一株高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株及其啟動(dòng)子無(wú)縫插入方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法，所述高產(chǎn)酯酵母菌株通過(guò)將強(qiáng)啟子PGK1p精確插入親本酵母菌株醇乙?；D(zhuǎn)移酶基因(ATF1)ORF的5′端來(lái)獲得，啟動(dòng)子的精確插入通過(guò)融合PCR和酵母整合質(zhì)粒YIplac211來(lái)實(shí)現(xiàn)。構(gòu)建得到的高產(chǎn)酯酵母，在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，ATF1的mRNA表達(dá)量和醇乙?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)量分別是出發(fā)菌株的40和5倍；玉米濃醪發(fā)酵4天，總酯產(chǎn)量是親本的2.7倍，乙酸乙酯的產(chǎn)量是親本菌株的3.1倍。本發(fā)明構(gòu)建的酵母菌中基因組上無(wú)外源基因殘留，因此可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一株高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株及其啟動(dòng)子無(wú)縫插入方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一株高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株及其啟動(dòng)子無(wú)縫插入方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]酯類物質(zhì)作為白酒中含量最多的香氣成分之一，具有水果的芳香和口味，賦予了白酒豐富的水果香氣，在白酒的風(fēng)格和質(zhì)量方面起著重要的作用。我國(guó)名優(yōu)白酒中以乙酸乙酯(果香和菠蘿香)、己酸乙酯(甜蜜香、白蘭地香和果香)、乳酸乙酯和丁酸乙酯(蘋果香和果香)等乙酸酯為主，達(dá)總酯含量的80%以上。其中，乙酸乙酯是清香型，米香型，鳳香型,老白干香型等白酒的主體香味成分。Nordstrom對(duì)酯類的形成進(jìn)行過(guò)一系列的研究，證明酯主要是由醇?；D(zhuǎn)移酶或者其它酯合成酶在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)生物催化合成的。Yosh1ka和Hashimoto研究證實(shí),醇乙?；D(zhuǎn)移酶(AATase)是乙酸乙酯、乙酸異戍酯等乙酸酯類合成的關(guān)鍵酶，F(xiàn)ujii等人對(duì)此酶進(jìn)行了精制及測(cè)序工作，結(jié)果得到了三種不同的AATase:AATaseI, Lg-AATaseI 和 AATaseII,分別由 ATFU Lg-ATFl 和 ATF2 編碼。ATFl 和ATF2在釀酒酵母和啤酒酵母中均存在，但Lg-ATFl只存在于啤酒酵母中。
[0003]對(duì)于酯類的來(lái)源和調(diào)節(jié)，Lilly等在葡萄酒酵母中通過(guò)表達(dá)ATFl和ATF2基因，乙酸乙酯，乙酸異戊酯，乙酸苯乙酯和乙酸己酯的含量都相應(yīng)增加。且ATFl基因的作用大于ATF2基因。其中，ATFl的過(guò)表達(dá)使得乙酸乙酯，乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的濃度分別增加了 10倍，3.8-12倍和2-10倍。Versti^pen等通過(guò)對(duì)啤酒酵母的研究發(fā)現(xiàn)，ATFl和ATF2基因雙缺失啤酒酵母菌株(atfl Δ atf2 Δ )幾乎沒(méi)有乙酸異戊酯生成( <野生啤酒酵母菌株的4%)。同時(shí)證實(shí)ATFl基因的作用大于ATF2基因。在我國(guó)，張翠英等通過(guò)在啤酒酵母和黃酒酵母中過(guò)表達(dá)ATF1，乙酸乙酯產(chǎn)量分別提高了 11.5和20.9倍。對(duì)于通過(guò)提高編碼醇?；D(zhuǎn)移酶基因(ATFl)的表達(dá)來(lái)提高白酒中酯的含量的研究尚未報(bào)道。
[0004]改變啟動(dòng)子強(qiáng)度是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的重要途徑。傳統(tǒng)的啟動(dòng)子一步插入法，插入片段由標(biāo)記基因和兩端的側(cè)翼序列組成，通過(guò)側(cè)翼序列與插入位點(diǎn)兩測(cè)序列之間的同源重組實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子的插入。由于標(biāo)記基因不能重復(fù)使用和低的重組效率，一步插入法的應(yīng)用受到限制。重組酶介導(dǎo)的系統(tǒng)由于高的效率被廣泛用于基因敲除和啟動(dòng)子插入，例如Cre/Loxp系統(tǒng)等。通過(guò)轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記兩側(cè)帶有重組酶位點(diǎn)的啟動(dòng)子插入元件到酵母中，一步整合實(shí)現(xiàn)目的基因的插入，然后轉(zhuǎn)化一個(gè)編碼重組酶的質(zhì)粒，以實(shí)現(xiàn)抗性標(biāo)記的去除。在工業(yè)酵母的改造中，這個(gè)系統(tǒng)具有很高的效率，但是其會(huì)留下外源序列(單一 1xp位點(diǎn))，并且在進(jìn)行多基因操作時(shí)，留下的這些位點(diǎn)增大了發(fā)生染色體重排的可能性。融合PCR可以實(shí)現(xiàn)基因片段的無(wú)縫拼接，且不受有限的酶切位點(diǎn)選擇的限制，從而避免了傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中重復(fù)的酶切和連接操作。強(qiáng)啟動(dòng)子PGKlp (酵母磷酸甘油激酶,phosphoglyceratekinase)是釀酒酵母中常用的組成型啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明通過(guò)融合PCR介導(dǎo)的兩步整合方法實(shí)現(xiàn)了 PGKlp精確插入到目的基因ATFl的5'端，質(zhì)粒彈出后無(wú)任何外源基因殘留，構(gòu)建的自克隆高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株可安全用于工業(yè)生產(chǎn)。同時(shí)融合PCR介導(dǎo)的兩步整合方法可廣泛應(yīng)用于酵母及其他微生物啟動(dòng)子調(diào)控，促進(jìn)了基因精確修飾的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供了一株高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株。
[0006]所述高產(chǎn)酯酵母菌株是將PGKlp啟動(dòng)子精確插入到出發(fā)酵母菌株-釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的醇乙酸基轉(zhuǎn)移酶編碼基因(ATFl)的5'端所得。
[0007]所述ATFl基因其Gene ID為:854559，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
[0008]所述啟動(dòng)子PGKlp其Gene ID為:850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所
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[0009]本發(fā)明所解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株啟動(dòng)子無(wú)縫插入構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0010](I)PCR獲得突變ura3片段；將該片段導(dǎo)入出發(fā)酵母菌株中，獲得缺陷型菌株；
[0011](2)以菌株CICC32315的基因組為模板，PCR分別擴(kuò)增強(qiáng)啟動(dòng)子PGKlp，插入位點(diǎn)上游和下游同源臂序列，并通過(guò)融合PCR將三個(gè)片段無(wú)縫連接，將融合片段克隆至酵母整合質(zhì)粒上，獲得整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；
[0012](3)在整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的上游同源臂序列中，選擇單一酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒酶切線性化；
[0013](4)將步驟(3)獲得的線性質(zhì)粒導(dǎo)入⑴中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶(uracil)的酵母合成培養(yǎng)基篩選，獲得第一步整合重組的酵母突變株；
[0014](5)將步驟(4)中篩出的突變株經(jīng)5-氟乳清酸(5-F0A)合成培養(yǎng)基平板反向篩選獲得第二步整合重組的酵母突變株；
[0015](6)以菌株CICC32315的基因組為模板，PCR獲得正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到步驟(5)中二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標(biāo)記基因，即得所述高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株。
[0016]所述重組菌株可通過(guò)上述方法構(gòu)建。各步驟所涉及具體操作方法參考現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版,科學(xué)出版社，1995。
[0017]本發(fā)明所述釀酒酵母菌株可應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中。
[0018]本發(fā)明所述的釀酒酵母工程菌株，在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，mRNA表達(dá)量和醇乙?；D(zhuǎn)移酶分別是出發(fā)菌株的40和5倍；玉米濃醪發(fā)酵4天，總酯含量是親本菌株的2.7倍，乙酸乙酯的產(chǎn)量是親本菌株的3.1倍。
[0019]有益效果:
[0020]1、本發(fā)明提供一種高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，克服了普通釀酒酵母由于酯產(chǎn)量低引起的香味不協(xié)調(diào)的問(wèn)題。
[0021]2、本高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株是在保持優(yōu)良發(fā)酵性能的前提下，醇乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因ATFl的表達(dá)量顯著提高，為生產(chǎn)具有良好風(fēng)味的白酒奠定了理論基礎(chǔ)。具有重要的市場(chǎng)價(jià)值。促進(jìn)了優(yōu)良感官品質(zhì)的白酒的生產(chǎn)，同時(shí)為研究乙酸乙酯對(duì)白酒風(fēng)味協(xié)調(diào)性的影響奠定了基礎(chǔ)。
[0022]3、本發(fā)明提供的高效的啟動(dòng)子無(wú)縫插入方法，避免了酵母?jìng)鹘y(tǒng)基因啟動(dòng)子插入過(guò)程中篩選標(biāo)記殘留的問(wèn)題，滿足自克隆的條件，可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。并且本方法在基因精確修飾方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
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[0023]圖1為整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒YIplac211_UPD的構(gòu)建流程示意圖
[0024]圖2質(zhì)粒YIplac211_UPD與酵母基因組的兩步整合重組流程示意圖
[0025]圖3為發(fā)生第一步整合重組的菌株AY14-U3-Y的電泳驗(yàn)證圖:
[0026]泳道M 為 DNA maker ；
[0027]泳道1、2、3為使用YIP-UPD-F和YIP-UPD-R PCR驗(yàn)證結(jié)果，泳道1、2、3模板分別為 AY14-u3、AY14-U3-Y 和質(zhì)粒 YIP-UPD ；
[0028]泳道4、5、6為使用引物對(duì)YIP-UD-F和YIP-UD-R PCR驗(yàn)證結(jié)果，模板依次為AY14-u3、AY14-U3-Y 和質(zhì)粒 YIP-UPD ；
[0029]圖4為發(fā)生第二步整合重組的菌株AY14-U3-P的電泳驗(yàn)證圖:
[0030]泳道M 為 DNA maker ；
[0031]泳道1、2為使用引物對(duì)UD-F和UD-R的PCR驗(yàn)證結(jié)果，泳道I模板為AY14_u3，泳道2模板為AY14-U3-P ；
[0032]泳道3、4為使用引物對(duì)UP-F和UP-R的PCR驗(yàn)證結(jié)果，泳道3模板為AY14_u3，泳道4模板為AY14-U3-P ；
[0033]泳道5、6為使用引物對(duì)ro-F和ro-R的PCR驗(yàn)證結(jié)果，泳道5模板為AY14_u3，泳道6模板為AY14-U3-P ；
[0034]圖5為出發(fā)菌株和突變株靶位置的測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖
[0035]圖6為菌株ATFl的mRNA表達(dá)量和醇乙?；D(zhuǎn)移酶酶活
[0036]圖7為菌株酯的產(chǎn)量

【具體實(shí)施方式】
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[0037]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038]實(shí)施例1:高產(chǎn)酯釀酒酵母的構(gòu)建
[0039]本實(shí)例所用的出發(fā)菌株CICC32315。所述大腸桿菌DH5a購(gòu)自Takara公司。所述Yro培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基，所述酵母合成培養(yǎng)基(SD)成分為:2%葡萄糖、0.67%YNB,0.13%不含尿嘧啶的氨基酸混合物，固體培養(yǎng)基含2%進(jìn)口瓊脂粉。
[0040]根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)了下述引物。
[0041 ] 表1.本實(shí)施例中所用到的引物
[0042]

【權(quán)利要求】
1.一種無(wú)縫插入啟動(dòng)子的方法，是通過(guò)融合PCR介導(dǎo)的兩步整合法實(shí)現(xiàn)的，其特征在于，包括如下步驟: (1)PCR獲得突變ura3片段；將該片段導(dǎo)入出發(fā)菌株中，獲得缺陷型菌株； (2)PCR分別擴(kuò)增強(qiáng)啟動(dòng)子序列，插入位點(diǎn)上游和下游同源臂序列，并通過(guò)融合PCR將三個(gè)片段無(wú)縫連接，將融合片段克隆至酵母整合質(zhì)粒上，獲得整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒； (3)在整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的上游或下游同源臂序列中，選擇單一酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒酶切線性化； (4)將步驟(3)獲得的線性質(zhì)粒導(dǎo)入(I)中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基篩選，獲得第一步整合重組的突變株； (5)將步驟(4)中篩出的突變株經(jīng)5-氟乳清酸合成培養(yǎng)基反向篩選獲得第二步整合重組的突變株； (6)PCR獲得正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到步驟(5)中二步整合重組的突變株中，以回復(fù)突變的ura3標(biāo)記基因。
2.一株由權(quán)利要求1所述的無(wú)縫插入啟動(dòng)子的方法構(gòu)建的高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，是在酵母出發(fā)菌株中將強(qiáng)啟動(dòng)子PGKlp精確插入醇乙?；D(zhuǎn)移酶基因ATFl的5'端獲得，所述出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。
3.如權(quán)利要求2所述的一株高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，其特征在于，所述ATFl基因其Gene ID為:854559，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述強(qiáng)啟動(dòng)子PGKlp其GeneID為:850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
4.如權(quán)利要求2所述的一株高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，其特征在于，菌株構(gòu)建方法具體如下: (1)?0?獲得突變1!1^3片段；將該片段導(dǎo)入出發(fā)酵母菌株中，獲得缺陷型菌株； (2)以菌株CICC32315的基因組為模板，PCR分別擴(kuò)增強(qiáng)啟動(dòng)子PGKlp，插入位點(diǎn)上游和下游同源臂序列，并通過(guò)融合PCR將三個(gè)片段無(wú)縫連接，將融合片段克隆至酵母整合質(zhì)粒上，獲得整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；所述上游同源臂序列如序列表中SEQ ID N0:3所示，下游同源臂序列如序列表中SEQ ID N0:4所示； (3)在整合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的上游同源臂序列中，選擇單一酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒酶切線性化； (4)將步驟(3)獲得的線性質(zhì)粒導(dǎo)入(I)中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基篩選，獲得第一步整合重組的酵母突變株； (5)將步驟(4)中篩出的突變株經(jīng)5-氟乳清酸合成培養(yǎng)基反向篩選獲得第二步整合重組的酵母突變株； (6)以菌株CICC32315的基因組為模板，PCR獲得正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到步驟(5)中二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標(biāo)記基因，即得所述高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的一株高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，其特征在于，所述酵母整合質(zhì)粒為 YIplac211 質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的一株高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，其特征在于，所述單一酶切位點(diǎn)為 Nru I。
7.如權(quán)利要求4所述的一株高產(chǎn)酯的釀酒酵母菌株，其特征在于，所述線性質(zhì)粒導(dǎo)入缺陷型菌株的方法為醋酸鋰轉(zhuǎn)化法。
8.如權(quán)利要求2所 述的高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK104131005SQ201410390789
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】肖冬光, 張翠英, 陳葉福, 許海艷, 趙麗斌, 侯曉月, 陳迪迪, 董健 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)