專利名稱：用于抑制腫瘤細胞增殖的改進的組合物的制作方法
用于抑制腫瘤細胞增殖的改進的組合物發(fā)明所屬領(lǐng)域一般而言本發(fā)明屬于癌癥治療領(lǐng)域。更具體而言本發(fā)明涉及癌癥免疫療法，且更具體而言涉及用于抑制腫瘤細胞增殖的基于細胞的免疫療法。背景長久以來，疫苗被用于傳染病如病毒或細菌感染的預(yù)防。免疫系統(tǒng)的細胞介導(dǎo)手段普遍涉及提供給宿主防衛(wèi)能力、從感染中恢復(fù)并防止由同一抗原引起的再次感染。細胞介導(dǎo)免疫機制被認為對于癌癥也是有用的。樹突細胞(DCs)，最有效的抗原遞呈細胞(APC)，在免疫反應(yīng)的啟動和調(diào)節(jié)中起著核心作用。它們具有獨特的能力引導(dǎo)幼稚T細胞，并引起和誘導(dǎo)有效的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的反應(yīng)。DC前體細胞存在于循環(huán)的血液中，并能迅速被補充到感染或發(fā)炎的位點。 當DC前體細胞分化成未成熟DCs細胞時候，它們在開始和處理外源性蛋白質(zhì)抗體方面變得非常有效。對于各種成熟刺激，例如表達Toll樣受體(TLR)配體的細菌和病毒組分、炎癥性細胞因子和/或特異性T細胞相互作用(⑶40/⑶40-配體相互作用)，它們開啟分化過程導(dǎo)致抗原攝取和處理能力的降低，共-刺激和MHC分子表達的增強。重要地，由直接病原體識別(例如TLRs)或CD40結(jié)扎誘導(dǎo)的信號強度和持久性已經(jīng)顯示出是特異性DC功能的關(guān)鍵決定因素。因此DC在外周位點由激活因子最后誘導(dǎo)，從而實現(xiàn)一個或兩個互相排斥的功能——即，或為有效的T細胞相互作用而遷移到淋巴結(jié)(作為成熟遷移DCs)，或通過產(chǎn)生大量包括趨化因子和細胞因子(作為成熟的促炎性DCs)在內(nèi)的炎癥性介質(zhì)而決定微環(huán)境。已有的集中于DCs的癌癥免疫療法策略均基于一個前提一T細胞反應(yīng)的質(zhì)量主要取決于遷移DCs對次級淋巴器官中的T細胞處理和遞呈腫瘤抗原的能力，從而開創(chuàng)腫瘤特異性CTL反應(yīng)，其導(dǎo)致在腫瘤細胞上免疫學攻擊。來自不同小鼠腫瘤模型數(shù)據(jù)顯示出這些反應(yīng)可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的三種主要策略之一而被觸發(fā)。這些免疫治療抗癌策略現(xiàn)在被積極在人類中試驗但均僅有很有限的成功。第一種策略是使來自患有腫瘤的病人加載有抗原的遷移性DCs體內(nèi)激活和成熟，隨后將它們引入相同患者。典型地，抗原加載是通過將腫瘤相關(guān)抗原(溶解的腫瘤細胞、蛋白、多肽或編碼這些抗原的核酸)加入到單核細胞衍生的未成熟DCs，隨后用不同炎癥因子的組合使抗原加載DCs激活/成熟而完成的。重引入的DCs應(yīng)當遷移至引流淋巴結(jié)，在其中它們起動填充(prime)腫瘤-特異性T淋巴細胞。DC-起動的(primed)T淋巴細胞,尤其是CTLs，接著移至腫瘤位點，在其中它們隨后誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。然而，臨床中，在患者自己的體內(nèi)處理即自體情況下，DCs很耗時且使患者暴露于增大的感染風險中。另外，其中用腫瘤抗原脈沖觸發(fā)DCs并激活到有效遞呈腫瘤抗原的遷移性DCs的處理程序是冗長的。第二種主要的策略，它繞開了遷移性DCs來源的患者體內(nèi)增殖的需要，該策略包括給予腫瘤抗原，包括已輻照的同種異體腫瘤細胞，或編碼腫瘤抗原的質(zhì)粒，使其進入完整正常組織中，包括皮下或肌內(nèi)注射。腫瘤抗原輔以所謂的佐劑，目的在于引發(fā)DC-介導(dǎo)的體內(nèi)免疫反應(yīng)。最常見地，趨化因子、細胞因子或編碼這些因子的質(zhì)粒，和/或DC-成熟因子例如如腫瘤壞死因子a (TNF-α )，和/或TLR激動劑可用作佐劑。然而，給予外源腫瘤抗原是個繁冗的程序。第三種主要策略，也繞開了在第一種主要策略中所包括的遷移性DCs來源的患者體內(nèi)增殖的需要，并進一步繞開了第二種主要策略中所包括的外源腫瘤抗原的需要，涉及直接注射進入腫瘤中的一種佐劑。因此，佐劑旨在體內(nèi)靶向確定DCs而患者的腫瘤作為腫瘤相關(guān)抗原的來源。已經(jīng)測試的佐劑與第二種主要策略中描述的那些類似趨化因子、細胞因子或編碼這些因子的質(zhì)粒，和/或DC-成熟因子例如TNF-a，和TLR激動劑。然而，因為死亡數(shù)量不足，可行的腫瘤可能是用于補充未成熟DCs的腫瘤相關(guān)抗原的貧瘠來源，優(yōu)選地由激動劑誘導(dǎo)，腫瘤細胞可以被這些DCs吞噬。所有上述三種策略均已在人類腫瘤患者中進行了測試，但僅取得有限成功。因此，明顯的需要一種更有效的免疫療法和改善的治療癌癥的方法。
發(fā)明簡述相應(yīng)地，本發(fā)明通過提供一種能夠產(chǎn)生高水平所期望的趨化因子和白介素(IL-12)的促炎成熟樹突細胞，一種包含這種促炎樹突細胞的組合物，一種生產(chǎn)這種促炎樹突細胞的方法，所述促炎樹突細胞或所述組合物作為藥物的用途，以及所述樹突細胞或所述組合物用于治療癌癥的用途，來更好地試圖單獨地或以任何形式組合，來克服現(xiàn)有技術(shù)中上文所識別的缺陷，并解決至少上述一種問題。因此，在第一個方面，提供了一種通過用聚胞苷酸鈉鹽(poly-I :C)、雷西莫特(R848)和干擾素-Y (IFN-y)的物質(zhì)處理從而被刺激至體內(nèi)成熟的促炎樹突細胞(DC)。在第二個方面，提供了一種包含基于第一個方面的促炎性DC和外周血液單核細胞(PBMCs)的組合物。在第三個方面，提供了一種生產(chǎn)基于第一個方面的促炎性DC的方法。所述方法包括提供外周血液單核細胞(PBMCs)、從所述PBMCs中分離單核細胞、從所述單核細胞中產(chǎn)生未成熟DCs (iDCs)、以及通過將poly-I:C、R848和IFN-y添加到iDCs中誘導(dǎo)iDCs的成熟，從而獲得促炎性DC的步驟。在第四個方面，提供了生產(chǎn)基于第二個方面的組合物的方法。所述方法包括提供外周血液單核細胞(PBMCs)、獲得基于第一個方面的促炎性DC，以及混合所述PBMCs和所述促炎性成熟DC的步驟。在第五個方面，提供了基于第一個方面的促炎性DC或第二個方面的組合物用作藥物的用途。在第六個方面，提供了一種基于第一個方面的促炎性DC或第二個方面的組合物，在不同于促炎性成熟DC或PBMCs的來源的個體中用作藥物的用途。在第七個方面，提供了一種基于第一個方面的促炎性DC或基于第二個方面的組合物，用于治療癌癥的用途。在第八個方面，提供了一種基于第一個方面的促炎性DC，或基于第二個方面的組合物，在不同于促炎性成熟DC或PBMCs的源頭的個體中用作治療癌癥的用途。本發(fā)明的進一步的實施方式限定于從屬權(quán)利要求中。本發(fā)明不同于現(xiàn)有技術(shù)的地方在于它產(chǎn)生高水平的期望的細胞因子，例如趨化因子(c-x-c motif)配體9 (CXCL9)，又知為MIG、C-C motif趨化因子3 (CCL3)，又知為巨噬細胞促炎蛋白α (ΜΙΡ-Ια)，去除活性刺激后的腫瘤壞死因子a (TNF- a ), IL- I β,和IL-12，因此是適宜使用的，例如可通過注射，在無外源性成熟刺激因子存在的情況下。當對患者以同種異體方式，即患者不同于貢獻用于創(chuàng)造促炎性DC產(chǎn)生的促炎性DC、或PBMCs的供者，進行瘤內(nèi)注射時，這種促炎性DC將激活患者自身的DCs從而它們發(fā)展成腫瘤負載的遷移性DCs。這種效果是由于注射促炎性DC產(chǎn)生大量期望的細胞因子和IL-12，包括DC、NK細胞和記憶T細胞補充趨化因子MIP-I a /CCL3, NK細胞和記憶T細胞補充趨化因子MIP-I a /CCL9，以及NK激活趨化因子IL-12的組合的能力。此外，成熟DCs例如促炎性成熟DC，與未成熟DCs相比的一個好處就是能夠通過細胞-細胞接觸而加強NK細胞激活。這一促炎性DC的事實不受外源的強烈激活，例如成熟的影響，因子是有利的，因為在腫瘤中強烈的外源激活因子的存在可能另外地觸發(fā)患者自身瘤內(nèi)補充DCs成為患者特異性的即自身促炎性DCs而非成為期待的患者特異性遷移性DCs的分化。因此，為實現(xiàn)諸如CD86分子在成熟DC上的高表達，將可能需要至少18個小時的刺激，以便給予其最佳的能力來激活NK細胞?；诂F(xiàn)有技術(shù)，在18小時后，激活/成熟不能產(chǎn)生顯著量的IL-12。假若在僅8小時后中止激活，尚可保留產(chǎn)量。但是，這些DC沒有足夠時間來上調(diào)有關(guān)NK激活分子。 進一步，為了誘導(dǎo)強的免疫導(dǎo)致同種異體反應(yīng)性、對存在于自身MHCII類分子(稱為間接同種識別途徑)上的同種異體MHC-衍生的多肽特異性的CD4+T細胞的擴張，同種異體器官、組織或成熟DCs的移植是已知的。通過將同種異體促炎性DC用作瘤內(nèi)注射，DC將隨即被宿主免疫系統(tǒng)殺死(拒絕)，并從而變成高度免疫原性CD4+輔助T細胞抗原表位(同種異體MHC-衍生多肽)的來源，將被自身補充DCs捕獲，最可能的是將有助于打破腫瘤患者中對腫瘤抗原的CD8耐受性。因此，促炎性C將作為佐劑，而非作為遷移性DCs，和現(xiàn)有技術(shù)相比，這將是有利的和不同的。例如，假若前列腺素E2 (PGE2)被包括在不同的DC成熟混合物中，成熟的DC將變成遷移性DC，其迅速離開(腫瘤)注射位點，這在本發(fā)明的篇幅內(nèi)是不利的。通過使用同種異體DC即與來源或供者不相同的個體中，促炎性成熟DC或PBMCs，這些潛在的佐劑不再必須對每個特定病人單獨制備，允許以隨后的較低生產(chǎn)成本大量生產(chǎn)。另外，疫苗可以冷凍和通過長距離運輸，進一步增強了其商業(yè)可行性。附圖簡述通過下述本發(fā)明的實施方式的描述，將使得本發(fā)明這些或其它方面、特征和優(yōu)點更加明顯和得到闡釋，附圖用作參考，其中圖I是基于第三個方面的方法的示意圖；圖2是基于第四個方面的方法的示意圖；圖3顯示的是基于第一個方面，藉由促炎性成熟DC的CCL3/MIP_la產(chǎn)量(圖3C)、CCL5/RANTES (圖 3A)和 CXCL9/MIG (圖 3B)的圖表；圖4是基于第一個方面的顯不促炎性成熟DC的IL-12產(chǎn)量的圖表；圖5是基于第二個方面顯示由IL- I β和TNF-a組成的產(chǎn)量的圖表；圖6是基于第二個方面顯不由IL- I β和TNF-a組成的產(chǎn)量的圖表；圖7是基于第二個方面顯不由TNF-Y組成的產(chǎn)量的圖表；圖8是顯示不同物質(zhì)對iDCs的成熟的影響的FACS圖表；
圖9是顯示基于第一個方面的促炎性成熟DC的影響，或基于第二個方面的組合物對iDCs的成熟的影響的FACS圖表；

圖10是顯不對于一個實施方式研究中腫瘤體積的圖表；圖11顯示了在對于一個實施方式研究中組織病理學結(jié)果(原發(fā)腫瘤)的圖片；圖12顯示了在對于一個實施方式研究中組織病理學對照結(jié)果(原發(fā)腫瘤)的圖片;圖13顯示了在對于一個實施方式研究中組織病理學結(jié)果(繼發(fā)腫瘤)的圖片；以及圖14顯示了在對于一個實施方式研究中組織病理學對照結(jié)果(繼發(fā)腫瘤)的圖片。
實施方式的描述為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，下面將結(jié)合附圖進一步具體描述本發(fā)明的幾個實施方式。然而，本發(fā)明可以以各種形式實施，不應(yīng)當被解釋為僅限于本文所提出的實施方式。恰恰相反，提供這些實施方式是為了公開徹底和完整。這些實施方式不對本發(fā)明構(gòu)成限制，但本發(fā)明僅受附帶的專利權(quán)利要求的限制。進一步，在附圖所闡釋的特定實施方式的具體描述中所使用的術(shù)語并不意味著對本發(fā)明的限制。瘤內(nèi)注射佐劑旨在誘導(dǎo)有效地抗腫瘤免疫反應(yīng)，最可能必須在注射腫瘤中誘導(dǎo)3個事件，它們對于實現(xiàn)CTL介導(dǎo)的腫瘤根治都是重要的。首先，為了被暴露在腫瘤抗原中，未成熟DC (iDC)需要被補充給腫瘤。趨化因子MIP-1/CCL3具有很強的刺激補充iDC的能力，包括體內(nèi)瘤內(nèi)注射補充iDC，在本領(lǐng)域已經(jīng)被很好地建立。其次，為了使腫瘤抗原對補充的iDC來說是可用的，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是很重要的。在本領(lǐng)域為了實現(xiàn)這個存在多種不同的方法，包括觸發(fā)瘤內(nèi)補充并激活自然殺傷(NK)細胞的方法。NK-細胞介導(dǎo)敏感腫瘤細胞的初步殺傷，主要歸因于細胞凋亡的誘導(dǎo)，在不同小鼠模型中已經(jīng)重復(fù)地顯示出有效地喚起隨后的對親本NK細胞耐受的腫瘤細胞的腫瘤-特異性細胞毒性T細胞應(yīng)答的DC-介導(dǎo)的發(fā)展。已知NK細胞可表達趨化因子受體CXCR3，以及NK細胞的CXCR3-依賴性補充，這已經(jīng)在不同動物模型中得到證實。其中一個公知的CXCR3-配體是MIG/CXCL9，有證據(jù)顯示NK細胞在瘤內(nèi)注射MIG/CXCL9后得到累積。為了補充NK細胞從而有效殺死腫瘤細胞，NK細胞激活因子例如IL-12，一種潛在的NK細胞體外和體內(nèi)殺傷活力激活劑的存在，也最可能地是必要的。第三，必須誘導(dǎo)補充iDC成為成熟遷移性DC的成熟過程。病毒感染(一般導(dǎo)致Thl-衍生的免疫反應(yīng))的早期步驟通常和DCs和NK細胞兩者的局部補充和激活相關(guān)。在最近的研究中，使人類外周血液NK細胞暴露于IL-12或IL-4短時間短期(過夜)培養(yǎng)，調(diào)查了誘導(dǎo)DC成熟的能力。值得一提的是，僅有已用IL-12刺激的NK細胞能夠誘導(dǎo)實質(zhì)DC成熟過程。從而推論出與體內(nèi)響應(yīng)相一致，暴露于IL-12—段時間間隔的NK細胞可能傾向于為隨后在次級淋巴器官(5)中起動的Thl細胞選擇適宜的成熟DCs。這些人類體外數(shù)據(jù)與小鼠模型的體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示出的當隨著累積補充NK細胞后，在小鼠中注射抗原負載DC時，與沒有NK細胞補充的情況相比，Thl響應(yīng)變得顯著提高是線性一致的。Thl極化DC的成熟過程也已顯示出是藉由多克隆激活的T細胞產(chǎn)生的可溶性因子誘導(dǎo)的。用由抗-CD3-激活的T細胞，或藉由用抗CD3和抗CD28兩種刺激激活的T細胞的無細胞上清培養(yǎng)液制備的T細胞條件培養(yǎng)基(TCCM)對未成熟DC的處理已經(jīng)顯示出包含數(shù)種可溶性因子，包括⑶40-配體、TNF-α和andIFN-γ。與通過添加個體細胞因子或單核細胞-條件培養(yǎng)基的協(xié)同刺激分子的溫和的上調(diào)相反，用TCCM對未成熟DC的處理已顯示出以劑量依賴方式誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子表達的顯著增加。TCCM誘導(dǎo)這種表型改變的能力進一步通過對⑶40L、TNF-α和IFN-γ特異性的中和抗體而消除，表明TCCM中存在的這些因子主要被涉及在DC的成熟過程。重要地，TCCM處理的DC能夠產(chǎn)生高水平的Thl-衍生的IL-12。最后，已知在和抗原特異性⑶8+T細胞在引流淋巴結(jié)中的同源相互作用期間，⑶4+T細胞通過“幫助”遷移性DCs，在⑶8+CTL的起動、發(fā)展和記憶，以及存活中起著決定性作用。在癌癥免疫療法領(lǐng)域的很多研究依賴于對將提供對于CTL誘導(dǎo)所需的幫助的來自野生型腫瘤抗原的MHCII類多肽的⑶4+T細胞識別途徑。然而，由于DC4+T細胞對這些在腫瘤發(fā)展期間進化的自身蛋白的耐受誘導(dǎo)，來自腫瘤抗原的多肽提供的幫助將常常是微弱 的或缺乏的，這可能妨礙疫苗的治療效果。最近的發(fā)現(xiàn)證明向腫瘤免疫位點相關(guān)的自身蛋白中加入非自身CD4+T細胞輔助表位足以在小鼠模型中打斷對腫瘤相關(guān)抗原已建立的CD8耐受?？偲饋碚f，所有這些數(shù)據(jù)顯示旨在誘導(dǎo)有效的抗癌適應(yīng)性(T細胞介導(dǎo)的)免疫相應(yīng)的瘤內(nèi)注射佐劑應(yīng)具備高和持久的MIP-I α /MIP-I a /CCL3(DC、NK以及T細胞補充)、MIG/CXCL9 (NK細胞以及T細胞補充)，IL_12p70 (NK細胞介導(dǎo)的腫瘤抗原的釋放和NK細胞介導(dǎo)的遷移性DCs的成熟)的產(chǎn)量，并且最終，在引流淋巴結(jié)中腫瘤特異性CD8+T細胞的DC介導(dǎo)起動期間，免疫原性非自身蛋白質(zhì)的存在可作為CD4+T細胞輔助表位。人類單核細胞-衍生的DCs具有在用某些TLR-配體持續(xù)刺激期間產(chǎn)生高水平MIP-I a /CCL3、IL_12p70和MIG/CXCL9的潛力，這也導(dǎo)致它們的成熟。為了瘤內(nèi)注射這種持久激活促炎性成熟Cs，它們必須在瘤內(nèi)安置之前被洗滌。否則，同時給予的刺激劑(旨在誘導(dǎo)體內(nèi)促炎性DCs)將非?？赡芤矊?dǎo)致瘤內(nèi)補充未成熟DCs的強烈和持久的激活，導(dǎo)致它們分化成促炎性成熟DCs而非所期待的分化成遷移性成熟DCs。不幸地，已知成熟化刺激例如TLR4配體或⑶40L在當DCs已經(jīng)分化成成熟DCs (通常是在超過12小時刺激之后)的某些時間點上的中止會誘導(dǎo)促炎性細胞因子生產(chǎn)，包括IL-12的生產(chǎn)的快速下調(diào)。從而在誘導(dǎo)因子激活的中止之后，必須使用激活方法將DCs激活成促炎性成熟DC來維持期待的因子的持續(xù)生產(chǎn)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種生產(chǎn)促炎性成熟DC的方法，在撤去用強烈激活因子的持續(xù)刺激之后，從而使DCs擺脫刺激因子，令人驚訝地，這產(chǎn)生高水平的期待的趨化因子和IL-12。促炎性成熟DCs可以以一種同種異體方式給予患者，所述方式即給予與DC來源不相同的患者。促炎性成熟DCs可以和外周血液單核細胞(PBMCs)混合，從而形成一種組合物。促炎性成熟DCs可以涂覆超級抗原，例如金黃色葡萄球菌腸毒素B( SEB)，會引起PBMC群體范圍內(nèi)T細胞的多克隆激活。當給予患者時，促炎性成熟DCs或其組合物將誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，該反應(yīng)將導(dǎo)致將殺死腫瘤的針對腫瘤的細胞免疫反應(yīng)。
假若患者不是PBMCs的供者,或者不是作為這個,或者不是促炎性成熟DCs的來源，即它們是和患者同源異體的，則效果出奇的強烈。于是，促炎性成熟DCs或其組合物可用作非自身的CD4+T輔助型T細胞表位。促炎性成熟DCs或其組合物將通過促炎性成熟DCs產(chǎn)生高水平的相關(guān)趨化因子例如MIP-I a /CCL3，和通過細胞-細胞依賴性相互作用激活補充NK細胞的能力，以及促炎性成熟DCs產(chǎn)生高水平的細胞因子IL-12，導(dǎo)致患者自身用來自NK細胞-殺死腫瘤細胞的免疫原性腫瘤材料補充DCs的抗原負載的能力，從而有助于將患者自身的DC、NK細胞和T細胞吸引到注射位點。優(yōu)選地，將組合物100直接注射進入腫瘤。吸引DCs進入并遍布整個腫瘤的能力是重要的，因為在已研究的絕大多數(shù)癌癥患者中，發(fā)現(xiàn)DCs主要在腫瘤的外周，這可能限制了它們和腫瘤細胞的相互作用。重要地，趨化因子將患者自身循環(huán)DCs補充到腫瘤位點的能力使腫瘤細胞暴露于新近產(chǎn)生的/補充的DCs (與本處的DCs相反)，可能更少受到免疫抑制性腫瘤環(huán)境的影響。在基于附圖I的一個實施方式中，提供了一種方法10，其中外周血液單核細胞(PBMCs) 101被提供11，。從所述PBMCs 101中分離12出單核細胞102。從所述單核細胞102中產(chǎn)生13未成熟DCsl03，而iDCsl03的成熟過程是通過向iDCs 103中添加激活-誘導(dǎo)劑poly-I:C，R848和IFN-Y而誘導(dǎo)14的，隨后通過洗滌去除所有激活因子，從而得到不含刺激因子的促炎性成熟DC104。在一個實施方式中，iDCsl03成熟過程的誘導(dǎo)進一步包含添加至少選自由IFN-a、IL-ip和TNF-α組成的組中的至少一種物質(zhì)。在一個實施方式中，iDCs的產(chǎn)生13是通過在包含IL-4和GM-CSF的水相培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細胞2到7天，例如3到5天，或3到5天而誘導(dǎo)的。在基于附圖2A的一個實施方式中，提供了一種生產(chǎn)組合物100，例如促炎性成熟 DCsl04和PBMCslOl的共培養(yǎng)的方法20。該方法包括提供21外周血液單核細胞(PBMCs)101，獲得22促炎性成熟DCsl04，并混合23所述PBMCslOl和所述促炎性成熟DCsl04。在基于附圖2B的一個實施方式中，生產(chǎn)組合物100的方法20進一步包括在混合之前用超級抗原200對促炎性成熟DC103進行處理22b的步驟。上述實施方式將在下文中進一步進行描述。實驗下述實驗例的具體實施方式
意圖并非對本文中列出的特定形式的限制。相反，本發(fā)明僅由附帶的權(quán)利要求限制，與上述具體實施方式
相比，其他可能等同的實施方式也落入附帶的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。PBMC和單核細胞的分離外周血液單核細胞(PBMCs) 101是從從獲自健康供者(薩爾格林斯卡醫(yī)院，哥德堡，瑞典)外周血液中使用人淋巴細胞分離液通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的密度梯度離心法而分離的。PBMCslOl被重懸浮于Cellgro培養(yǎng)基(德國，弗萊堡，Cell Genix公司)中，至終濃度為25X106/mL，隨后于平底24-阱(lml/講)37°C、6% CO2培養(yǎng)。2小時后，除去未粘結(jié)細胞，用PBS洗滌保留的粘結(jié)性細胞兩次，得到分離的單核細胞102 (主要由CD14+細胞組成)
DCs的產(chǎn)生為了使單核細胞102分化成未成熟DCsl03，將從分離步驟得到的單核細胞102在新鮮水相培養(yǎng)基例如Cellgro培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在3或5天內(nèi)補充誘導(dǎo)劑即1000U/mL的重組人類IL-4和1000U/mL的重組人類GM-CSF(均來自德國弗萊堡，Cell Genix公司)。在IL-4和GM-CSF中的單核細胞-衍生的未成熟DCs (iDCs)103是一個公認的體內(nèi)模型，細胞可以看做類同與外圍組織DCs。DCs的成熟用IL-4和GM-CSF補充，在Cellgro培養(yǎng)基中培養(yǎng)3或5天后，或向培養(yǎng)基中添加20 μ g/mL polyLC (德國施泰因海姆，Sigma公司)，一種對TLR-3受體有特異性的免疫刺激劑也就是聚肌胞聚胞苷酸或聚肌胞-聚胞苷酸鈉鹽，以及25 μ g/mL R848 (德國施泰因海 姆，Sigma公司),toll樣受體7/8-配體又稱為雷西莫特,或添加polyLC和R848,并補充1000U/ml干擾素y(IFN-Y，R&D systems,明尼阿波利斯市，美國)的組合，來誘導(dǎo)未成熟DCsl03的成熟。培養(yǎng)18小時后，洗滌細胞三次，進而在新的培養(yǎng)基(未添加外源激活因子)中培養(yǎng)24小時,從而獲得基于一個方面的促炎性成熟DC104。可用基于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的規(guī)程來從培養(yǎng)基中獲取培養(yǎng)基上清液?？蓪ι锨逡哼M行下文所述的ELISA分析，從而分析趨化因子CCL3/MIP-1 a、CCL5/RANTES, CXCL9/MIG、CCL2/單核細胞趨化蛋白_1 (MCP-I)，以及細胞因子白介素12(IL_12)的水平。DC和PBMCs的共培養(yǎng)基于上述方式獲得PBMCs 101，同樣基于上述方式獲得促炎性成熟DC 104。為了實現(xiàn)來自PBMCs 101的T細胞的快速成熟和多克隆激活，在培養(yǎng)步驟于洗滌之前30分鐘將0. 01yg/mLSEB(R&D systems,明尼阿波利斯市，美國)加入到DC培養(yǎng)基中。用PBS洗滌三次后，用IX IO6細胞/mL的同種異體PBMCs (分離自如前所述的健康供者的外周血液)和促炎性成熟DC104 (2. 5X IO5細胞/mL)在總體積為ImL中共培養(yǎng)24小時。收獲來自促炎性成熟DC 104和同種異體PBMCs的共培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上清液，所謂的MLR上清液，隨后于_80°C貯存。其后對上清液中存在的公知的DC-激活/成熟因子IFN- Y , TNF- α和IL-I β按照下文所述ELISA方法進行分析。如下文所述，對上清液也進行了 iDCs表型成熟誘導(dǎo)的研究。ELISA通過使用來自明尼阿波利斯的R&D systems公司的Duo Set ELISA DevelopmentSystem,基于生產(chǎn)商說明的酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISA)，來測定CCL3/MIP-1 α、CCL5/RANTES, CXCL9/MIG、CCL2/MCP-1、IL-12, TNF- α、IL-I β 和 IFN- γ 水平。表型成熟檢驗單核細胞衍生的樹突細胞103 (iDCs)如上面描述那樣產(chǎn)生。在補充了 IL_4和GM-⑶F的Ce I Igro培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，未成熟的DCs 103細胞在300 μ I上述的MLR上清液和100 μ I新鮮Cellgro培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24小時。以沒有額外補給的DCs培養(yǎng)作為對照。為確定MLR上清液是否能誘導(dǎo)成熟，將PE抗人⑶86結(jié)合FITC抗人⑶83染色樣品。染上FITC和PE的小鼠IgGl和IgG2作為同種型對照(均來自美國加利福尼亞BD Biosciences公司)。用流式細胞術(shù)(FACS)使用細胞尋找軟件(美國加利福尼亞BD Biosciences公司)分析樣品。結(jié)果下面對來自實驗部分的結(jié)果進行評論。令人滿意的炎性趨化因子的持續(xù)產(chǎn)生如圖3所示，假如在和TLR刺激即成熟的誘導(dǎo)14混合之前，iDCs已經(jīng)在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)5天，則與在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)3天相比，來自3個所調(diào)查的血液供者的，促炎性成熟 DC 104 所產(chǎn)生的 CCL3/MIP-1 α (圖 3C)、CCL5/RANTES(圖 3Α)和 CXCL9/MIG(圖3Β)將會升高。另外，添加IFN-Y的復(fù)合TLR刺激產(chǎn)生最高水平的CCL3/MIP-1和CXCL9/MIG，而CCL5/RANTES的產(chǎn)量不受添加IFN-γ的影響。因此，促炎樹突細胞(DC)，已經(jīng)通過用聚肌胞-聚胞苷酸鈉鹽(poly-I:C)、雷西莫 特(R848)和干擾素Y (IFN-γ)的物質(zhì)處理從而刺激至體內(nèi)成熟。在一個實施方式中，用至少一種選自由干擾素a (IFN-α )、白介素l、beta(IL_l β )和腫瘤壞死因子(TNF-α )組成的組中組成的組的物質(zhì)對促炎樹突細胞(DC)進行額外的刺激。值得注意的是，相關(guān)趨化因子的記錄的最高水平是在撤去成熟化刺激后產(chǎn)生的。這種促炎成熟DC104不受強烈的外源激活，例如成熟化、各因子影響的事實是有利的，因為在腫瘤中強烈外源激活因子的存在可能在其他方面觸發(fā)患者自身瘤內(nèi)補充DCs向患者特異性即自身促炎性DCs的分化，而非所期望的患者的特異性遷移性DCs。在撤去刺激24小時后的期間，促炎性成熟DC產(chǎn)生至少25000pg IL-12/mL/lO6細胞，例如 120000pg/mL/106 細胞，至少 IOOOOOpg CXCL9/mL/106 細胞，例如 400000pg/mL/106細胞，以及至少40000pgCCL3/mL/106細胞，例如180000pg/mL/106細胞。促炎性成熟DC也可產(chǎn)生CCL5/RANTES，在撤去刺激24小時后的期間，產(chǎn)生例如17500pg/mL/106 細胞。如ELISA分析所得，沒有發(fā)現(xiàn)可檢測水平的(檢測水平312pg/mL)CCL2/MCP_l (數(shù)據(jù)未顯示)。附圖3顯示的是CCL3/MIP-1 α (附圖3C)、CCL5/RANTES(附圖3Α)和CXCL9/MIG(附圖3Β)的水平。結(jié)果顯示的是三個個體的平均值土SD。Y-軸顯示的是在撤去刺激24小時后的期間，以pg/mL/2. 5 X 10+細胞計的所產(chǎn)生的各種物質(zhì)的量。X軸顯示的是測量的不同組合。IL-12p70的持續(xù)產(chǎn)生由于組合了 TLR刺激即成熟的誘導(dǎo)14，無論發(fā)現(xiàn)在促炎性成熟DC104中有或沒有IFN-Y的并發(fā)刺激從而誘導(dǎo)持久和強烈的NK細胞補充趨化因子(CCL3/MIP-1、CCL5/RANTES和CXCL9/MIG)的產(chǎn)生，調(diào)查此類DCs是否同時能夠釋放IL-12，例如IL_12p70，一種公知的NK-細胞激活因子是有益的。如附圖4中所示，在撤去成熟刺激例如激活誘導(dǎo)劑之后，顯示了 TLRs (例如R848和PolyLC)的雙重刺激，以誘導(dǎo)強烈和持久的IL_12p70的產(chǎn)生。另外，在激活期間IFN-Y的添加進一步增強IL-12p70的產(chǎn)生。與趨化因子的產(chǎn)生類似，在激活之前，當單核細胞在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)5天時，和3天相比，IL_12p70的產(chǎn)生是最佳的(in 3 out of 4 experiments)。附圖4顯示出緊隨DC成熟的誘導(dǎo)，IL_12p70的產(chǎn)生。給出的數(shù)據(jù)時不同來源的三個實驗的平均值土SD。Y-軸顯示的是在撤去刺激24小時后的期間，以Pg/mL/2. 5X IO5細胞計的所產(chǎn)生的物質(zhì)的量。X軸顯示的是測量的不同組合。用同種異體的PBMCs誘導(dǎo)產(chǎn)生DC-成熟因子的成熟DCs或SEB-涂覆成熟DCs的共培養(yǎng)已知由激活的NK細胞和T細胞產(chǎn)生的炎性可溶性因子能促進其他的未成熟DCs的成熟。從而，當促炎性成熟DC104和免疫原性PBMCs (模仿補充免疫細胞)在組合物100中共培養(yǎng)時，能夠誘導(dǎo)已知對于DCs的成熟時很重要的細胞因子的產(chǎn)生，這是有益的。為了優(yōu)化DC-誘導(dǎo)的T細胞激活，在刺激階段的最后(洗滌前30分鐘)，用雙重的TLR激動劑和IFN- Y，添加SEB到DC-培養(yǎng)基中用超級抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)涂覆DCs。超級抗原，包括SEB，已知可和II類MHC在APCs上形成復(fù)合體，從而通過T細胞受體而刺激T細胞。出于對SEB的響應(yīng)，同時產(chǎn)生迅速的多克隆激活和CD4+與CD8+T細胞，導(dǎo)致促炎介質(zhì)包括TNF- α、IL-I和IFN- Y的產(chǎn)生增加。有差不多20%的T細胞譜能被SEB刺激，T細胞的“超激活”通常在SEB暴露之后48小時內(nèi)發(fā)生。經(jīng)重復(fù)洗滌后，無論有或沒有用并發(fā)的SEB“涂覆”，用免疫原性PBMCs對促炎性成 熟DC104共培養(yǎng)24小時，通過ELISA方法測量上清液中釋放出TNF-α、IL-I β和IFN-Y的水平。也可以使用其他類型的超級抗原，例如葡萄球菌腸毒素Α、C、D、Ε、F、G、H和J，以及金黃色葡萄球菌中毒休克綜合征毒素-I (TSST-I)。如在附圖5Α中所顯示，SEB-包衣的促炎性成熟DC104而非未成熟DCs的共培養(yǎng)(用TLR配體刺激)，在用同種異體PBMCs共培養(yǎng)之后誘導(dǎo)了 IL-I β的大規(guī)模產(chǎn)生。SEB包衣的未成熟DCs和同種異體的PBMCs的共培養(yǎng)誘導(dǎo)大規(guī)模的TNF- α的產(chǎn)生，通過使用成熟DCs使其略有增強。在DC成熟期間，向二倍的TLR刺激中中添加IFN-Y，基本不會影響IL-I β或TNF-α。尤其是，SEB包衣明顯有助于所給予的共培養(yǎng)模型中IL-I β和TNF-α的釋放(附圖6)，顯示了作為這些細胞因子的主要來源的多克隆激活T細胞。從而，在撤去刺激后的24小時期間，促炎成熟DC可產(chǎn)生至少2000pg TNF- α /mL/ Ο6 細胞，例如 32000pg/mL/106 cells,以及至少 500pg IL-I β /mL/ Ο6 細胞，例如2500pg/mL/106 細胞。和IL-I β和TNF-α的生產(chǎn)相似，當使用在共培養(yǎng)中已經(jīng)用SEB包衣的成熟DC來生產(chǎn)時，IFN-Y的產(chǎn)生量是最大的(附圖7)，最可能原因是因為T細胞的多克隆激活。向TLR中添加PBMCs，以及IFN-Y刺激DC，對可能是由通過促炎成熟DC104產(chǎn)生的IL-12激活的NK細胞分泌的IFN- Y的產(chǎn)生稍有誘導(dǎo)。附圖5顯示了通過ELISA法測量的IL-1 β (附圖5Α)和TNF- α (附圖5Β)的細胞因子水平。附圖6顯示了未添加培養(yǎng)基，PBMC或PBMC/SEB，通過ELISA法測量的IL-I β (附圖6Α)和TNF-α (附圖5Β)的細胞因子水平。附圖5中顯示的數(shù)據(jù)是來自四個個體的平均值土SD，附圖6中顯示源自一個實驗。附圖7顯示通過ELISA法測量的上清液中IFN- Y的細胞因子水平。附圖7中顯示的數(shù)據(jù)來自一個實驗。附圖5、6、7中各自的X軸顯示了在撤去刺激后24小時期間在pg/mL/2. 5x10s細胞中各自產(chǎn)生的物質(zhì)的數(shù)量。Y軸顯示的是測量到的不同組合。旁觀的未成熟DCs的顯型成熟隨后，研究了來自未包衣的，或SEB包衣的促炎成熟DC104的共培養(yǎng)的旁觀的未成熟DC上清液的顯型成熟和同種異體的PBMCslOl關(guān)于誘導(dǎo)旁觀未成熟DCs的顯型成熟的能力。從而，提供了基于前述任意一項權(quán)利要求的、包含促炎成熟DC104和外周血液單核細胞(PBMCs)IOI的組合物100。使用從這些細胞共培養(yǎng)物中得到的上清液對在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)5天的粘附的單核細胞而獲得的未成熟的旁觀DCs進行刺激。刺激24小時后，收獲細胞用于FACS分析。分別使用抗-人類⑶86和⑶83來檢驗共刺激分子(⑶86)和成熟標記(⑶83)的表達。如附圖8中所示，已經(jīng)用組合TLR刺激例如通過向iDCsl03中添加聚-I C、R848，而后用SEB-包衣從而成熟的促炎成熟DC104共培養(yǎng)而得的上清液誘導(dǎo)出旁觀的DCs的⑶86和⑶83顯著的表達。從而，組合物100可包含一種超級抗原。如附圖8C中所示，在TLR介導(dǎo)的疫苗DCs的成熟期間IFN- Y的添加不會導(dǎo)致旁觀的未成熟DCs產(chǎn)生任何附加的、上清液-誘導(dǎo)的顯型成熟。附圖8顯示SEB和TLR配體，即成熟誘導(dǎo)劑對未成熟DCsl03的影響。粘附的單核細胞于GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)5天從而獲得iDCsl03。在第5天，添加用SEB/TLR刺激促炎成熟DC104和TOMCslOl從而從MLR獲得的上清液，隨后另外培養(yǎng)24小時。為了研究共刺激分子和成熟標記，收獲細胞并用抗-人類CD86和CD83染色。成熟和共刺激的 表面標記高度受TLR配體和SEB的誘導(dǎo)。顯示的結(jié)果來自從兩個實驗中選取的一個代表性實驗。如附圖9B中所示，來自細胞培養(yǎng)物的、僅包含已經(jīng)用組合TLR結(jié)合IFN-Y刺激而成熟的促炎成熟DC104的上清液誘導(dǎo)了基于旁觀的DCs的CD83的大量表達。如附圖9C中所見，通過來自和同種異體的I3BMCs和促炎成熟DC104共培養(yǎng)的上清液，⑶83表達進一步加強。最后，如附圖9D所見，來自和SEB包衣的促炎成熟DC104和同種異體PBMCslOl共培養(yǎng)的上清液誘導(dǎo)了最強的⑶83的表達，顯示出在促炎成熟DC104-同種異體PBMC101-共培養(yǎng)100中包含SEB對于誘導(dǎo)未成熟旁觀DCs的最強的上清液-誘導(dǎo)成熟是很重要的?？紤]到上述結(jié)果，基于一個方面，提供了促炎成熟DC104，或組合物10，作為藥劑的用途?；谝粋€方面，提供了促炎成熟DC104、或組合物100，以及在治療癌癥中的用途?；谝粋€方面，提供了促炎成熟DC104的用途、或用于制備治療癌癥的藥劑的組合物100。促炎成熟DC104、或組合物100，可以通過瘤內(nèi)注射。在一個實施方式中，癌癥選自由乳腺癌、前列腺癌、腎癌、腸癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、胰腺癌、惡性淋巴瘤和食道癌組成的組。基于一個方面，提供了促炎成熟DC104、或組合物100，在不同于來源例如提供促炎成熟DC104，或PBMCslOl的供者的個體中用作藥劑的用途。基于一個方面，提供了促炎成熟DC104、或組合物100，在不同于來源例如提供促炎成熟DC104，或PBMCslOl的供者的個體中用于制備治療癌癥的藥劑的組合物100。瘤內(nèi)注射如上所述，可將促炎成熟DC104、或組合物100瘤內(nèi)注射從而在腫瘤生長方面產(chǎn)生抑制效果。為了顯不此，在瑞典的烏普薩拉，基于下述描述使用Visionar Preclinical AB對大鼠進行了研究。在本研究中使用了 15只費舍爾鼠。適應(yīng)過程(最少一周)后，將RPMI介質(zhì)中的100 μ I包含IO6MAT B III細胞(最初從大鼠乳腺腫瘤中分離出來)的細胞懸浮液在動物的左后側(cè)腹皮下注射(第-4天)。四天后在右后側(cè)誘導(dǎo)出第二腫瘤(第O天)。促炎成熟DC104(如上所述而產(chǎn)生)或載體(10% (體積)牛血清(FCS)的PBS緩沖液)單獨注射進入第一(左后側(cè)腹)腫瘤，4天后載入第二 (右后側(cè)腹)腫瘤(第4天)。促炎成熟DC104的劑量為每個動物20μ 1，包含IO6促炎成熟DC104細胞。整個研究中記錄第一和第二腫瘤的生長。本研究中動物的實驗部分得到了位于瑞典烏普薩拉(C320/9)的地區(qū)動物實驗倫理委員會的批準。下文表I中可看出實驗設(shè)計的概述。
權(quán)利要求
1.一種促炎樹突細胞(DC)，其已由聚肌胞-聚胞苷酸鈉鹽(poly-I:C)雷西莫特(R848)和干擾素Y (IFN-Y)的物質(zhì)處理從而刺激至體內(nèi)成熟。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的促炎成熟DC，其已進一步用選自由干擾素a(IFN-a)、白介素I、beta (IL-1 & )和腫瘤壞死因子(TNF_ a )組成的組的至少一種物質(zhì)刺激。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的促炎成熟DC，在撤去刺激后的24小時期間產(chǎn)生至少25000pgIL-12/mL/106 細胞，至少 IOOOOOpg CXCL9/mL/106 細胞，以及至少 40000pg CCL3/mL/106 細胞。
4.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求的促炎成熟DC，在撤去刺激后的24小時期間進一步產(chǎn)生至少 2000pg TNF- a /mL/106 細胞，以及至少 500pg IL-I ^ /mL/106 細胞。
5.包含根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求的促炎成熟DC和外周血液單核細胞(PBMCs)的組合物，
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，進一步包含一種超級抗原。
7.—種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求I至4的任意一項促炎成熟DC的方法(10)，所述方法包括步驟 提供(11)外周血液單核細胞(PBMCs) 101 ； 從所述PBMCs 101中分離(12)出單核細胞102 ； 從所述單核細胞102中產(chǎn)生(13)未成熟DCsl03 ； 通過向iDCs 103中添加激活-誘導(dǎo)劑poly-I:C，R848和IFN-Y而誘導(dǎo)(14) iDCsl03的成熟過程，從而獲得促炎成熟DC (104)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中iDCs(103)的成熟的誘導(dǎo)(14)進一步包含添加至少一種選自由IFN- a、IL-I P和TNF- a組成的組的物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中iDCs的產(chǎn)生(13)是通過在包含IL-4和GM-CSF的水相培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細胞2到7天而誘導(dǎo)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9任意一項的方法，其中iDCs的產(chǎn)生(13)是通過在IL-4和GM-CSF中培養(yǎng)單核細胞5天而誘導(dǎo)的。
11.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求5或6中任意一項組合物(100)的方法(20)，所述方法包括步驟提供(21)外周血液單核細胞(PBMCslOl);獲得(22)根據(jù)權(quán)利要求I至4的促炎性成熟DCs (104)，并混合(23)所述PBMCslOl和所述促炎性成熟DCs (104)。
12.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，進一步包括在混合前用超級抗原(200)處理促炎成熟DC(104)的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項的促炎成熟DC，或根據(jù)權(quán)利要求5或6的組合物，用作藥物的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項的促炎成熟DC，或根據(jù)權(quán)利要求5或6的組合物，在不同于促炎性成熟DC或PBMCs的源頭的個體中用作藥物的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至4任意一項的促炎成熟DC，或根據(jù)權(quán)利要求5或6的組合物，用于癌癥的治療。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至4任意一項的促炎成熟DC，或根據(jù)權(quán)利要求5或6的組合物，用于在促炎成熟DC104，或PBMCslOl來源不同的個體中用于治療癌癥的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16的促炎成熟DC或組合物，其中癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、腎癌、腸癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、胰腺癌、惡性淋巴瘤和食道癌組成的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求13到17的促炎成熟DC或組合物，其應(yīng)用是瘤內(nèi)注射。
19.一種治療患有腫瘤哺乳動物患者的方法,包含給予患者一次或多次治療學上有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求I至4任意一項所述的促炎成熟DC，或根據(jù)權(quán)利要求5至6的任意一項的組合物，其中所采用的促炎成熟DCs和/或PBMC的供者不是患者。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中給藥是瘤內(nèi)注射。
全文摘要
本發(fā)明屬于癌癥免疫療法，該方法通過提供促炎樹突狀細胞(DC)，它通過特異性處理刺激從而體內(nèi)成熟；這種治療的方法，以及包含促炎樹突狀細胞(DC)的組合物。DC可用作基于細胞免疫療法，抑制癌癥細胞增殖。
文檔編號C12N5/0784GK102782123SQ201180008012
公開日2012年11月14日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者亞歷克斯·卡森·帕拉, 安娜卡琳·沃爾格倫, 本·安德森 申請人:伊穆尼肯公司