專利名稱：：一株耐高溫酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株耐高溫酵母菌及其應(yīng)用，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：目前，工業(yè)上是利用酵母在^33°C發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。因酵母的發(fā)酵產(chǎn)熱，造成發(fā)酵體系溫度升高，引起酵母細(xì)胞內(nèi)脂肪酸、磷脂、麥角固醇等成分變化，影響細(xì)胞本身正常生理活動(AraqueEdgardojParraCarolinaajRodrguezManuel,FreerJuanitajBaezaJaime.SelectionofthermotolerantyeaststrainsSaccharomycescerevisiaeforbioethanolproduction[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2008，43:120-123.)。因此，為了保持酵母菌的活性，需用大量冷卻水降低發(fā)酵溫度。同時，為了防止雜菌污染，需在發(fā)酵液中加入大量的酸，不僅對發(fā)酵罐具有很強(qiáng)的腐蝕作用，增加了發(fā)酵成本。若能在高溫下進(jìn)行發(fā)酵，可減少冷卻水的用量，降低能耗。同時，高溫能有效的抑制雜菌生長，減少醪液的污染性。另外，高溫還能縮短發(fā)酵周期，提高乙醇得率。因此，酵母的耐高溫性能直接與生產(chǎn)效益相關(guān)。耐高溫酵母的研究早在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)出現(xiàn)。1984年Hughes等篩選到一株Kluyveromycesmarxianus酵母菌，能在49°C生長，在高于40°C條件下生產(chǎn)乙IfCHughes,D.B.,Tudroszen,N.J.TheeffectoftemperatureonthekineticsofethanolproductionbyathermotolerantstrainofKluveromycesmarxianus.BiotechnologyZeiiers，1984，6，1-6.)。D，Amore(1989)等篩選到一株feccAarofflj^es酵母菌，該菌在45°C時的不完全糖發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件利用15-20%(w/v)的葡萄糖產(chǎn)生4.5%(w/v)的乙醇(D’Amore，T.，Celotto,G.,Russell,I.&Stewart，G.G.Selectionandoptimizationofyeastsuitableforethanolproductionat40°C.EnzymeandMicrobialTechnology，1989.11，411-416.)。I.Μ·Bana(1992)等從印度酒廠采集的樣品中分離篩選到5株能在52°C生長，在45°C和50°C發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的耐熱酵母菌株，在14.0%(w/v)的葡萄糖上生長，乙醇產(chǎn)量45°C時是5.7-7.0%(W/v)，50°C時是5.0-5.5%(I.M.Banat,P.NigamandR.Marchant.Isolationofthermotolerant,fermentativeyeastsgrowingat52Candproducingethanolat45Cand50°C[J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology，1992，8，259—263.)。SavitreeLimtong(2007)等利用富集技術(shù)分離得到的Z/i/j^erofflj^^smarxianusDMKU3-1042在;35°C，40°C和45°C生產(chǎn)高濃度乙醇(SavitreeLimtong,ChutimaSringiew,WichienYongmanitchai.ProductionoffuelethanolathightemperaturefromsugarcanejuicebyanewlyisolatedKluyveromycesmarxianus[J].2007,BioresourceTechnology98(2007)3367-3374.)。我國的蘇艷秋(2009)等人以白酒廠窖泥和生產(chǎn)用酒曲為材料，篩選到1株產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)，耐高溫、耐強(qiáng)酸、起酵速度快的菌株Y30，該菌株能在45°C正常發(fā)酵，且致死溫度達(dá)到59°C(蘇艷秋，朱衛(wèi)華，吳鵬，等.耐高溫、耐酸產(chǎn)酒精酵母的篩選與鑒定[J].微生物學(xué)雜志，2009,):43-47).但是，目前在高溫下具有高乙醇產(chǎn)量的菌株相對較少，因此，能在工業(yè)乙醇生產(chǎn)中的高溫高產(chǎn)酵母也相對較少。在發(fā)酵工藝過程中，菌種是發(fā)酵的關(guān)鍵。將耐高溫酵母菌用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，具有的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在①加快生化反應(yīng)速度，提高發(fā)酵效率，提高乙醇轉(zhuǎn)化的效率。②在利用纖維素生產(chǎn)乙醇的過程中，高溫能解決糖化溫度和發(fā)酵溫度不協(xié)調(diào)的矛盾，實(shí)現(xiàn)真正意義上的邊糖化邊發(fā)酵.從而減少葡萄糖對纖維素酶的抑制作用，提高纖維素酶的糖化率，進(jìn)而提高纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的得率。③高溫發(fā)酵能防止雜菌的混入，有利于乙醇生產(chǎn)線的管理。④高溫發(fā)酵可使乙醇的蒸餾回收及時簡便，減少蒸餾回收成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。⑤乙醇的及時回收可解除乙醇對發(fā)酵微生物的反饋抑制作用。因此，選育耐受更高溫度的的酵母菌株應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是提高乙醇產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵菌株的缺點(diǎn)，提供一株耐高溫酵母菌。本發(fā)明所提供的菌株是從土壤中篩選出來的耐高溫酵母菌衛(wèi)atomsp.WXT3，該菌株己于2011年4月5日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”(簡稱CCTCC)，其保藏編號為CCTCCNO:M2011108。本發(fā)明中所述耐高溫酵母菌株1乂13，其沈3rRNAD1/D2區(qū)域具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明中所述耐高溫酵母菌株WXT3，其5.8S+ITS區(qū)域具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明中所述耐高溫酵母菌株WXT3的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1+ITS2)序列比對結(jié)果顯示，和衛(wèi)aiaeapolymorphaATCC66057的相似性99%，WXT3屬于衛(wèi)aiaea屬(見圖1)。本發(fā)明另一目的是耐高溫酵母菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，該菌株能夠在2548°C條件下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，且乙醇產(chǎn)率高，可利用碳源范圍廣。本發(fā)明中所述耐高溫酵母菌株能夠利用葡萄糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖、木糖、木糖醇、果糖、甘油、甘露醇中一種或幾種為碳源生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明中所述耐高溫酵母菌株能夠利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明中所述耐高溫酵母菌株能夠利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。耐高溫酵母菌也可應(yīng)用在生物工程及分子生物學(xué)改造用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中。酵母菌株衛(wèi)atomsp.WXT3可以用于任何淀粉和非淀粉多糖水解后單糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程中。本發(fā)明中耐高溫酵母菌株衛(wèi)atomsp.WXT3具有以下微生物學(xué)特性1、形態(tài)學(xué)特征在酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞呈球形或卵形，有沉淀形成。在YPD瓊脂培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)，菌落呈乳白色，表面光滑，凸起明顯，邊緣整齊，不透明，有光澤。2、生理生化特性(1)耐高溫酵母菌株Ogat腿sp.WXT3在無維生素培養(yǎng)基中生長無維生素培養(yǎng)基成分硫酸銨，2.Og/L;硫酸鎂，0.2g/L;磷酸二氫鈉，0.5g/L;氯化鈣，0.1g/L;磷酸氫二鉀，0.5g/L;補(bǔ)充碳源。(2)耐高溫酵母菌株衛(wèi)aiaeasp.WXT3在YPD(葡萄糖，洲蛋白胨，1%酵母提取物)培養(yǎng)基(pH自然)中，2548°C條件下生長(見圖4)。(3)耐高溫酵母菌株衛(wèi)aiaeasp.WXT3在含有0.01%環(huán)已酰亞胺的在YPD(葡萄糖二％蛋白胨，1%酵母提取物)培養(yǎng)基(PH自然)中生長。(4)耐高溫酵母菌株衛(wèi)aiaeasp.WXT3在50%的D-葡萄糖培養(yǎng)基(50%的D-葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%瓊脂粉)上生長，在60%的D-葡萄糖培養(yǎng)基(60%的D-葡萄糖，洲蛋白胨，1%酵母提取物，2%瓊脂粉)上不生長，結(jié)果見圖2。(5)耐高溫酵母菌株Ogataeasp.WXT3在含有10%NaCl的YPD(2%葡萄糖，21蛋白胨，1%酵母提取物)培養(yǎng)基(PH自然)上生長，在含有16%NaCl的YPDO。/。葡萄糖，洲蛋白胨，1%酵母提取物)培養(yǎng)基(PH自然)上不生長。(6)碳源利用情況(見表1)權(quán)利要求1.一株耐高溫酵母菌衛(wèi)atomsp.WXT3，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCCNo:M2011108。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫酵母菌株，其特征在于其^SrDNAD1/D2區(qū)域的基因序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫酵母菌株，其特征在于其5.8S+ITS區(qū)域的基因序列為SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。4.權(quán)利要求1所述的耐高溫酵母菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐高溫酵母菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于利用葡萄糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖、木糖、木糖醇、果糖、甘油、甘露醇中一種或幾種為碳源生產(chǎn)乙醇。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐高溫酵母菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐高溫酵母菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。8.權(quán)利要求1所述的耐高溫酵母菌在生物工程及分子生物學(xué)改造用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種耐高溫酵母菌及其應(yīng)用，該耐高溫酵母菌Ogataeasp.WXT3已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號是CCTCCNOM2011108；本發(fā)明的酵母菌是從土壤中篩選出來的，該菌株能在25～48℃溫度下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，且乙醇產(chǎn)率高，可發(fā)酵利用的碳源范圍廣，特別適用于木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵(SSF)工藝制備乙醇的過程中，能夠有效降低纖維素酶的使用量，從而降低了纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。文檔編號C12N1/16GK102492634SQ201110422929公開日2012年6月13日申請日期2011年12月16日優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日發(fā)明者嚴(yán)金平,伊日布斯,張緒,王喬平申請人:昆明理工大學(xué)