專利名稱：肌源性疾病檢測用標記物及使用其的檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種肌源性疾病檢測用標記物及使用其的檢測有無肌源性疾病的方法、特別是涉及一種檢測有無患有肌營養(yǎng)不良癥的方法。
背景技術(shù)：
肌營養(yǎng)不良癥作為肌源性疾病的一種，為由于骨骼肌的肌纖維變性或壞死而導致產(chǎn)生肌肉萎縮及肌肉力量下降的進行性的遺傳性疾病。根據(jù)遺傳類型及臨床癥狀，已知有假肥大型、貝克爾型、肢帶型、面肩肱型等各種病型(非專利文獻I)。肌營養(yǎng)不良癥的診斷由臨床癥狀、血液檢查、身體檢查、肌電圖檢查、肌肉活檢、基 因檢查等綜合進行。其中，血液檢查通過肌酸激酶、乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)或醛縮酶等酶量的測定來進行。血液檢查方法基于如下現(xiàn)象在肌細胞中大量含有的這些酶在肌營養(yǎng)不良癥患者中由于肌細胞的壞死而漏出至血液中、成為比健康狀態(tài)高的值。由于可進行末梢血中的檢測，因此，對于受試者的侵襲性低、測定方法也比較簡便，因此，可廣泛用于肌營養(yǎng)不良癥的診斷。其中，一般是對血清中的肌酸激酶值進行測定的方法(非專利文獻2)?？墒?，以肌酸激酶為代表的上述酶也由于運動負荷引起的肌細胞的壞死而大量漏出至血中，因此，受試者有無運動負荷，血清中的濃度會大幅變動。因此，即使是健康人肌酸激酶值等也顯示高值，因此，存在錯誤判斷的問題及為了正確判斷必須使采血前的受試者處于安靜狀態(tài)的煩惱?，F(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻I杉田秀夫，小澤英二郎，埜中征哉編輯，1995，新筋肉病學.南江堂，東京pp469-550非專利文獻2Sugita H.，等，1959，J. Biochem.，46 103-10
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供一種對受試者造成的侵襲性低、且相對于運動負荷穩(wěn)定性高的肌源性疾病檢測用標記物和使用其的肌源性疾病、特別是肌營養(yǎng)不良癥檢測方法。 用于解決課題的方法為了解決上述課題，本發(fā)明人等進行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有變異體的3種微小 RNA (miRNA)、即 miR-1、miR_133 (含有 2 個變異體 miR_133a 及 miR_133b)及 miR-206 的血中量與肌源性疾病、特別是肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)病密切相關，且?guī)缀醪皇苓\動負荷的影響。迄今為止，已知miR-1及miR-133在心肌、心房及骨骼肌中特異性表達，還有miR-206在骨骼肌中特異性表達(Kim等.,2006, J.Cell Biochem，174，677-687)，但這些miRNA的血中量在肌源性疾病發(fā)病個體中幾乎不受運動負荷的影響，關于可成為代替肌酸激酶的有用的檢測用標記物是完全未知的。本發(fā)明是基于該見解而完成的，即，提供以下內(nèi)容。(I) 一種檢測受試者中有無肌源性疾病的發(fā)病的方法,該方法含有對存在于從受試者采集的血液中的含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA中的至少一種的量進行測定的工序；將受試者的所述miRNA的血中量與健康個體的對應的miRNA的血中量相比統(tǒng)計學上顯著高的情況和該受試者患有肌源性疾病的情況相關聯(lián)的工序。(2)根據(jù)⑴所述的方法，其中，miRNA由序列號I 4所示的堿基序列組成。(3)根據(jù)(I)或⑵所述的方法，其中，受試者的所述miRNA的血中量為健康個體的該miRNA的血中量的5倍以上。(4)根據(jù)⑴ (3)中任一項所述的方法，其中，通過核酸擴增法或雜交法對miRNA的血中量進行定量。 (5)根據(jù)(4)所述的方法，其中，核酸擴增法為實時PCR法。(6)根據(jù)(I) (5)中任一項所述的方法，其中，所述血液是從運動負荷后的受試者米集的。(7)根據(jù)(I) (6)中任一項所述的方法，其中，所述肌源性疾病為肌營養(yǎng)不良癥。(8) 一種肌源性疾病檢測用標記物，該標記物由含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA組成。本說明書包括作為本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎的日本專利申請2010-041845號的說明書及/或附圖中所記載的內(nèi)容。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的肌源性疾病檢測用標記物，可以提供一種不受受試者的運動負荷的影響的肌源性疾病的發(fā)病檢測標記物。根據(jù)本發(fā)明的肌源性疾病的檢測方法，可以提供一種可以檢測該受試者中有無肌源性疾病發(fā)病的方法，所述方法對受試者造成的侵襲性低、且不受受試者的運動負荷的影響。


圖I表示mdx小鼠相對于BlO小鼠的各miRNA的血清中量的相對值；圖2是表示BlO小鼠及mdx小鼠的運動負荷后的經(jīng)過時間中的血清中的miR-1、miR-133a及miR-206量的變化的圖。所表示的為，將各小鼠的運動前及運動負荷后的各經(jīng)過時間中的血清中的miR-1、miR-133a及miR-206量用miR-16量校正后，相對于BlO小鼠的運動前的校正值的相對值。圖中，a表示miR-l、b表示miR_133a、c表示miR-206及d表示肌酸激酶(CK),另外，白圈/虛線表示BlO小鼠、黑圈/實線表示mdx小鼠；圖3是表示BlO小鼠及mdx小鼠的運動負荷后的經(jīng)過時間中的血清中的miR-1、miR-133a及miR-206量的變化的圖。所表示的為，將血清中的肌酸激酶(CK)、miR_l、miR-133a及miR-206用miR-16量校正后，運動負荷后的血清中量相對于各個運動負荷前的血清中量的相對值。圖中，a表示miR-l、b表示miR_133a、c表示miR-206及d表示肌酸激酶(CK)，另外，白圈/虛線表示BlO小鼠、黑圈/實線表示mdx小鼠；圖4表示肌營養(yǎng)不良癥模型犬CXMDj或其帶原犬出生后的血清中miRNA等的變化量。miRNA等的量是由用miRNA16的血清中的量校正后，相對于健康犬中的各自對應的miRNA等的對應的時期中的校正值的相對值表示。
具體實施例方式I.肌源性疾病檢測用標記物1-1.概要本發(fā)明的第I實施方式為肌源性疾病檢測用標記物。通過對本實施方式的肌源性疾病檢測用標記物即特定的miRNA的血液中的量進行測定，可以檢測有無肌源性疾病的發(fā)病、特別是肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)病。1-2.構(gòu)成
本發(fā)明的肌源性疾病檢測用標記物由含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA構(gòu)成。在本發(fā)明中，“肌源性疾病檢測用標記物”是指在受驗個體中成為檢測有無肌源性疾病的發(fā)病時的指標的物質(zhì)，在本發(fā)明中，在骨骼肌、心肌中特異性表達的特定的miRNA、SP以下具體地進行說明的miR-1、miR-133 (miR-133a及miR-133b)及miR-206是適用的。肌源性疾病檢測用標記物含有所述miRNA單獨或二種以上的組合中的任一種。在本發(fā)明中，“肌源性疾病”是指產(chǎn)生肌肉萎縮、肌肉力量下降的疾病。例如包括肌營養(yǎng)不良癥(包括假肥大型、貝克爾型、埃-德型、肢帶型、面肩肱型、眼咽型、先天性的各種肌營養(yǎng)不良癥)、肌病(先天性、遠端型、甲狀腺功能低下性、類固醇肌病等)、炎癥性肌病(包括多發(fā)性肌炎、皮膚肌炎)、Danon病(夕'' 7 >病)、肌無力綜合征、線粒體病、肌紅蛋白尿癥、糖原病、周期性四肢麻痹等。在本發(fā)明中，優(yōu)選的肌源性疾病為肌營養(yǎng)不良癥。“miRNA”是指存在于細胞內(nèi)的長度21 23堿基長的單鏈非編碼RNA。已知該小分子RNA與靶基因的mRNA、及蛋白質(zhì)因子結(jié)合而形成復合體，通過RISC(RNA誘導的沉默復合體)/miRNP的作用阻礙靶基因的翻譯，由此對靶基因的表達進行調(diào)節(jié)。miRNA在被稱為pri-miRNA的前體(前前體(前々軀體))狀態(tài)下從基因組轉(zhuǎn)錄后，在核內(nèi)利用被稱為Drosha的內(nèi)切核酸酶加工成被稱為pre_miRNA的前體，進而在核外通過被稱為Dicer的內(nèi)切核酸酶的作用而成為成熟體的miRNA (Bartel DP, 2004, Cell, 116 :281-297)。因此，在細胞內(nèi)通常可存在作為前體的pri-miRNA及pre-miRNA以及成熟miRNA。本發(fā)明的miRNA也包括miRNA前體及成熟miRNA中的任一種。優(yōu)選為成熟miRNA。由于成熟miRNA可直接有助于靶基因的表達控制。上述序列號I所示的堿基序列適用于人成熟miR-1、序列號2所示的堿基序列適用于人成熟miR-133a、序列號3所不的堿基序列適用于人成熟miR_133b、而且序列號4所示的堿基序列適用于人成熟miR-206。但是，在小鼠、大鼠、犬等許多哺乳類中，這些miRNA的堿基序列是完全保守的，因此，其不僅適用于人的成熟miRNA、而且也可適用于具有相同堿基序列的其它的生物物種的各成熟miRNA。如上所述，已知miR-1及miR-133在心肌、心房及骨骼肌中特異性表達，另外，miR-206在骨骼肌中特異性表達(Kim等.，2006，J. CellBiochem,174,677-687)。如上所述,本發(fā)明的miRNA包括前體(pri-miRNA、pre_miRNA)及成熟體中的任意一種。因此，本發(fā)明的肌源性疾病檢測用標記物也包括在其一部分中含有序列號I 4所示的堿基序列的各miRNA的前體。作為本發(fā)明的肌源性疾病檢測用標記物，更優(yōu)選由序列號I 4所示的堿基序列的各種成熟miRNA組成。1-3.效果根據(jù)本發(fā)明的肌源性疾病檢測用標記物，在后述的本發(fā)明的第2實施方式中可用作肌源性疾病檢測方法的檢測用標記物。2.肌源性疾病檢測方法2-1.概要本發(fā)明的第2實施方式為檢測在受試者中有無肌源性疾病、特別是肌營養(yǎng)不良癥發(fā)病的方法。本方法的特征在于，通過對存在于受試者的血液中的一種以上的特定的miRNA量、即第I實施方式的肌源性疾病檢測用標記物的量進行測定，可以檢測該受試者是否患有肌源性疾病。 2-2.構(gòu)成本發(fā)明的檢測方法含有測定工序及比較工序。以下，對各工序具體地進行說明。2-2-1.測定工序“測定工序”為對存在于從受試者采集的血液中的上述第I實施方式的肌源性疾病檢測用標記物、即對含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA的至少一種的量進行測定的工序。在本發(fā)明中，“受試者”是指供于有無肌源性疾病的發(fā)病的檢查的個體。成為受試者的生物為哺乳動物，優(yōu)選為人。在本發(fā)明中，“血液”包括全血、血漿及血清?？梢詾殪o脈血、動脈血、骨髓液或臍帶血中的任意一種。另外，“從受試者中采集的血液”是指從受試者直接采集的血液或間接采集的血液。這樣的血液包括從在采集前處于安靜狀態(tài)的受試者采集的血液及從運動負荷后的受試者采集的血液。在此所謂的“安靜狀態(tài)”是指如下狀態(tài)若為人，則將受試者置于橫臥或坐位的狀態(tài)，盡可能地停止骨骼肌的運動。另外，若為人以外的動物，則是指不使其過度的運動或不給予應激(7卜> 7 )的平穩(wěn)的生活狀態(tài)。進而，在本發(fā)明中，“運動負荷”是指不論受試者的姿勢，對骨骼肌給予積極的負荷。例如步行、行車、上下臺階等或運動是符合的。直接采集的血液例如包括如末梢血及骨髓液那樣將注射針等直接刺入受試者而采集的血液或如臍帶血那樣從分娩后的臍帶中直接采集的血液。在從受試者直接采集的情況下，只要為依據(jù)公知的方法采集的血液即可。例如可以為如下血液中的任意一種若為末梢血，則為對末梢部的靜脈等進行注射而采集的血液；若為臍帶血，則為將針刺入分娩后胎盤的娩出前的臍帶而采集的血液；另外，若為骨髓液，則為通過骨髓穿刺(標記(7 >夂))而采集的血液。從對受試者的侵襲性低、不用選擇采集的時期而可容易獲得的方面考慮，更優(yōu)選通過注射而采集的末梢血。間接采集的血液包括從在所述直接采集的全血中添加肝素等實施抗凝固處理后，或以血漿或者血清的形式分離后，從暫時通過冷藏或冷凍進行保存的血液中再采集的血液。作為本發(fā)明中的特征，可以舉出所述“從受試者采集的血液”而不論血液采集前受試者有無運動負荷。作為肌源性疾病的代表性疾病的肌營養(yǎng)不良癥的檢查中現(xiàn)有使用的肌酸激酶在運動負荷前后血中濃度大幅變動，因此，在采集血液時需要將受試者置于安靜狀態(tài)。但是，在本發(fā)明中，如下述的實施例I所示，第I實施方式的肌源性疾病檢測用標記物的血中濃度在運動負荷前后穩(wěn)定，因此,即使從運動負荷后(例如,負荷之后 24小時)的受試者采集的血液也可以使用。本發(fā)明的方法中使用的血液的容量為如下的量則足夠通常為50UL以上、優(yōu)選100 u L以上及500 u L以下、優(yōu)選ImL以下。從受試者采集的全血預先實施處理以使血液不會凝固。例如可以舉出預先在用于血液采集的注射器內(nèi)部等涂層肝素等抗凝劑或用抗凝血劑預先進行涂層的方法或在采集后的全血中添加抗凝劑的處理方法(此時，例如若添加肝素，則使最終濃度為10 100單位/mL即可)；預先將用所述抗凝劑等處理后的全血通 過適當?shù)乃俣冗M行離心，將該上清液以血漿的形式進行制備的方法或預先將全血放置成室溫后，通過適當?shù)乃俣冗M行離心，將其上清液以血清的形式進行制備的方法。本發(fā)明的“量”為表示血液中的肌源性疾病檢測用標記物的分量的術(shù)語。例如可以舉出如濃度之類的相對量或規(guī)定的容量的血液中所含的miRNA的絕對量。在本發(fā)明中，可以為相對量或絕對量中的任意一種。優(yōu)選為相對量。在本工序中，對存在于血液中的上述第I實施方式的肌源性疾病檢測用標記物的量進行測定的方法只要是可以對該標記物量進行檢測并定量的方法就沒有特別限定。例如可以舉出核酸擴增法、雜交法、或RNA酶保護法?！昂怂釘U增法”是指使用正向/反向引物試劑盒并利用核酸聚合酶使靶核酸的特定區(qū)域擴增的方法。例如可以舉出=PCR法(包括RT-PCR法)、NASBA法、ICAN法、LAMP (注冊商標)法(包括RT-LAMP法)。優(yōu)選為PCR法。這是由于PCR法為在該領域中最廣泛利用的方法，除試劑、試劑盒、及反應設備充足以外，開發(fā)有各種應用技術(shù)。在本發(fā)明中，靶核酸為miRNA，因此，通常可采用經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄反應(RT反應)的核酸擴增法、例如RT-PCR法或RT-LAMP法。另外，在本發(fā)明中，需要對存在于血液中的肌源性疾病檢測用標記物的量進行測定，因此，在核酸擴增法中，特別優(yōu)選使用例如實時PCR法之類的定量PCR法。實時PCR為在基因擴增反應過程中PCR產(chǎn)物被特異性熒光標記的反應體系，通過使用備有檢測熒光強度的裝置的循環(huán)變溫裝置進行PCR來進行解析。本方法在可以實時監(jiān)控且不需要對反應中的產(chǎn)物的量進行取樣且可以將其結(jié)果通過計算機進行回歸分析的方面優(yōu)異。作為對PCR產(chǎn)物進行標記的方法，例如有如TaqMan (注冊商標)PCR法之類的使用熒光標記后的探針的方法或使用與雙鏈DNA特異性結(jié)合的試劑的方法。TaqMan PCR法使用5’末端部被淬滅物質(zhì)修飾，另外3’末端部被熒光染料修飾的探針。通常5’末端部的淬滅物質(zhì)抑制3’末端部的熒光染料，但進行PCR時，該探針由于具有Taq聚合酶的5’ 一 3’外切酶活性而分解，由此解除淬滅物質(zhì)的抑制，因此，開始發(fā)出熒光。該熒光量反映PCR生成物的量。PCR產(chǎn)物到達檢測極限時的循環(huán)數(shù)(CT)和初始模板量處于逆相關的關系，因此，在實時測定法中，通過對CT進行測定來對初始模板量進行定量。若使用多階段的已知量的模板并測定CT來制作標準曲線，則可以算出未知試樣的初始模板量的絕對值。另外，也可以與以下說明擴增產(chǎn)物的雜交法組合來進行檢測、定量。另外，使用核酸擴增法的miRNA的具體的測定方法在下述的“2_3.方法”的項目中進行詳細敘述?！半s交法”是指如下方法使用具有與應檢測的靶核酸的堿基序列的全部或一部分互補的堿基序列的核酸片段作為探針，利用該核酸和該探針間的堿基配對對靶核酸或者該片段進行檢測、定量。雜交法已知有檢測方法不同的若干方法，但在本發(fā)明中，靶核酸為miRNA,因此，優(yōu)選例如RNA雜交法(RNA印跡雜交法)、RNA微陣列法、表面等離子體共振法或石英晶體微平衡法?！癛NA雜交法”為解析基因的表達的最一般的方法，即為如下方法將由試樣制備的RNA在變性條件下通過利用瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺凝膠等的電泳進行分離，轉(zhuǎn)印到(印跡)過濾器上后，對靶RNA使用具有特異的堿基序列的探針對該RNA進行檢測。通過將探針用如熒光染料或放射性同位素之類的適當?shù)臉擞浳镞M行標記，例如也可以使用化學發(fā)光(化學發(fā)光)攝影解析裝置(例如，LightCapture ；Atto公司)、閃爍計數(shù)器、成像分析儀(例如，富士膠片公司BAS系列)等測定裝置對靶RNA進行定量。RNA雜交法在該領域中為眾所周知的著名的技術(shù)，例如參照Sambrook, J.等.，(1989)MolecularCloning a Laboratory Manual Second Ed. ,Cold SpringHarbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, New York、分子生物學實驗方案(1997年)，西野、佐野共譯，丸善株式會社 即可?！癛NA微陣列法”為將DNA微陣列法應用于RNA的方法。為如下方法在基板上將與作為靶的核酸的堿基序列的全部或者一部分互補的核酸片段作為探針以高密度小斑點狀地進行配置、固相化，使含有靶核酸的試樣與其進行反應，利用熒光等對雜交于基底斑點的核酸進行檢測、定量。檢測、定量可以通過利用酶標儀或掃描儀對基于靶核酸等的雜交的熒光等進行檢測、測定來實現(xiàn)。RNA微陣列法在該領域中也為眾所周知的技術(shù)。例如可參考DNA微陣列法(DNA微陣列和最新PCR法(2000年)村松正明、那波宏之監(jiān)修、秀潤公司)
坐寸ο“表面等離子體共振(SPR :Surface Plasmon Resonance)法”為如下方法利用改變向金屬薄膜照射的激光的入射角度時在特定的入射角度(共振角)中反射光強度顯著衰減這樣的表面等離子體共振現(xiàn)象，對金屬薄膜表面上的吸著物高靈敏度地進行檢測、定量。在本發(fā)明中，例如在金屬薄膜表面固定具有與靶miRNA的堿基序列互補的序列的核酸探針，對其它的金屬薄膜表面部分進行封閉處理后，通過使從作為樣品的受試者中采集的血液向金屬薄膜表面流通來形成靶miRNA和核酸探針的堿基配對，可以由樣品流通前后的測定值的差異對靶miRNA進行檢測、定量。利用表面等離子體共振法的檢測、定量例如可利用Biacore公司市售的SPR傳感器進行。本技術(shù)在該領域中眾所周知。例如可參考永田和弘、以及半田宏，生體物質(zhì)相互作用的實時解析實驗法，施普林格東京，東京，2000。“石英晶體微平衡(QCM :Quarts Crystal Microbalance)法”為如下質(zhì)量測定法利用在安裝于石英振子的電極表面吸附物質(zhì)時，石英振子的共振頻率根據(jù)吸附物質(zhì)質(zhì)量減少的現(xiàn)象，通過共振頻率的變化量定量地捕獲極微量的吸附物。利用本方法的檢測、定量可與SPR法同樣地利用市售的QCM傳感器，例如利用固定于電極表面的具有與靶miRNA的堿基序列互補的序列的核酸探針和從受試者采集的血液中的靶miRNA的堿基配對對IE miRNA進行檢測、定量。本技術(shù)在該領域眾所周知,例如可參考J. ChristopherLove, L. A. Estroff, J. K. Kriebel, R. G. Nuzzo, G. M. Whitesides (2005) Self-AssembledMonolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review, 105 :1103-1169 ;森泉豐榮，中本高道，(1997)傳感器技術(shù)，昭晃堂。
上述雜交法中使用的探針使用具有與序列號I 4所示的堿基序列的全部或一部分互補的堿基序列的核酸片段即可。探針的堿基長度為8堿基以上，優(yōu)選為10堿基以上，更優(yōu)選為12堿基以上，進一步優(yōu)選為15堿基以上或總長度以下。構(gòu)成探針的核酸通常只要為DNA、RNA或其組合即可，但也可以根據(jù)需要在全部或一部分中含有PNA (肽核酸，PeptideNucleicAcid)、LNA(鎖核酸,Locked Nucleic Acid ;注冊商標)、磷酸甲酯型DNA、硫代磷酸型DNA、2^ -O-甲基型RNA等化學修飾核酸或模擬核酸或它們的組合。另外，雜交法中使用的探針可使用熒光染料(例如，熒光胺及其衍生物、若丹明及其衍生物、FITC、cy3、cy5、FAM、HEX、VIC)、淬滅物質(zhì)(TAMRA、DABCYL、BHQ-I、BHQ_2、或 BHQ-3)、生物素或者(鏈霉)親和素或磁珠等修飾物質(zhì)、或者放射性同位素(例如，32p、33p、35S)等進行修飾或標記。雜交優(yōu)選在嚴格的條件下進行。用于排除非特異性雜交的目的以外的核酸?！癛NA保護法”為如下方法使用具有與靶RNA互補的堿基序列的探針，進行靶RNA和探針的雜交，之后進行RNA酶處理，雜交而成的RNA避免了因RNA酶處理引起的降解，通過電泳進行分離、檢測，由此對靶RNA進行檢測、定量。對于利用電泳的分離及檢測的方法，基本與上述雜交法相同。
2-2-2.比較工序“比較工序”為將受試者的上述miRNA的血中量與健康個體的對應的miRNA的血中量相比統(tǒng)計學上顯著高的情況和該受試者患有肌源性疾病的情況相關聯(lián)的工序。通過該關聯(lián)，可判斷受試者是否患有肌源性疾病。即，受試者的特定的miRNA中至少一種的血中量與健康個體的對應的miRNA的血中量相比統(tǒng)計學上顯著高時，則可判斷該受試者患有肌源性疾病或在不遠的將來發(fā)病的可能性高?！吧鲜鰉iRNA的血中量”是指肌源性疾病檢測用標記物、即含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA至少一種的血液中的分量。在本發(fā)明中，“健康個體”是指與受試者同種，且明確至少未患有肌源性疾病的個體，優(yōu)選未患有任何疾病的健康的個體?！敖】祩€體對應的miRNA”是指與上述測定工序中所測定的受試者的miRNA相同的miRNA。例如在測定工序中以受試者的miR-1作為測定對象的情況下，對應的miRNA為健康個體的miR-1。本工序中使用的健康個體的miRNA的血中量可以利用在本發(fā)明的上述測定工序中與受試者的miRNA的血中量的測定一起測定的與其對應的miRNA的血中量，除此以外，也可以使用在與受試者的miRNA的血中量測定相同條件下預先測定的對應的miRNA的血中量。這樣，若預先將健康個體的肌源性疾病檢測用標記物即各miRNA的血中量作為標準值進行數(shù)據(jù)庫化，在每次進行受試者的肌源性疾病檢測用標記物的血中量的測定時不需要同時進行測定，因此較便利?！敖y(tǒng)計學上顯著”是指在對血中的上述對應的2個miRNA的量的差異進行統(tǒng)計學處理時，兩者間存在顯著的差異。具體而言，例如可以舉出危險率(顯著性水準)為5%、1%或小于O. 1%的情況。統(tǒng)計學處理的檢驗方法使用可判斷有無顯著性的公知的適宜檢驗方法即可，沒有特別限定。例如可以使用學生t檢驗法、多重比較檢驗法?！敖y(tǒng)計學上顯著高”，具體而言，是指例如受試者的肌源性疾病檢測用標記物的血中量為健康個體的對應的肌源性疾病檢測用標記物的血中量的5倍以上、優(yōu)選10倍以上。例如相對于健康個體的miR-1的血中濃度，受試者的miR-1的血中濃度以相對值計為5以
上即可。本發(fā)明中“關聯(lián)”是指將肌源性疾病檢測用標記物即miRNA的血中量的比較結(jié)果和肌源性疾病的發(fā)病或發(fā)病潛在性結(jié)合起來。根據(jù)本發(fā)明人等的研究，判明在患有肌源性疾病或在不遠的將來有可能發(fā)病的個體和健康個體之間，發(fā)現(xiàn)肌源性疾病檢測用標記物的血中量存在統(tǒng)計學上顯著的量的差異?；谠撘娊猓诒景l(fā)明中，在受試者中的肌源性疾病檢測用標記物的血中量與健康個體的對應的miRNA的血中量相比統(tǒng)計學上顯著高的情況下，判斷該受試者患有肌源性疾病或在將來發(fā)病的可能性高。在患有肌源性疾病或在將來發(fā)病的可能性高的受試者中，肌源性疾病檢測用標記物即全部的miRNA、特別是全部的成熟miRNA與健康個體相比顯著高。因此，只要構(gòu)成肌源性疾病檢測用標記物的至少I種以上的miRNA形成上述關聯(lián)，則可以判斷該受試者患有肌源性疾病或在將來發(fā)病的可能性高。為了排除誤檢測的可能性，優(yōu)選上述關聯(lián)對于二種以上的肌源性疾病檢測用標記物成立。
2-3.方法<使用實時PCR法的miRNA的血中量的測定>(I)自血液的RNA提取在所采集的血液為全血的情況下，可以制備成血清或血漿。在制備血清的情況下，將全血在室溫下放置20分鐘 I小時左右后，進行用冰預冷，在4°C下以2500rpm 4000rpm離心10分鐘 20分鐘，得到其上清液即可。另外，在制備血漿的情況下，將全血例如在4°C下以5000Xg離心15分鐘即可。為了從血液(全血、血漿、血清及其組合)中提取RNA，使用該領域中公知的RNA提取方法即可。例如可依據(jù) Sambrook, J.等·，(1989)Molecular Cloning a LaboratoryManual Second Ed. ， Cold SpringHarbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NewYork中記載的RNA提取法進行提取。RNA作為總RNA(Total RNA)制備即可。另外，也可以利用由各制造商市售的RNA提取試劑盒。這樣的市售的RNA提取試劑盒中例如也具有如可僅選擇性地提取小分子RNA之類的出于有效回收試樣中的微小RNA的目的而開發(fā)的試劑盒，其在本發(fā)明中也可優(yōu)選利用。具體而言，例如可以舉出mirVana microRNA分離試劑盒(Ambion公司)。在利用試劑盒的情況下，對于具體的方法，依據(jù)或基于試劑盒中附帶的方案進行即可。(2)實時 PCR 法如上所述，本發(fā)明中應檢測的核酸為成熟體僅為20堿基長的miRNA。因此，在經(jīng)由一般的RT反應的定量的核酸擴增法、例如實時RT-PCR法中，靶核酸過短而無法適當?shù)剡M行擴增。因此，在使用核酸擴增法對血液中的肌源性疾病檢測用標記物進行檢測的情況下，例如利用由制造商市售的試劑盒或特殊的引物進行擴增即可。作為一個例子，可以舉出由Life Technologies 公司市售的 Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays 試劑盒。若使用附屬于該試劑盒的各miRNA特異性的Looped RT引物，則可以在使目標的成熟miRNA有效地進行反轉(zhuǎn)錄后進行擴增，因此，是有用的。Looped RT引物自形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)是3’末端部分具有與靶成熟miRNA的3’末端區(qū)域互補的序列的多堿基突出而成的。該突出的3’末端部分與靶miRNA的3’末端區(qū)域進行退火后，用RT酶將靶miRNA延伸成模板。然后，通過將延伸產(chǎn)物作為模板進行通常的實時PCR，可以將靶miRNA特異性地擴增。
實時PCR的反應條件通常以公知的PCR法作為基礎，根據(jù)擴增的核酸片段的堿基長及模板用核酸的量以及使用的引物的堿基長及Tm值、使用的核酸聚合酶的最適反應溫度及最適PH等而變動，因此，根據(jù)這些條件適宜決定即可。作為一個例子，通常在94 95°C下進行5秒 5分鐘變性反應、在50 70°C下進行10秒 I分鐘退火反應、在68 72°C下進行30秒 3分鐘延伸反應并將其作為I個循環(huán)重復15 40個循環(huán)左右，最后可以在68 72°C下進行30秒 10分鐘的延伸反應。在使用上 述制造商市售的試劑盒的情況下，作為原則，依據(jù)試劑盒中附帶的方案進行即可。實時PCR中所使用的核酸聚合酶為DNA聚合酶、特別是耐熱性DNA聚合酶。這樣的核酸聚合酶市售有各種種類的聚合酶，也可以利用這些酶。例如可以舉出上述AppliedBiosystems TaqMan MicroRNA Assays 試劑盒(Life Technologies 社)中附帶的 Taq DNA聚合酶。特別在這樣的市售的試劑盒中附帶有最適于附帶的DNA聚合酶的活性的緩沖液等，因此，是有用的。2-4.效果根據(jù)本實施方式的檢測有無肌源性疾病的發(fā)病的方法，可以高靈敏度地檢測受試者有無肌源性疾病的發(fā)病且不受受試者的運動負荷的影響。在現(xiàn)有的利用血中肌酸激酶值的肌源性疾病發(fā)明的檢測方法中，因運動負荷引起的變動大，因此，為了進行正確的診斷，需要在采集血液等檢測用試樣前使受試者保持在安靜狀態(tài)。但是，這對受試者過度強制了運動限制，受試者的負擔大。因此，只要用本實施方式的檢測方法，則可以大大減輕采血前的受試者的負擔。根據(jù)本實施方式的檢測有無肌源性疾病的發(fā)病的方法，由于可用末梢血進行檢測，因此，在采集試樣時對受試者的侵襲性低。實施例[實施例I]<使用肌營養(yǎng)不良癥模型小鼠的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物的驗證>使用肌營養(yǎng)不良癥模型小鼠對本發(fā)明的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物和使用其的肌營養(yǎng)不良癥檢測方法的效果進行檢驗。(材料)肌營養(yǎng)不良癥的模型小鼠使用假肥大型肌營養(yǎng)不良癥的疾病模型即mdx小鼠(mdx/ΒΙΟ)(雄性個體；8周齡)。假肥大型肌營養(yǎng)不良癥因X染色體連鎖的隱性遺傳引起的抗肌萎縮蛋白基因的缺失而發(fā)病。另外，作為對照(健康個體)組，使用BlO小鼠(雄性個體；8周齡)。另外，mdx小鼠除抗肌萎縮蛋白基因的缺失以外，與BlO小鼠遺傳性的背景相同。(方法)采血及血清的制備將上述各小鼠搬入動物實驗設備內(nèi)后，為了減輕因移送及環(huán)境變化引起的應激，分成每I只一個籠子飼養(yǎng)I周以上。在對各小鼠給予運動負荷的I周前使用29G注射針和
O.5mL注射器，從尾動脈中采血100 μ L以上。然后，為了給予運動負荷，使用踏旋器(跑步機)使各小鼠以5m/分鐘跑5分鐘,然后每I分鐘以Im/分鐘進行加速使各小鼠跑15分鐘。通過與上述同樣的方法在運動負荷剛結(jié)束后(30分鐘以內(nèi)；在圖表中以Oh表示)、6小時后、48小時后進行采血。將采集的全血在室溫下放置30分鐘以上后，使用離心機(久保田2410)以3000rpm離心10分鐘，以血清的形式得到上清液。肌酸激酶活性的測定從各個血清中分別移出50 μ L,使用生物化學分析裝置(富士 Drychem System)對肌酸激酶活性進行測定。各種miRNA的血中量的測定· RNA 提取 使用Ambion mirVana microRNA分離試劑盒從各個殘留有樣品的50 μ L血清中提取總RNA，在最后使用50 μ L的洗脫液從柱中洗脫RNA，將其作為總RNA溶液。對于RNA的提取步驟，依據(jù)附帶的方案。·利用實時PCR的各種miRNA的定量使用5 μ L上述總RNA溶液，通過實時PCR對該洗脫液中所含的各成熟miRNA(mi-Rl :序列號 1，mi_R16、mi_R132、mi_R133a :序列號 2, mi_R133b :序列號 3，mi-R206 :序列號4)及核內(nèi)低分子RNA(snoRNA)之一即成熟sno202 (序列號5)進行定量。擴增反應使用 Applied Biosystems TaqMan microRNA assay 試劑盒(Life Technologies公司)。需要說明的是，miR-16在BlO及mbx中均普遍且充分地表達，兩者沒有表達量的差，因此，作為用于校正本實施例的各樣品中的總RNA量的內(nèi)源性對照使用。另外，miR-132已知進行神經(jīng)細胞特異性表達，因此，作為本實施例中的陰性對照使用。進而，sno202為通常用作小鼠的miRNA定量時的內(nèi)源性對照的RNA。對于基本的步驟，依據(jù)試劑盒附帶的方案。具體而言，如下所述。首先，對于反轉(zhuǎn)錄反應中的各種miRNA及snoRNA特異性的引物使用附屬于試劑盒的各成熟miRNA及成熟snoRNA特異的Looped RT引物。需要說明的是，人和小鼠中的上述成熟miRNA等堿基序列完全相同(參照miRBase ；http://www. mirbase. org/cgi-bin/browse. pi)。另外,反應試劑使用由 IOOmM dNTP ；0. 15 μ L/RT 酶(Superscript)；
I.0μ L/10XRT 緩沖液；1· 5μ L/RNA 酶抑制劑(RNasin) ；0. 188μ L/5X 上述引物；3. 0μ L/總RNA (2 μ g/ μ L) ;5. O μ L構(gòu)成的總量15. O μ L的反應溶液。對反轉(zhuǎn)錄反應的反應條件而言，在16°C下進行30分鐘退火反應、在42°C下進行30分鐘反轉(zhuǎn)錄反應、而且在85°C下進行5分鐘RT酶的失活，將得到的RT產(chǎn)物之后置于4°C下。接著，在核酸擴增反應中，使由TaqMan universal PCR master mixlO. O μ I (LifeTechnologies公司)/蒸餾水7. 5μ 1/20X引物組I. O μ I/上述RT產(chǎn)物I. 5μ I構(gòu)成的反應組成液在如下條件下進行反應，然后將擴增產(chǎn)物置于4°C下，所述條件為94°C下2分鐘，進行I個循環(huán)；及在68°C下15秒和在94°C下I分鐘，進行40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物的檢測及定量使用 Applied Biosystems 7900HT 實時 PCR 系統(tǒng)(Life Technologies 公司)。⑴小鼠血清中的miRNA量基于利用實時PCR得到的定量結(jié)果，對未給予運動負荷、即運動前的mdx小鼠的血清中的各種miRNA等的平均量(η = 5)進行檢驗。由將BlO小鼠的血清中的各miRNA量或snoRNA量設為I時mdx小鼠的血清中的對應的miRNA量或snoRNA量的相對值表示。
將結(jié)果示于圖I。已知miR-16、miR-132及sno202的血清中的量的相對值均約為1，與健康個體的量相比，幾乎沒有量的差異。另一方面，骨骼肌等中特異性表達的miR-1、miR-133a、miR-133b及miR-206的血清中的量與BlO的量相比，顯著高。因此，表明miR-1、miR-133a、miR-133b及miR-206可成為肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物。需要說明的是，對于miR-133a的變異體即miR_133b，其行為及功能幾乎相同，因此，在以下的實施例中，針對miR-133a進行表示。(2)運動負荷后的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物的變動(I)對從圖I的結(jié)果中選擇的miR-1、miR-133a及miR-206的運動負荷引起的血清中的量的變化進行檢驗。將通過實時PCR測得的運動前及運動負荷后的各經(jīng)過時間中的血清中的 miR-1、miR-133a 及 miR-206 的量用 miR-16 的量校正(算出各 miRNA 的 Ct/miR_16Ct)后，由相對于各個標記物候補的運動前的BlO小鼠中的校正值(設為I)的相對值，表示得到的各樣品的校正值。 將結(jié)果示于圖2。該圖針對血清中的miR-l(a)、miR-133a(b)、miR-206(c)及肌酸激酶(CK) (d)的BlO小鼠(白圈；虛線)及mdx小鼠(黑圈；實線)中的相對值進行表示。由該圖可知:血清中的miR-1、miR-133a及miR-206的量均為mdx小鼠比BlO小鼠高。另外，對在剛運動后變動的傾向而言，miR-1、miR-133a及miR-206也與肌酸激酶相同，但若其變化量、即變動幅度與肌酸激酶相比，則非常小。例如相對于運動前的運動負荷后的最大值對肌酸激酶而言為70倍以上，與此相對，對miR-1、miR-133a及miR-206而言僅為10倍以下。因此，確認即使在運動負荷后，這些miRNA也可成為肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物。(3)運動負荷后的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物的變動(II)進而，將運動負荷引起的血清中的量的變化用與miRNA或與肌酸激酶的各個運動前的相對值進行檢驗。與上述(2)同樣地將通過實時PCR測得的BlO及mdx小鼠的運動前及運動負荷后的各經(jīng)過時間中的血清中的miR-l、miR-133a及miR-206的量用miR-16的量校正(算出各miRNA的Ct/miR-16Ct)后，由得到的各樣品的運動負荷后的校正值相對于各個運動前的校正值、即對BlO而言相對于BlO的運動前的校正值、對mdx而言相對于mdx的運動前的測定值的相對值，檢驗其變化。將結(jié)果示于圖3。表明對mdx而言，肌酸激酶與運動前相比，顯示約增加70倍，與此相對，各miRNA的增加與肌酸激酶相比極小。因此，表明血清中的miRNA量與肌酸激酶相t匕，不易受運動負荷的影響。[實施例2]<使用肌營養(yǎng)不良癥模型的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物的檢驗>使用肌營養(yǎng)不良癥模型犬對本發(fā)明的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物及使用其的檢測方法的效果進行檢驗。mdx小鼠與人肌營養(yǎng)不良癥患者不同，未顯示步行困難等癥狀，但與mdx小鼠同樣地由于X染色體連鎖的隱性遺傳而缺失抗肌萎縮蛋白基因的肌營養(yǎng)不良癥犬，顯示與步行困難等的人類似的癥狀。因此，可以檢驗更接近人的效果。(材料)作為肌營養(yǎng)不良癥模型犬，使用在X染色體上的營養(yǎng)不良癥基因中具有異常的CXMDJ系統(tǒng)的比格犬、其帶原犬(在X染色體對的一方的營養(yǎng)不良癥基因中具有異常的雌性比格犬)及健康犬(在營養(yǎng)不良癥基因中沒有異常的比格犬)。
(方法)在各犬剛出生后(O天)、I天后、2天后、2 4周后、2 3月后、6 7月后、12月后、24月后分別使用29G注射針和O. 5mL注射器從前肢或后肢的皮靜脈中采血100 μ L以上。然后，通過與實施例I同樣的方法制備血清，暫時在_80°C下冷凍保存。實驗從各組中任意各抽取3 5個樣本進行使用。肌酸激酶活性、自血清的RNA提取和使用其的利用實時PCR的血清中的miRNA (miR-1、miR-16、miR-133a 及 miR-206)的定量基于實施例 I。(結(jié)果)將結(jié)果示于圖4。對該圖而言，與實施例I同樣地將利用實時PCR的CXMDJ系統(tǒng)個體及帶原犬的血清中的miR-l、miR-133a、miR-206及肌酸激酶的各個定量值用miR-16的定量值校正，將其校正值作為相對于健康個體中的對應的月齡的校正值的相對值表示。本發(fā)明的肌營養(yǎng)不良癥檢測用標記物即miR-1、miR_133a及miR-206的血清中的量均顯示與肌酸激酶的行為幾乎相同的變化。因此，表明即使在肌營養(yǎng)不良癥模型犬中，這些標記物也有效。將本說明書中引用的全部刊物、專利及專利申請直接作為參考而并入本說明書
中。權(quán)利要求
1.一種檢測受試者中有無肌源性疾病的發(fā)病的方法，所述方法含有對存在于從受試者采集的血液中的含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA中的至少一種的量進行測定的工序； 將受試者的所述miRNA的血中量與健康個體的對應的miRNA的血中量相比統(tǒng)計學上顯著高的情況和該受試者患有肌源性疾病的情況相關聯(lián)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，miRNA由序列號I 4所示的堿基序列組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，受試者的所述miRNA的血中量為健康個體的該miRNA的血中量的5倍以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的方法，其中，通過核酸擴增法或雜交法對miRNA的血中量進行定量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，核酸擴增法為實時PCR法。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項所述的方法，其中，所述血液是從運動負荷后的受試者米集的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6中任一項所述的方法，其中，所述肌源性疾病為肌營養(yǎng)不良癥。
8.—種肌源性疾病檢測用標記物，所述標記物由含有序列號I 4所示的堿基序列的miRNA組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種侵襲性低、且不受運動負荷的影響的高靈敏度的肌源性疾病的檢測方法。所述檢測方法對存在于受試者的血液中的miR-1、miR-133a、miR-133b及miR-206中的至少一種的量進行測定，在受試者的miRNA的血中量與健康個體的對應的miRNA的血中量相比統(tǒng)計學上顯著高時，判斷該受試者患有肌源性疾病。
文檔編號C12N15/113GK102753689SQ201180008730
公開日2012年10月24日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者橋戶和夫, 水野英哉 申請人:獨立行政法人國立精神·神經(jīng)醫(yī)療研究中心