專利名稱：馬克斯克魯維酵母來(lái)源的高表達(dá)啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)來(lái)源的新型高表達(dá)啟動(dòng)子、包含該啟動(dòng)子的重組多核苷酸、包含該重組多核苷酸的載體、通過(guò)將該重組多核苷酸或該載體導(dǎo)入酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體的目的基因的高表達(dá)方法、使用該轉(zhuǎn)化體的目的基因產(chǎn)物的制造方法。
背景技術(shù)：
隨著近年來(lái)基因重組技術(shù)的進(jìn)展，能夠使用大腸桿菌等微生物進(jìn)行各種有用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。但是，已知使真核生物來(lái)源的異種蛋白質(zhì)基因以大腸桿菌作為宿主進(jìn)行表達(dá)時(shí)，存在無(wú)法進(jìn)行正常的加工或糖鏈的添加等翻譯后的正常修飾的問(wèn)題。因此，作為真核生物的酵母較多用作宿主。作為宿主酵母，已知有例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)等(例如參考專利文獻(xiàn)I)。但是，異種蛋白質(zhì)在作為宿主的酵母中的表達(dá)量仍有改善的余地。使異種蛋白質(zhì)基因在宿主中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，將以能夠使該異種蛋白質(zhì)基因在可在宿主內(nèi)發(fā)揮作用的啟動(dòng)子的調(diào)控下工作的方式配置的重組多核苷酸導(dǎo)入宿主內(nèi)，使該異種蛋白質(zhì)在該轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性很大程度上決定異種蛋白質(zhì)的表達(dá)效率，因此，通常使用轉(zhuǎn)錄活性高的啟動(dòng)子。另外，優(yōu)選在所期望的時(shí)機(jī)誘導(dǎo)異種蛋白質(zhì)基因的表達(dá)。這是因?yàn)椋诶棉D(zhuǎn)化體進(jìn)行的發(fā)酵生產(chǎn)中，如果首先使轉(zhuǎn)化體盡可能多地增殖、然后使其表達(dá)該異種蛋白質(zhì)，則該異種蛋白質(zhì)的生成效率提高。作為轉(zhuǎn)錄活性高且能夠進(jìn)行誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，公知有半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在缺乏葡萄糖時(shí)受半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，在釀酒酵母等中，經(jīng)常使用GALl啟動(dòng)子、GAL2啟動(dòng)子、GAL3啟動(dòng)子、GAL5啟動(dòng)子、GAL7啟動(dòng)子、GALlO啟動(dòng)子等半乳糖代謝基因(GAL基因)的啟動(dòng)子(GAL啟動(dòng)子)(例如參考專利文獻(xiàn)2)。另外，馬克斯克魯維酵母為耐熱性酵母(例如非專利文獻(xiàn)I和2)。利用普通的酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液的溫度因發(fā)酵熱而上升，因此，為了持續(xù)進(jìn)行乙醇發(fā)酵，必須對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行冷卻。因此，在工業(yè)上進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)，大規(guī)模的冷卻設(shè)備和該冷卻所需要的巨大的能量成本是必不可缺的。但是，馬克斯克魯維酵母即使在48°C的高溫下也能夠進(jìn)行增殖(非專利文獻(xiàn)3和4)，因此，能夠高效地進(jìn)行乙醇發(fā)酵而不需要上述冷卻設(shè)備和能量成本。目前尚未獲知該馬克斯克魯維酵母的GAL啟動(dòng)子的序列?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開(kāi)2008-29239號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)2007-89512號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) I :Bioresource Technology (2007) 98, 3367-3374
非專利文獻(xiàn) 2 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79，339-354非專利文獻(xiàn)3 :Applied and Environmental Microbiology (2008) 74, 7514-7521非專利文獻(xiàn)4 :Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010)85, 861-86
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供作為馬克斯克魯維酵母來(lái)源的新型高表達(dá)啟動(dòng)子的GALl啟動(dòng)子、包含該高表達(dá)啟動(dòng)子的重組多核苷酸、包含該重組多核苷酸的載體、通過(guò)將該重組多核苷酸或該載體導(dǎo)入酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體的目的基因的高表達(dá)方法、使用該轉(zhuǎn)化體的目的基因產(chǎn)物的制造方法。
用于解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果成功地從馬克斯克魯維酵母中分離出GALl啟動(dòng)子，并且發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子能夠使目的基因在馬克斯克魯維酵母中顯著地進(jìn)行高表達(dá)，而且還能夠使目的基因在釀酒酵母中進(jìn)行高表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及(I) 一種高表達(dá)啟動(dòng)子，其包含下述中的任意一種多核苷酸(a)序列號(hào)I表不的多核苷酸；(b)與上述(a)的多核苷酸具有80%以上的同一丨I"生并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸；(c)序列號(hào)2表不的多核苷酸；(d)與上述(c)的多核苷酸具有80%以上的同一丨I"生并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸；(e)序列號(hào)3表不的多核苷酸；以及(f)與上述(e)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸。另外，本發(fā)明涉及(2) —種重組多核苷酸，其包含上述(I)所述的高表達(dá)啟動(dòng)子和以能夠在該啟動(dòng)子的調(diào)控下工作的方式配置的目的基因。此外，本發(fā)明涉及(3) —種載體，其包含上述⑵所述的重組多核苷酸。另外，本發(fā)明涉及(4) 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將上述(2)所述的重組多核苷酸或上述(3)所述的載體導(dǎo)入酵母中而得到；(5)如上述(4)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，酵母為選自由酵母屬(Saccharomyces)酵母和克魯維酵母屬(Kluveromyces)酵母組成的組中的任意一種酵母；(6)如上述(4)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，酵母為選自釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母中的任意一種酵母。此外，本發(fā)明涉及(7) —種目的基因的高表達(dá)方法，其特征在于，包括對(duì)上述(4廣(6)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。另外，本發(fā)明涉及(8) —種目的基因產(chǎn)物的制造方法，其特征在于，包括對(duì)上述(4廣(6)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的步驟和從培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體中回收目的基因產(chǎn)物的步驟。發(fā)明效果本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子不僅能夠使目的基因在馬克斯克魯維酵母中進(jìn)行高表達(dá)，而且還能夠使目的基因在其他酵母中進(jìn)行高表達(dá)。例如，在釀酒酵母中使用本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子時(shí)，與釀酒酵母的GALlO啟動(dòng)子相比，更能夠使目的基因進(jìn)行高表達(dá)。因此，使用本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子時(shí)，還能夠高效地制造目的基因產(chǎn)物。


圖I是表示馬克斯克魯維酵母的GALl啟動(dòng)子、GALlO啟動(dòng)子、GAL7啟動(dòng)子的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的圖。圖2是表示馬克斯克魯維酵母的GALl啟動(dòng)子(KmGALl啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的圖。圖3是表示用于確定KmGALl啟動(dòng)子的位置的表達(dá)分析試驗(yàn)的結(jié)果的圖。圖4是表示馬克斯克魯維酵母或釀酒酵母的KmGALl啟動(dòng)子的表達(dá)分析試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式I.本發(fā)明的啟動(dòng)子本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子的特征在于，(A)包含序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸，或者，(B)包含作為上述多核苷酸的突變體并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸。序列號(hào)I表示的多核苷酸為馬克斯克魯維酵母來(lái)源的GALl啟動(dòng)子，序列號(hào)2表示的多核苷酸為馬克斯克魯維酵母來(lái)源的GAL7啟動(dòng)子，序列號(hào)3表示的多核苷酸為馬克斯克魯維酵母來(lái)源的GALlO啟動(dòng)子。該本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子不僅能夠使目的基因在馬克斯克魯維酵母中進(jìn)行高表達(dá)，而且還能夠使目的基因在其他酵母中進(jìn)行聞表達(dá)。作為上述(B)的、包含作為序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸的突變體并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸的啟動(dòng)子(以下，也特別表示為“本發(fā)明的突變體啟動(dòng)子”)，有(a)與序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸；(b)包含在序列號(hào)I、2或3表示的多核苷酸中缺失、取代或添加I個(gè)或2個(gè)以上的核苷酸而得到的多核苷酸并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸；(C)在嚴(yán)格的條件下與序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸的互補(bǔ)多核苷酸雜交并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸。上述(b)中的“缺失、取代或添加I個(gè)或2個(gè)以上的核苷酸而得到的多核苷酸”是指缺失、取代或添加例如廣20個(gè)、優(yōu)選f 15個(gè)、更優(yōu)選f 10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選廣5個(gè)中的任
意數(shù)量的核苷酸而得到的多核苷酸。上述(c)中的“在嚴(yán)格的條件下”是指形成所謂的特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件，具體而言，可以列舉具有80%以上、優(yōu)選85%以上的同一性的DNA之間進(jìn)行雜交而同一性低于上述水平的DNA之間不進(jìn)行雜交的條件；或者，通常的Southern雜交的洗滌條件即65°C、1XSSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成為150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)、0. 1%SDS，或在與0. 1XSSC、0. 1%SDS相當(dāng)?shù)柠}濃度下進(jìn)行雜交的條件。雜交可以依據(jù)分子克隆第二版等中記載的方法來(lái)進(jìn)行。作為上述(c)中的“在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸”，可以列舉與作為探針使用的多核苷酸的互補(bǔ)多核苷酸具有一定水平以上的同一性的多核苷酸，可以優(yōu)選例示例如具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性的多核苷酸。需要說(shuō)明的是，序列號(hào)I表示的多核苷酸的758位 774位、779位 795位、804位 820位、825位 841位、860位 876位，序列號(hào)2表示的多核苷酸的718位 734位、753位 769位、774位 790位、799位 815位、820位 836位，序列號(hào)3表示的多核苷酸的939位 955位、954位 970位、988位 1004位分別為轉(zhuǎn)錄因子GAL4的結(jié)合部位。由于上述(A)的序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸的核苷酸序列是明確的，因此，例如可以使用馬克斯克魯維酵母的基因組DNA作為模板，通過(guò)使用基于該核苷酸序列而合成的寡核苷酸作為引物的PCR反應(yīng)而得到；或者也可以使用馬克斯克魯維酵母的基因組DNA 作為模板，通過(guò)使用基于該核苷酸序列而合成的寡核苷酸作為探針的雜交而得到。需要說(shuō)明的是，染色體DNA可以通過(guò)常規(guī)方法(例如，日本特開(kāi)2008-237024號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的方法)而獲得。寡核苷酸的合成可以使用例如市售的各種DNA合成儀，根據(jù)常規(guī)方法來(lái)合成。另夕卜，PCR反應(yīng)可以使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)制造的熱循環(huán)Gene AmpPCR系統(tǒng)2400，并使用TaqDNA聚合酶(寶生物公司制造)、K0D_Plus-(東洋紡織公司制造)等，根據(jù)常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。另外，上述的本發(fā)明的突變體啟動(dòng)子的多核苷酸的突變體也可以通過(guò)化學(xué)合成、基因工程方法、誘導(dǎo)突變等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法來(lái)制作。具體而言，可以通過(guò)使用使序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸與作為突變?cè)脑噭┙佑|而發(fā)生作用的方法、對(duì)序列號(hào)1、2或3表示的多核苷酸照射紫外線的方法、基因工程的方法等向上述多核苷酸中導(dǎo)入突變來(lái)獲得多核苷酸的突變體。作為基因工程方法之一的定點(diǎn)誘變法是能夠在特定的位置導(dǎo)入特定的突變的方法，因此有用，可以根據(jù)分子克隆第二版、Current Protocolsin Molecular Biology (最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)，附錄38，約翰威立父子出版公司(1987-1997)等中記載的方法來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性。某種多核苷酸在某種酵母中是否具有啟動(dòng)子活性可以通過(guò)公知的報(bào)告基因分析等容易地確認(rèn)，所述報(bào)告基因分析包括例如下述步驟制作將報(bào)告基因以能夠工作的方式連接到該多核苷酸的下游而得到的重組多核苷酸的步驟，通過(guò)將該重組多核苷酸轉(zhuǎn)化到該酵母中而得到轉(zhuǎn)化酵母的步驟，測(cè)定該報(bào)告基因在該轉(zhuǎn)化酵母中的表達(dá)程度的步驟。作為上述的“在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母”中的“除馬克斯克魯維酵母以外的酵母”，只要是除馬克斯克魯維酵母以外的種類的酵母則沒(méi)有特別限制，可以優(yōu)選例示乳酸克魯維酵母等除馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母；釀酒酵母等酵母屬酵母；白假絲酵母(Candida albicans)等假絲酵母屬酵母；魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)等接合酵母屬酵母；粟酒裂殖酵母等裂殖酵母屬酵母；巴斯德畢赤酵母等畢赤酵母屬酵母；等，其中，可以更優(yōu)選例示乳酸克魯維酵母等除馬克斯克魯維酵母以外的克魯維屬酵母；釀酒酵母等酵母屬酵母，其中，可以進(jìn)一步優(yōu)選例示釀酒酵母等酵母屬酵母，可以特別優(yōu)選例示釀酒酵母。本發(fā)明的聞表達(dá)啟動(dòng)子、后述的本發(fā)明的目的基因的聞表達(dá)方法中的“聞表達(dá)”、后述的本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物的制造方法中的“高效率”，優(yōu)選包括下述情況(X)在宿主為馬克斯克魯維酵母的情況下，將分泌型熒光素酶CLuc基因以能夠工作的方式連接到該啟動(dòng)子的下游而得到重組多核苷酸，將所得的重組多核苷酸導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母中而得到轉(zhuǎn)化體，將所得的轉(zhuǎn)化體在YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)中在28°C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)液中的分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/OD .Ul)* 25000以上，優(yōu)選為28000以上，更優(yōu)選為32000以上，進(jìn)一步優(yōu)選為34000以上；(Y)在宿主為除馬克斯克魯維酵母以外的酵母(優(yōu)選為釀酒酵母)的情況下，將分泌型熒光素酶CLuc基因以能夠工作的方式連接到該啟動(dòng)子的下游而 得到重組多核苷酸，將所得的重組多核苷酸導(dǎo)入該酵母中而得到轉(zhuǎn)化體，將所得的轉(zhuǎn)化體在YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)中在28°C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)液中的分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/OD ill)為1500以上，優(yōu)選為2000以上，更優(yōu)選為2500以上，進(jìn)一步優(yōu)選為3000以上，進(jìn)而，更優(yōu)選包括上述(X)并且包括上述(Y)。作為本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子、后述的本發(fā)明的目的基因的高表達(dá)方法中的“高表達(dá)”、后述的本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物的制造方法中的“高效率”的另一示例，優(yōu)選包括下述情況將在該啟動(dòng)子的下游以能夠工作的方式連接有分泌型熒光素酶CLuc基因的重組多核苷酸導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體在YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)中在28°C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)液中的分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/0D u I)相對(duì)于將在釀酒酵母的GALlO啟動(dòng)子的下游以能夠工作的方式連接有分泌型熒光素酶CLuc基因的重組多核苷酸導(dǎo)入釀酒酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體在YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)中在28°C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)液中的分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/0D u I)以比例計(jì)為10倍以上，優(yōu)選為20倍以上，更優(yōu)選為30倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選為40倍以上，最優(yōu)選為50倍以上。作為本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子、后述的本發(fā)明的目的基因的高表達(dá)方法中的“高表達(dá)”、后述的本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物的制造方法中的“高效率”的又一示例，優(yōu)選包括下述情況將在該啟動(dòng)子的下游以能夠工作的方式連接有分泌型熒光素酶CLuc基因的重組多核苷酸導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體在YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)中在28°C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)液中的分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/0D u I)相對(duì)于將該重組多核苷酸導(dǎo)入釀酒酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體在YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)中在28°C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)液中的分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/0D u I)以比例計(jì)為2倍以上，優(yōu)選為3倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選為4倍以上，最優(yōu)選為5倍以上。作為本發(fā)明中的多核苷酸，可以優(yōu)選例示互補(bǔ)的雙鏈多核苷酸，其中，可以特別優(yōu)選例示互補(bǔ)的雙鏈DNA。2.本發(fā)明的重組多核苷酸本發(fā)明的重組多核苷酸的特征在于，包含本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子和以能夠在該啟動(dòng)子的調(diào)控下工作的方式配置的目的基因。本發(fā)明的重組多核苷酸能夠通過(guò)本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子的活化使該目的基因所編碼的目的基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì)或肽)在半乳糖誘導(dǎo)下進(jìn)行聞表達(dá)。本發(fā)明中，“以能夠在本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子的調(diào)控下工作的方式配置的目的基因”是指，將本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子與該目的基因以通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子與本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子結(jié)合而誘導(dǎo)該目的基因的表達(dá)的方式進(jìn)行連接。作為上述“目的基因”，可以是任意的基因，可以優(yōu)選例示編碼某些有用蛋白質(zhì)的有用蛋白質(zhì)基因。作為有用蛋白質(zhì)基因，可以優(yōu)選例不纖維素酶基因、淀粉酶基因等糖基化酶基因或病毒疫苗蛋白質(zhì)的基因。
3.包含本發(fā)明的重組多核苷酸的載體包含本發(fā)明的重組多核苷酸的載體的特征在于，包含上述本發(fā)明的重組多核苷酸。本發(fā)明的載體可以將本發(fā)明的重組多核苷酸保持在宿主酵母中，或者可以為了表達(dá)目的基因而對(duì)酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中的載體可以為線性，也可以為環(huán)形。在宿主酵母為馬克斯克魯維酵母的情況下，即使是線性載體也能夠在染色體上以高頻率發(fā)生重組，結(jié)果，能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外，在環(huán)形載體的情況下，如果進(jìn)一步包含自我復(fù)制序列，則該載體能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)中進(jìn)行自主復(fù)制而保持在酵母細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果，能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)化。上述載體只要能夠使目的基因在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)則沒(méi)有特別限制，作為環(huán)形的質(zhì)粒載體，可以優(yōu)選例示例如PKDl等。4.本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的特征在于，通過(guò)將本發(fā)明的重組多核苷酸或本發(fā)明的載體導(dǎo)入酵母中而得到。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體能夠使目的基因在該細(xì)胞內(nèi)在半乳糖誘導(dǎo)下進(jìn)行高表達(dá)，通過(guò)對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，能夠高效地生成目的基因產(chǎn)物。作為制作本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體時(shí)使用的酵母的種類，沒(méi)有特別限制，可以優(yōu)選例示馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母等克魯維酵母屬酵母；釀酒酵母等酵母屬酵母；白假絲酵母等假絲酵母屬酵母；魯氏接合酵母等接合酵母屬酵母；粟酒裂殖酵母等裂殖酵母屬酵母；巴斯德畢赤酵母等畢赤酵母屬酵母；等，其中，可以更優(yōu)選例示馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母等克魯維酵母屬酵母；釀酒酵母等酵母屬酵母，其中，從目的基因的表達(dá)量特別高、目的基因產(chǎn)物的生成效率特別高的觀點(diǎn)出發(fā)，可以特別優(yōu)選例示馬克斯克魯維酵母。另外，由于馬克斯克魯維酵母具有耐熱性，因此，從能夠進(jìn)行高效的乙醇發(fā)酵而不需要對(duì)發(fā)酵熱進(jìn)行冷卻的設(shè)備和能量成本的觀點(diǎn)出發(fā)優(yōu)選。作為將本發(fā)明的重組多核苷酸或本發(fā)明的載體導(dǎo)入酵母中的方法，沒(méi)有特別限制，可以例示下述公知的方法利用病毒載體的方法、利用特異性受體的方法、細(xì)胞融合法等生物學(xué)方法；電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、超聲波基因?qū)敕ǖ任锢矸椒?；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法等化學(xué)方法；等，其中，從簡(jiǎn)單且通用性高的觀點(diǎn)出發(fā)，可以優(yōu)選例示脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。另外，本發(fā)明的重組多核苷酸或本發(fā)明的載體是否已被導(dǎo)入該酵母中可以通過(guò)目的基因容易地確認(rèn)，或者可以通過(guò)將目的基因以及標(biāo)記基因預(yù)先插入到本發(fā)明的重組多核苷酸或本發(fā)明的載體中并確認(rèn)該標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)等方法來(lái)容易地確認(rèn)。5.本發(fā)明的目的基因的高表達(dá)方法本發(fā)明的目的基因的高表達(dá)方法的特征在于，包括對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。作為“對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的方法”，只要能夠使該轉(zhuǎn)化體增殖則沒(méi)有特別限制，可以優(yōu)選例示例如下述方法在該轉(zhuǎn)化體能夠進(jìn)行增殖的溫度條件下(例如25 33°C，優(yōu)選為28 30°C )，在YPD培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的葡萄糖)中，振蕩培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如廣10天，優(yōu)選為I飛天，更優(yōu)選為廣3天)。6.本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物的制造方法本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物的制造方法的特征在于，包括對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的步驟和從培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體中回收目的基因產(chǎn)物的步驟。根據(jù)該制造方法，能夠以高效率制造目的基因產(chǎn)物。作為“從培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體中回收目的基因產(chǎn)物”的方法，只要能 夠回收目的基因產(chǎn)物則沒(méi)有特別限制，可以例示利用層析的方法、利用標(biāo)簽的方法等公知的方法。實(shí)施例I[從馬克斯克魯維酵母中分離KmGALl啟動(dòng)子]本發(fā)明人使用Genome Sequencer FLX系統(tǒng)(羅氏診斷公司)對(duì)馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的基因組序列獲得了基因組序列草圖。但是，在第一次測(cè)序中，只獲得了 GAL的部分序列。于是，使用更高性能的Genome Sequencer FLX Titanium(羅氏診斷公司)，由此，終于能夠獲得基因組序列草圖。為了從馬克斯克魯維酵母中獲得半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，本發(fā)明人基于釀酒酵母來(lái)源的公知的GAL1、GAL10、GAL7等的序列信息，對(duì)馬克斯克魯維酵母的基因組序列草圖進(jìn)行了檢索。結(jié)果，在馬克斯克魯維酵母的基因組序列草圖中發(fā)現(xiàn)了與釀酒酵母來(lái)源的GAL啟動(dòng)子具有較高同一性的序列，并分離出該序列。分離出的該序列的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示于圖I中。如圖I所示，與GALl啟動(dòng)子反向地配置有GALlO啟動(dòng)子、GAL7啟動(dòng)子，并且在GALl啟動(dòng)子與GALlO啟動(dòng)子之間發(fā)現(xiàn)了 GAL4結(jié)合部位。需要說(shuō)明的是，馬克斯克魯維酵母中的上述GALl啟動(dòng)子(KmGALl啟動(dòng)子)、GAL10啟動(dòng)子(KmGALlO啟動(dòng)子)、GAL7啟動(dòng)子(KmGALl啟動(dòng)子)的配置與釀酒酵母的上述啟動(dòng)子的已知配置相同。另外,通過(guò)使用此次分離出的序列中的GALl樣啟動(dòng)子的后述實(shí)施例2或?qū)嵤├?的實(shí)驗(yàn)表明，此次分離出的馬克斯克魯維酵母來(lái)源的GAL啟動(dòng)子組為GAL啟動(dòng)子。實(shí)施例2[KmGALl啟動(dòng)子的位置的確定]為了確定KmGALl啟動(dòng)子的位置，進(jìn)行了如下的表達(dá)分析試驗(yàn)。首先，準(zhǔn)備認(rèn)為包含KmGALl啟動(dòng)子的I. 4kb的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-1400、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-1400。接著，準(zhǔn)備使KmGALl_1400的5’末端缺失200個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-1200、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-1200。同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失400個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-1000、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-IOOO0同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失580個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-820、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl_820。同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失625個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-775、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-775。同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失650個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-750、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-750。同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失800個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-600、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-600。同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失1000個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-400、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl_400。同樣地，準(zhǔn)備使KmGALl-1400的5’末端缺失1200個(gè)堿基而得到的DNA序列(與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的-200、相當(dāng)?shù)男蛄?，將其命名為KmGALl-200。利用將分泌型熒光素酶CLuc基因以能夠工作的方式連接到GALl啟動(dòng)子的下游而得到的模板以及上述KmGALl-1400等9種DNA序列來(lái)進(jìn)行PCR合成。由此，得到在上述KmGALl-1400等9種DNA序列的下游分別以能夠工作的方式連接有分泌型熒光素酶CLuc基因的、KmGALl-1400-CLuc等9種重組DNA。將所得到的9種重組DNA分別導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母中，得到總計(jì)為9種的各轉(zhuǎn)化體。將該9種(每一種各兩個(gè)克隆)轉(zhuǎn)化體在YH)液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的葡萄糖)中在28°C下振 蕩培養(yǎng)48小時(shí)，然后，對(duì)各種轉(zhuǎn)化體采集5 u I培養(yǎng)液的樣品，測(cè)定分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU Relative Luciferase Unit，相對(duì)熒光素酶活性單位)。另外，使用YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)代替YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行同樣的振蕩培養(yǎng)，并測(cè)定分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量。上述結(jié)果示于圖3中。需要說(shuō)明的是，在KmGALl-1400等啟動(dòng)子名稱處各記載兩條的柱狀圖中，左側(cè)表示使用YPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖培養(yǎng)基)時(shí)兩個(gè)克隆的平均值，右側(cè)表示使用YPGal液體培養(yǎng)基(半乳糖培養(yǎng)基)時(shí)兩個(gè)克隆的平均值。由圖3的結(jié)果可知，在使用KmGALl-1400、KmGALl-1200、KmGALl-1000, KmGALl-820、KmGALl-775 的情況下，CLuc 的相對(duì)表達(dá)量及由培養(yǎng)基中的半乳糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)率均極高，而在使用KmGALl-750、KmGALl-600、KmGALI-400,KmGALl-200的情況下，與使用KmGALl-1400等的情況相比，CLuc的相對(duì)表達(dá)量明顯降低。由該結(jié)果表明，與圖2的KmGALl啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的_775 750相當(dāng)?shù)牟糠謱?duì)于啟動(dòng)子的活性特別重要，從而確定出KmGALl啟動(dòng)子的位置。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書中的“活性量”與“相對(duì)表達(dá)量”為相同的含義。實(shí)施例3[KmGALl啟動(dòng)子的表達(dá)分析]為了研究KmGALl啟動(dòng)子能夠使目的基因在馬克斯克魯維酵母中以何種程度進(jìn)行表達(dá)以及能夠使目的基因在除馬克斯克魯維酵母以外的酵母中以何種程度進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)行了如下的表達(dá)分析試驗(yàn)。首先，通過(guò)使用URA3-5’40-KmGAL10c2 引物(序列號(hào) 4)、15GKmGALl+22c 引物(序列號(hào)5)和馬克斯克魯維酵母來(lái)源的染色體基因組的PCR，得到KmGALl啟動(dòng)子(KmGALlp)的序列。接著，通過(guò)公知的轉(zhuǎn)化法制作下述4種轉(zhuǎn)化體。(I)通過(guò)將在KmGALlp的下游以能夠工作的方式連接有分泌型熒光素酶CLuc基因的KmGALlp-CLuc導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體(圖4的右端的KmGALlp)。(2)通過(guò)將在釀酒酵母來(lái)源的GALlO啟動(dòng)子的下游以能夠工作的方式連接有分泌型熒光素酶CLuc基因的ScGALlOp-CLuc導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體(自圖4的右端起第2位的ScGALlOp)。(3)通過(guò)將KmGALlp-CLuc導(dǎo)入釀酒酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體(自圖4的右端起第3位的 KmGALlp)。(4)通過(guò)將ScGALIOp-CLuc導(dǎo)入釀酒酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體(圖4的左端的ScGALlOp)。將上述各轉(zhuǎn)化體分別在YPD液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的葡萄糖)中在28 °C下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，然后，對(duì)各種轉(zhuǎn)化體采集5培養(yǎng)液的樣品，測(cè)定分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/0D *111)。另外，使用YPGal液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母提取物、2質(zhì)量％的多聚蛋白胨、2質(zhì)量％的半乳糖)代替YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行同樣的振蕩培養(yǎng)，并測(cè)定分泌型熒光素酶CLuc的相對(duì)表達(dá)量。上述結(jié)果示于圖4中。需要說(shuō)明的是，在KmGALlp等啟動(dòng)子名稱處各記載兩條的柱狀圖中，左側(cè)表不使 用YPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖培養(yǎng)基)時(shí)兩個(gè)克隆的平均值，右側(cè)表示使用YPGal液體培養(yǎng)基(半乳糖培養(yǎng)基)時(shí)兩個(gè)克隆的平均值。由圖4的結(jié)果可知，KmGALl啟動(dòng)子即使在釀酒酵母中也能夠在半乳糖誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，而且，在釀酒酵母中使用KmGALl啟動(dòng)子時(shí)CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/0D U I)(半乳糖誘導(dǎo)下)與使用ScGALIO啟動(dòng)子時(shí)相比，以比例計(jì)上升至約5倍。一般而言，從屬于與宿主所屬的種屬不同的種屬的生物中分離出的啟動(dòng)子大多不能在該宿主中作為啟動(dòng)子發(fā)揮作用。而且，該其他生物的啟動(dòng)子通常不會(huì)發(fā)揮出超過(guò)宿主來(lái)源的啟動(dòng)子的表達(dá)量。因此可以說(shuō)，馬克斯克魯維酵母來(lái)源的GALl啟動(dòng)子在釀酒酵母中顯示出比釀酒酵母來(lái)源的GAL10啟動(dòng)子高5倍的表達(dá)性是罕見(jiàn)的現(xiàn)象。而且，在馬克斯克魯維酵母中使用KmGALl啟動(dòng)子時(shí)CLuc的相對(duì)表達(dá)量(RLU/OD ill)(半乳糖誘導(dǎo)下)與在釀酒酵母中使用ScGALIO啟動(dòng)子時(shí)CLuc的相對(duì)表達(dá)量(半乳糖誘導(dǎo)下)相比，以比例計(jì)上升至50倍以上。由此可以說(shuō)，KmGALl啟動(dòng)子所具有的該高
表達(dá)性顯著。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明能夠特別有用地用于高表達(dá)目的基因和高生成目的基因產(chǎn)物的領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種高表達(dá)啟動(dòng)子，其包含下述(a廣(f)中的任意一種多核苷酸 (a)序列號(hào)I表不的多核苷酸； (b)與上述(a)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸； (c)序列號(hào)2表不的多核苷酸； (d)與上述(c)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸； (e)序列號(hào)3表不的多核苷酸；以及 (f)與上述(e)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在馬克斯克魯維酵母和除馬克斯克魯維酵母以外的至少一種以上的酵母中具有啟動(dòng)子活性的多核苷酸。
2.一種重組多核苷酸，其包含權(quán)利要求I所述的高表達(dá)啟動(dòng)子和以能夠在該啟動(dòng)子的調(diào)控下工作的方式配置的目的基因。
3.—種載體,其包含權(quán)利要求2所述的重組多核苷酸。
4.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將權(quán)利要求2所述的重組多核苷酸或權(quán)利要求3所述的載體導(dǎo)入酵母中而得到。
5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體,其特征在于,酵母為選自由酵母屬(Saccharomyces)酵母和克魯維酵母屬(Kluveromyces)酵母組成的組中的任意一種酵母。
6.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體,其特征在于，酵母為選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和馬克斯克魯維酵母中的任意一種酵母。
7.一種目的基因的高表達(dá)方法，其特征在于，包括對(duì)權(quán)利要求4飛中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
8.一種目的基因產(chǎn)物的制造方法，其特征在于，包括 對(duì)權(quán)利要求4飛中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，和 從培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體中回收目的基因產(chǎn)物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供作為馬克斯克魯維酵母來(lái)源的新型高表達(dá)啟動(dòng)子的GAL1啟動(dòng)子、包含該高表達(dá)啟動(dòng)子的重組多核苷酸、包含該重組多核苷酸的載體、通過(guò)將該重組多核苷酸或該載體導(dǎo)入酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體的目的基因的高表達(dá)方法、使用該轉(zhuǎn)化體的目的基因產(chǎn)物的制造方法。特征在于利用本發(fā)明的高表達(dá)啟動(dòng)子。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102782130SQ20118000859
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者井手政充, 星田尚司, 赤田倫治 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人山口大學(xué)