專利名稱：用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片及其制造方法，更具體地，涉及用于其中反應(yīng)所需的多個試劑以規(guī)定順序被層壓并且被固定在被配置為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所的井中的核酸擴增反應(yīng)的微芯片等。
背景技術(shù)：
近年來，通過在半導(dǎo)體工業(yè)中應(yīng)用微細加工技術(shù)，已發(fā)展了在由硅或玻璃制成的基底上形成的用于執(zhí)行化學(xué)和生物分析的具有井和流道的微芯片(例如，參見專利文獻I)。在實際醫(yī)藥領(lǐng)域中，這些微芯片已開始被用于(例如)液相色譜的電化學(xué)探測器或小型電化學(xué)傳感器。
使用微芯片的這種分析系統(tǒng)被稱為U -TAS (微全分析系統(tǒng)，micro-Total-Analysis System)、實驗室芯片、生物芯片等,并且作為能使化學(xué)和生物分析加速、提高效率并且整合，或者減小分析裝備的尺寸的技術(shù)而引起了關(guān)注。由于ii -TAS能分析少量的樣本并且微芯片會是拋棄性的(一次使用)，所以期望將其應(yīng)用于具體處理痕量的珍貴樣本或許多測試體的生物分析。u -TAS的應(yīng)用的實例是光電檢測器，其將物質(zhì)引入進微芯片中所設(shè)置的多個區(qū)域中并且對該物質(zhì)或其反應(yīng)產(chǎn)物進行光學(xué)檢測。光電檢測器的實例是在微芯片的井中進行核酸擴增反應(yīng)并且對被擴增的核酸鏈進行光學(xué)檢測或量化的核酸擴增裝置(例如，實時PCR裝置)。通常，微芯片型核酸擴增裝置采用通過預(yù)先混合核酸擴增反應(yīng)和模板DNA (目標核酸鏈)所需的所有試劑并且將混合液引入進微芯片中所設(shè)置的多個井中以進行反應(yīng)的方法。因此，困難的是將所需的所有試劑和目標核酸鏈預(yù)先混合。另外，在混合液被引入井中之前需花費一定的時間段，因此存在的問題是在該時間段期間在混合液中進行了反應(yīng)。一旦在混合液向井中的進入完成之前進行反應(yīng)，則不能嚴格地控制反應(yīng)時間，這會是降低被擴增的核酸鏈的確定精度的因素。通常，PCR方法采用被稱為熱啟動的方法以嚴格控制反應(yīng)時間。熱啟動方法是避免低聚核苷酸引物的誤退火造成的非特定擴增反應(yīng)并且提供想要的被擴增的產(chǎn)物的方法。在PCR方法中，熱啟動方法通過將包括除了酶以外的試劑(通常，來自于耐熱菌的DNA聚合酶)和目標核酸鏈的混合液加熱至低聚核苷酸引物的變性溫度、僅在達到變性溫度之后添加酶、然后執(zhí)行通常溫度循環(huán)來實現(xiàn)。關(guān)于本發(fā)明，專利文獻2公開了在流道中包括核酸擴增反應(yīng)所需的低聚核苷酸引物、基質(zhì)、酶以及固態(tài)的其他試劑的微流芯片。在微流芯片中，處于液態(tài)的反應(yīng)所需的其余反應(yīng)物被送至流道，液態(tài)的試劑與固態(tài)的試劑接觸，并且處于固態(tài)的試劑被溶解以開始反應(yīng)。在專利文獻2中，并未描述低聚核苷酸引物、基質(zhì)、酶以及其他試劑被層壓并被固定在流道中。專利文獻I :日本專利申請公開第2004-219199號
專利文獻2 :日本專利申請公開第2007-43998號

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，在傳統(tǒng)微芯片型核酸擴增裝置中，由于試劑等被預(yù)先混合并且被引入進井中，所以困難的是其存在下面的問題。反應(yīng)時間無法嚴格控制，因此分析的精度降低。因此，本發(fā)明的主要目的是提供允許通過簡單方法進行高精度分析的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片。
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片，包括入口，液體通過該入口從外部進入；多個井，被配置為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所；以及流道，從入口進入的液體通過該流道被供給到各個井，其中，反應(yīng)所需的多個試劑以規(guī)定順序被層壓并被固定在各個井中。在用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片中，低聚核苷酸引物的固定層可被層壓在酶的固定層上面，或者，以相反的方式，酶的固定層可被層壓在低聚核苷酸引物的固定層的上面。在所述酶的固定層與所述低聚核苷酸引物的固定層之間可層壓反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)的固定層。而且，本發(fā)明提供了一種制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法，包括第一步驟，在基底層上形成的、被配置為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所的多個井中的每一個中以規(guī)定順序?qū)訅翰⒐潭ǚ磻?yīng)所需的多個試劑。制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法還包括第二步驟，活化并粘合被層壓并固定有試劑的基底層的表面，其中，第一步驟包括在各個井中滴入并干燥酶溶液、之后滴入并干燥低聚核苷酸引物溶液的處理。在制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法中，第一步驟優(yōu)選包括在各個井中滴入并干燥酶溶液之后并且在滴入低聚核苷酸引物溶液之前，滴入并干燥反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)溶液的處理。另外，在用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法中，第二步驟可包括通過氧等離子處理或真空紫外光處理來活化基底層的表面的處理。在本發(fā)明中，“核酸擴增反應(yīng)”包括執(zhí)行溫度循環(huán)的傳統(tǒng)PCR (聚合酶鏈反應(yīng))方法以及不涉及溫度循環(huán)的各種等溫擴增方法。等溫擴增方法的實例包括LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫擴增)方法、SMAP (智能擴增處理)方法、NASBA (基于核酸序列的擴增)方法、ICAN (等溫和嵌合引物引發(fā)核酸擴增)方法(商標)、TRC (反轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄協(xié)同)方法、SDA (鏈置換擴增)方法、TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增)方法、RCA (滾環(huán)擴增)方法等。另外，“核酸擴增反應(yīng)”廣義地包括在變溫下或在恒溫下用于擴增核酸的核酸擴增反應(yīng)。而且“核酸擴增反應(yīng)”包括涉及被擴增的核酸鏈的量化的反應(yīng)，諸如實時PCR (RT-PCR)方法和RT-RAMP方法。另外，“試劑”包括在上述核酸擴增反應(yīng)中用于獲得被擴增的核酸鏈所需的試劑，并且具體包括具有與目標核酸鏈互補的堿基序列的低聚核苷酸引物、核酸單體(dNTP)、酶、反應(yīng)緩沖溶液(緩沖液)溶質(zhì)等。本發(fā)明提供了一種允許通過簡單方法進行高精度分析的用于核酸擴增反應(yīng)的微
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圖I是用于根據(jù)本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)的微芯片的示意性俯視圖。圖2是微芯片的示意性截面圖(圖I, p-p截面)。圖3是示出了在微芯片的各個井中層壓的試劑的固定層的示意圖。圖4是示出了在微芯片的井中層壓的試劑的固定層的可選實例的示意圖。圖5是示出了制造用于根據(jù)本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法的流程圖。圖6是示出了在井中層壓試劑的固定層的方法的示意圖。
具體實施方式

在下文中，將參照附圖描述用于實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。下面描述的實施方式僅示出了本發(fā)明的通常實施方式的實例，而本發(fā)明的范圍并不通過這些實施方式狹隘地解釋。將按照下列順序描述實施方式。I.用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片2.制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法(2-1)形成基底層al( 2-2 )將酶和引物固定至井中(2-3)表面活化并粘合基底層al和a2I.用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片圖I中示出了用于根據(jù)本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)的微芯片(在下文中簡稱為“微芯片，，)的示意性俯視圖，并且在圖2中示出了其示意性截面圖。圖2對應(yīng)于圖I中的p-p截面。被標不符號A的微芯片包括入口 I,樣本溶液通過該入口從外部進入；多個井，被配置為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所；主流道2，其一端與入口 I連通；以及支流道3，其從主流道2分支。主流道2的另一端被配置為將樣本溶液排出至外部的出口 5。支流道3在至主流道2的入口的連通部與至出口 5的連通部之間的位置處從主流道2分支，并且被連接至各個井。樣本溶液可包含用作核酸擴增反應(yīng)中的模板(目標核酸鏈)的DNA、基因組RNA、mRNA 等。這里，給出了在微芯片A中以三行和三列等間隔地設(shè)置總共九個井的情況作為實例。這九個井劃分為三個部分。在圖I中，上部的三個井通過符號41標示，中部的三個井通過符號42標示，而下部的三個井通過符號43來標示。從入口 I進入的樣本溶液通過主流道2朝著出口 5輸送，并且從設(shè)置在沿溶液輸送方向上游的支流道3和井而依次供給至內(nèi)部?？蛇x地，在微芯片A中，出口 5可以不是必需的部件，微芯片A可被配置為使得從入口I進入的樣本溶液不被排出至外部。通過將基底層a2粘合至基底層al來構(gòu)造微芯片A，基底層al上形成有入口 I、主流道2、支流道3、井41、42和43以及出口 5?；讓觓l或a2的材料可以是玻璃和各種塑料(聚丙烯、聚碳酸酯、環(huán)烯烴聚合物、聚二甲硅氧烷)。當在井41、42和43中擴增的核酸鏈被光學(xué)檢測或量化時，優(yōu)選地從具有透光性、較少自發(fā)熒光以及因為波長分散較小而光學(xué)誤差較少的材料選擇基底層al或a2的材料。核酸擴增反應(yīng)所需的多個試劑以規(guī)定順序被層壓并且固定在井41、42和43中。圖3示出了在各個井中層壓的試劑的固定層的實例。圖3的(A)、(B)和(C)示出了分別在井41、井42和井43中層壓的試劑的固定層。被固定至井中的試劑是在核酸擴增反應(yīng)中用于獲得被擴增的核酸鏈所需試劑，并且具體包括具有與目標核酸鏈互補的堿基序列的低聚核苷酸引物、核酸單體(dNTP)、酶、反應(yīng)緩沖溶液(緩沖液)溶質(zhì)等。固定的試劑可以是這些中的一種或多種。層壓這些試劑的順序可以以任意順序，諸如“低聚核苷酸引物、dNTP、酶、緩沖液溶質(zhì)”的順序或“緩沖液溶質(zhì)、酶、dNTP、低聚核苷酸引物”的順序。另外，這些試劑的一部分，例如，引物和緩沖液溶質(zhì)，或引物和dNTP可被混合并固定。用于檢測和量化被擴增的核酸鏈的試劑，諸如熒光試劑(熒光顏料)、磷光試劑(磷光顏料)，可根據(jù)所需被固定在井中，盡管其不是用于獲得被擴增的核酸鏈所必需的。
這里，示出了首先在井41、42和43中形成酶E的固定層，然后在其上層壓低聚核苷酸弓丨物(下文中簡稱為“引物”)P1、P2和P3的固定層的情況。如后面描述的，反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)的固定層可層壓在酶的固定層與引物的固定層之間(細節(jié)在下面進行詳細描述)。引物P1、P2和P3可以是具有相同堿基序列的引物，但當多個目標核酸鏈在微芯片A中被擴增時可以是具有不同堿基序列的引物。例如，當利用微芯片A確定基因型時，具有與各個基因型的堿基序列相對應(yīng)的不同堿基序列的引物分別被固定至井41、42和43。當利用微芯片A來確定接觸傳染原時，類似地固定具有與各病毒和微生物的堿基序列相對應(yīng)的不同堿基序列的引物。在這點上，被固定至各個井的酶E需是相同的。因此，在微芯片A中，反應(yīng)所需的反應(yīng)物被預(yù)先固定至井中，使得反應(yīng)僅通過將其余的反應(yīng)物和包含目標核酸鏈的樣本溶液從入口 I供給至各個井中來開始。這使得會減小預(yù)先混合的反應(yīng)物的數(shù)量并且避免了混合的麻煩，這實現(xiàn)了簡單分析。此外，反應(yīng)所需的所有反應(yīng)物被預(yù)先固定在井中，使得反應(yīng)僅通過將只包含目標核酸鏈的樣本溶液來開始，這實現(xiàn)了更簡單的分析。另外，在微芯片A中，反應(yīng)僅在其余反應(yīng)物和包含目標核酸鏈的樣本溶液被供給至各個井中并且被固定至井中的反應(yīng)物被溶解之后開始，使得可嚴格控制反應(yīng)時間并且可提供聞精度分析。此外，過量地被添加至反應(yīng)系統(tǒng)并且對于溫度等的變化相對穩(wěn)定的引物的固定層被層壓在對于溫度的變化、濕度的變化以及光不穩(wěn)定并且相比于引物、dNTP和緩沖液溶質(zhì)易于降低活性或被去活化的酶的固定層上，使得引物的固定層可保護酶的固定層。因此，可防止在制造和存儲微芯片A時由溫度等的變化引起的酶的活性降低或去活化。盡管通過給出了在微芯片中以三行和三列等間隔設(shè)置總共九個井的情況作為實例來說明了上面的描述，但可以使用任意數(shù)量和位置的井，并且井的形狀不限于圖中所示的圓柱形。另外，將從入口 I進入的樣本溶液供給至各個井的流道的構(gòu)造不限于圖中所示的主流道2和支流道3的方式。此外，盡管描述了在基底層al上形成入口 I等，但可在基底層al和基底層a2 二者的每一個上形成入口 I等。組成微芯片的基底層可以是一個或多個。另外，盡管通過將引物的固定層層壓在酶的固定層上的情況來說明了上面的描述，但試劑可以任意順序?qū)訅?，例如，酶的固定層可被層壓在引物的固定層?參見圖4)。在這種情況下，反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)的固定層可被層壓在酶的固定層與引物的固定層之間(細節(jié)在下面進行描述)。當引物的固定層被層壓在頂上時，在引物的固定層被從入口 I供給至各個井的樣本溶液溶解之后并且在溶解酶以開始反應(yīng)之前，在先溶解的引物可以在井之間相互擴散(交叉污染)。相反，當酶的固定層被層壓在頂上時，因為反應(yīng)在酶的固定層溶解之后、引物的固定層的溶解一開始就開始，所以可防止引物的交叉污染。2.制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法接下來，將參照圖5中的流程圖來描述制造根據(jù)本發(fā)明的微芯片的方法。作為實例，將在下面以上述微芯片A為例來描述。(2-1)形成基底層al在圖5中，符號SI是形成基底層al的步驟。在此步驟中，在基底層al上形成入口 I、主流道2、支流道3、井41、42和43以及出口 5。可通過(例如)玻璃基底層的濕蝕刻或 干蝕刻或通過塑料基底層的納米壓印、注塑成型或切削加工來執(zhí)行基底層al上入口 al和其他部件的形成。(2-2)將酶和引物固定至井中符號S2是將酶固定至井的步驟。符號S3是將引物固定至井的步驟。步驟S2和S3對應(yīng)于將反應(yīng)所需的多個反應(yīng)物以規(guī)定順序?qū)訅翰⒐潭ㄔ诰械牟襟E(第一步驟)。固定在井中的試劑是用以在核酸擴增反應(yīng)中提供擴增的核酸鏈所需的試劑，并且具體包括具有與目標核酸鏈互補的堿基序列的低聚核苷酸弓I物、核酸單體(dNTP)、酶、反應(yīng)緩沖溶液(緩沖液)溶質(zhì)等。固定的試劑可以是這些中的一種或多種。層壓這些試劑的順序可以是任意順序，諸如“引物、dNTP、酶、緩沖液溶質(zhì)”的順序或“緩沖液溶質(zhì)、酶、dNTP、引物”的順序。另外，這些反應(yīng)物的一部分，例如，引物和緩沖液溶質(zhì)，或引物和dNTP可被混合并固定。這里，在步驟S2中在井41、42和43中滴入并干燥酶E的溶液，在步驟S3中分別滴入并干燥引物P1、P2和P3的溶液，從而各引物的固定層被層壓在酶的固定層之上。引物P1、P2和P3可以是具有相同堿基序列的引物，但當多個目標核酸鏈在微芯片A中被擴增時可以是具有不同堿基序列的引物。關(guān)于這一點，被固定至各個井的酶E需要是相同的。例如通過空氣干燥、真空干燥或冷凍干燥被滴入的溶液，并且優(yōu)選地通過逐漸干燥來執(zhí)行試劑的固定。就酶而言，為了防止活性降低或去活化，臨界點干燥也是有效的。此時，在步驟S2中固定的酶可被在步驟S3所滴入的引物溶液所溶解。當酶和引物由于再溶解而被混合時，由于可能發(fā)生引物二聚體的擴增所以是不利的。為了防止酶和引物的混合，在第三步驟中，優(yōu)選的是預(yù)先將微芯片保持在低溫(約-10° C)，使得被滴入的引物溶液可被冷凍并且被冷凍干燥。可選地，可使用下面的方法。該方法是，將微芯片預(yù)先保持在低溫下，滴入水并冷凍它，然后滴入引物溶液并對其進行冷凍干燥，然后空氣干燥以蒸發(fā)冰的中間層。另外，更優(yōu)選的是使用下面的方法。該方法是，將微芯片預(yù)先保持在低溫下，滴入緩沖液溶質(zhì)溶液并對其進行冷凍干燥，在酶E的固定層上層壓緩沖液溶質(zhì)B的固定層，之后，滴入引物溶液，然后空氣干燥、真空干燥或冷凍干燥。因此，在各個井中形成其中緩沖液溶質(zhì)的固定層被層壓在酶的固定層與引物的固定層之間的三層結(jié)構(gòu)(參見圖6)。而且，當酶的固定層被層壓在引物的固定層之上時，可采用這些方法以防止引物的混合。(2-3)表面活化并粘合基底層al和a2符號S4是活化基底層al和a2的表面的步驟。符號S5是粘合基底層al和a2的步驟。步驟S4和S5對應(yīng)于活化并粘合被層壓并固定有試劑的基底層的表面的步驟(第二步驟)。基底層al和基底層a2可通過例如利用粘合劑或粘合片的粘附、熱封、陽極結(jié)合或超聲波結(jié)合來粘合。而且，可使用通過氧等離子處理或真空紫外光處理活化并粘合基底層的表面的方法。諸如聚二甲硅氧烷的塑料和玻璃具有高親和性。當它們的表面被活化并被接觸時，懸空鍵被反應(yīng)以形成強共價鍵，即，Si-O-Si硅烷醇鍵，從而提供具有足夠強度的粘合。氧等離子處理或真空紫外光處理通過根據(jù)基底層的材料設(shè)定適當?shù)臈l件來執(zhí)行。
因此，通過分別地將酶和引物固定并層壓在形成有井的基底層的井中，反應(yīng)物可在滴入并干燥溶液的過程中、在不激發(fā)引物二聚體擴增反應(yīng)的情況下被固定，這與混合酶和引物并且固定它們的情況不一樣。此外，過量地被添加至反應(yīng)系統(tǒng)并且對于溫度等的變化相對穩(wěn)定的引物的固定層被層壓在對于溫度的變化、濕度的變化以及光不穩(wěn)定并且易于降低活性或被去活化的酶的固定層上，使得可保護酶的固定層在步驟S4中免于受熱、等離子或紫外光照射。換言之，當被固定有反應(yīng)物的基底層的表面通過氧等離子處理或真空紫外光處理被活化時，引物的固定層也保護了下面的酶，由此，可防止通過等離子或紫外光照射所造成的酶的活性降低或去活化。盡管上面的描述通過將引物的固定層層壓在酶的固定層上的情況來說明，但反應(yīng)物可以任何順序被層壓，例如，酶的固定層可被層壓在引物的固定層上面(參見圖4)。在這種情況下，反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)的固定層被層壓在酶的固定層與引物的固定層之間也是有效的。工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片允許通過簡單方法進行高精度分析。因此，根據(jù)本發(fā)明的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片可用于用于基因型確定、接觸傳染原確定等的微芯片型核酸擴增裝置。符號的描述A用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片E 酶P1、P2、P3 引物I 入口2主流道3支流道41、42、43 井5 出口
權(quán)利要求
1.一種用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片，包括 A 口，液體通過所述入口從外部進入； 多個井，被配置為用作所述核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所；以及 流道，通過所述入口進入的液體通過所述流道被供給到各個所述井， 其中，反應(yīng)所需的多個試劑以規(guī)定順序被層壓并固定在各個所述井中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片， 其中，低聚核苷酸引物的固定層被層壓在酶的固定層的上面。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片， 其中，酶的固定層被層壓在低聚核苷酸引物的固定層的上面。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片， 其中，反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)的固定層被層壓在所述酶的固定層與所述低聚核苷酸引物的固定層之間。
5.一種制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法，包括 第一步驟，在基底層上形成的、被配置為用作所述核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所的多個井中的每一個中以規(guī)定順序?qū)訅翰⒐潭ǚ磻?yīng)所需的多個試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法，還包括 第二步驟，活化并粘合被層壓并固定有所述試劑的所述基底層的表面，其中， 所述第一步驟包括在各個所述井中滴入并干燥酶溶液、之后滴入并干燥低聚核苷酸引物溶液的處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法， 其中，所述第一步驟包括在各個所述井中滴入并干燥所述酶溶液之后并且在滴入所述低聚核苷酸引物溶液之前，滴入并干燥反應(yīng)緩沖液溶質(zhì)溶液的處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制造用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片的方法， 其中，所述第二步驟包括通過氧等離子處理或真空紫外光處理來活化所述基底層的表面的處理。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠通過簡單方法進行高精度分析的用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片。具體地，本發(fā)明提供了一種用于核酸擴增反應(yīng)的微芯片A，包括入口(1)，液體通過該入口從外部進入；多個井(41、42、43)，用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場所；以及流道(2、3)，從入口進入的液體通過該流道被供給到各個井(41、42、43)，其中，反應(yīng)所需的多個試劑以規(guī)定順序被層壓在各個井(41、42、43)中，從而被固定到各個井(41、42、43)上。
文檔編號C12N15/09GK102741408SQ20118000839
公開日2012年10月17日 申請日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者世取山翼, 渡邊英俊, 阿部友照 申請人:索尼公司