26.基因構(gòu)建體，其包含編碼權(quán)利要求11至24中任一項所述之經(jīng)修飾的糖苷酶的核酸序列。
27.分離的經(jīng)遺傳修飾的微生物，其包含權(quán)利要求23所述的基因構(gòu)建體。
28.分離的經(jīng)遺傳修飾的微生物，其包含權(quán)利要求24所述的基因構(gòu)建體。
29.權(quán)利要求27或28所述的分離的經(jīng)遺傳修飾的微生物，其中所述微生物是細(xì)菌、酵母或絲狀真菌物種。
30.權(quán)利要求29所述的分離的經(jīng)遺傳修飾的微生物，其中所述微生物是鏈霉菌屬(Streptomyces)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、肉座菌屬(Hypocrea)、木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、鍵刀菌屬(Fusarium)、金孢霉屬(Chysoporium)或毀絲霉屬(Myceliophthora)的物種。
31.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1至10中任一項所述的經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的 方法，其包括以下步驟在誘導(dǎo)所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的表達(dá)和分泌的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求27所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物，并且從培養(yǎng)基中回收所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件。
32.用于產(chǎn)生權(quán)利要求11至24中任一項所述的經(jīng)修飾的糖苷酶的方法，其包括以下步驟在誘導(dǎo)所述經(jīng)修飾的糖苷酶的表達(dá)和分泌的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求28所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物，并且從培養(yǎng)基中回收所述經(jīng)修飾的糖苷酶。
33.用于將纖維素或半纖維素底物水解成糖的方法，其包括在木質(zhì)素存在下使所述底物接觸權(quán)利要求11至24中任一項所述的經(jīng)修飾的糖苷酶。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述纖維素或半纖維素底物是經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物。
35.權(quán)利要求33或34所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的糖苷酶與親本糖苷酶相比在所述方法中顯示出提高的回收率，所述親本糖苷酶包含相同的一個或更多個催化結(jié)構(gòu)域、一個或更多個接頭肽和一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件，其中所述一個或更多個碳水化合物結(jié)合組件中至少一個是衍生出所述經(jīng)修飾的糖苷酶中的所述經(jīng)修飾的第I家族碳水化合物結(jié)合組件的親本第I家族碳水化合物結(jié)合組件。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述方法以連續(xù)、半連續(xù)或補料分批方法進(jìn)行。
37.權(quán)利要求33所述的方法，其還包括糖到醇或糖醇的微生物發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的第1家族碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate binding module，CBM)，其在10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37位中的一個或更多個上包含氨基酸替換，所述位置通過第1家族CBM的氨基酸序列與SEQ ID NO30的比對來確定，并且與SEQ ID NO30有約50％至約99.9％的氨基酸序列同一性。還提供了包含經(jīng)修飾的第1家族CBM的經(jīng)修飾的糖苷酶、用于表達(dá)經(jīng)修飾的第1家族CBM或經(jīng)修飾的糖苷酶的基因構(gòu)建體和遺傳修飾微生物。在木質(zhì)素的存在下，經(jīng)修飾的第1家族CBM使得經(jīng)修飾的糖苷酶與木質(zhì)素的結(jié)合降低和/或水解活性增加，其可用于在木質(zhì)素的存在下水解纖維素或半纖維素的方法。
文檔編號C12N15/56GK103003421SQ201180009399
公開日2013年3月27日 申請日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者約翰·J·托馬舍克, 布賴恩·R·斯克特, 丹尼爾·科爾欽斯基 申請人:艾歐基能源公司