專利名稱：含有柯薩奇b3病毒2b蛋白中36-83位氨基酸基序的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用，特別涉及柯薩奇B3病毒2B蛋白在制備抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中的應(yīng)用，尤其是涉及柯薩奇病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B中36-83位氨基酸基序在通過引起腫瘤細(xì)胞自噬而抑制腫瘤細(xì)胞生長中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康以及生命的重要疾病，目前腫瘤的主要治療手段是手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等，這些方法雖然取得一定的成效，但是還無法徹底根治腫瘤，且均存在一定副作用，例如化學(xué)治療所造成的骨髓抑制、食欲減低、腹瀉，放射治療所引起的吞咽困難等。不僅如此，這些傳統(tǒng)的治療除具有副作用外，還有一些治療的盲點，例如抗藥性的產(chǎn)生等。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及其技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的治療更加多樣化，出現(xiàn)了一些新的治療或輔助治療的方法，這其中就包括利用病毒制備抗腫瘤藥物。2010年，中國國家知識產(chǎn)權(quán)局公開了一種植物病毒在制備惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用(CN101653462A)，其利用一種植物病毒(煙草花葉病毒)轉(zhuǎn)染至惡性腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)中，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡性死亡。某些病毒也可通過破壞腫瘤細(xì)胞的生長治療腫瘤，柯薩奇病毒A組21型可作為潛在的抗多形性骨髓瘤的治療手段。(Au GG, Lincz LF,Enno A， Shafren DR. Oncolytic Coxsackievirus A21as a novel therapy for multiple myeloma. Br J Haematol. 2007 ； 137(2) :133-141.)對腫瘤細(xì)胞死亡以及抗死亡特性的研究，多集中于腫瘤細(xì)胞的凋亡機制，然而，腫瘤細(xì)胞中凋亡抗性的存在已經(jīng)成為腫瘤治療的主要障礙，而自噬與腫瘤作用的研究正是解決這一問題的關(guān)鍵。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身大分子物質(zhì)和受損的細(xì)胞器的生物學(xué)過程。自噬可通過隔離受損細(xì)胞器促進蛋白的分解代謝或增加基因組穩(wěn)定性而發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞自噬有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用，也影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，成為腫瘤靶向治療的潛在靶點，因此，如何在腫瘤治療中發(fā)揮自噬的作用是當(dāng)前研究的熱點。目前已知一些抗腫瘤藥物的作用途徑與自噬有關(guān)，如他莫昔芬(tamoxifen)可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞 /fe^g Blft^t (Bursch W, Ellinger A, KienzlH et al. Active cell death induced by the anti-estrogens tamoxifen and ICI 164 384in human mammary carcinoma cells(MCF-7)in culture :the role of autophagy.Carcinogenesis,1996,17(8) 1595-1607.)；長春新堿(vincristine)可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞H印G2的自噬性凋亡，但直接發(fā)揮誘導(dǎo)自噬作用而抑制腫瘤的藥物卻很少。在某些病毒性疾病中，也發(fā)現(xiàn)了自噬作用的發(fā)生，脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus) 2BC蛋白通過促進表達(dá)微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3 (LC3)，從而促進細(xì)胞的自噬發(fā)生(Jackson WT, Giddings TH Jr, Taylor MP, Mulinyawe S, Rabinovitch Μ, Kopito RR, Kirkegaard K. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.PLoS Biol. 2005,3(5) :861-871.)；人類單純皰疹病毒(HSV)通過激活蛋白激酶R(I3KR) 從而促進自噬小體的形成(Talloczy Z, Virgin HW 4th. Levine B. PKR_d印endent autophagic degradation of herpes simplex virus type 1. Autophagy. 2006,2(1) 24-29.) ο柯薩奇病毒B組3型(CVB3)可以引起HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬(Wong J, Zhang J, Si X, Gao G, Mao I, McManus BM, Luo H. Autophagosome supports coxsackievirus B3replication in host cells. J Virol. 2008 ；82 (18) :9143-9153.)。但目前還沒有通過病毒蛋白的真核表達(dá)載體，直接促進細(xì)胞自噬作用，從而抑制腫瘤的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過利用柯薩奇病毒引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，發(fā)現(xiàn)柯薩奇病毒 2B蛋白中36-83位氨基酸基序可以弓I起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡而死亡，進而提供柯薩奇病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供了含有SEQ ID NO. 1所示序列的蛋白質(zhì)在制備治療腫瘤藥物中的用途；優(yōu)選的，所述的蛋白質(zhì)為柯薩奇B3病毒2B蛋白(用CVB3-2B表示)；優(yōu)選的，所述的蛋白質(zhì)為截短型柯薩奇病毒2B重組蛋白，更優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示(用CVB3-2B36_83表示)；本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供了氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的蛋白質(zhì)以及編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供了一種表達(dá)載體，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體為真核表達(dá)載體，更優(yōu)選的所述表達(dá)載體為pEGFP-Cl。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有以上所述的表達(dá)載體。優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞。本發(fā)明所要解決的第五個技術(shù)問題是提供了本發(fā)明所述的核苷酸序列在制備治療腫瘤藥物中的用途。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施(1)構(gòu)建柯薩奇病毒CVB3-2B蛋白與綠熒光蛋白融合基因的表達(dá)載體；(2)觀察到柯薩奇病毒CVB3-2B蛋白與綠熒光蛋白融合蛋白可有效的在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)；(3)觀察柯薩奇病毒CVB3-2B蛋白與綠熒光蛋白融合蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬；(4)構(gòu)建柯薩奇病毒CVB3-2B截短蛋白與綠熒光蛋白融合基因的表達(dá)載體；(5)觀察到柯薩奇病毒CVB3-2B截短蛋白與綠熒光蛋白融合蛋白可有效的在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)；(6)觀察到柯薩奇病毒CVB3-2B截短蛋白與綠熒光蛋白融合蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬；
(7)構(gòu)建柯薩奇病毒CVB3_2B36_83與綠熒光蛋白融合基因的表達(dá)載體；(8)觀察到柯薩奇病毒CVB3_2B36_83與綠熒光蛋白融合蛋白可有效的在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)；(9)觀察到柯薩奇病毒CVB3_2B36_83與綠熒光蛋白融合蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自P麓。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是柯薩奇病毒在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用本發(fā)明成功構(gòu)建了柯薩奇病毒B組3型(CVB3) 2B蛋白及CVB3_2B36_83與綠熒光蛋白(EGFP)融合基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，進一步這些表達(dá)載體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)病毒蛋白及綠熒光蛋白，最終誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡而死亡。本發(fā)明尚屬首創(chuàng)，將CVB3病毒蛋白(CVB3-2B)與綠熒光蛋白融合基因克隆至真核表達(dá)載體，構(gòu)建得到融合蛋白的真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，進一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡，構(gòu)建病毒蛋白2B截短蛋白與EGFP融合基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，進一步確定2B蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性細(xì)胞凋亡的功能基序為aa36-aa83(SEQ ID NO. 1所示)。針對柯薩奇病毒2B蛋白這一特性可將其用于腫瘤的治療，如隨后具體實施例結(jié)果所示，通過免疫熒光細(xì)胞定位與蛋白表達(dá)特點認(rèn)定CVB3-2B aa36-aa83 (SEQ ID NO. 1所示)基序為引起腫瘤細(xì)胞自噬性凋亡的功能基序。除編碼CVB3-2B aa36-aa83氨基酸序列的核苷酸序列以外，還包括含有上述核苷酸序列的原核或真核表達(dá)載體以及含有原核或真核表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也當(dāng)然屬于本發(fā)明的保護范疇之列。該蛋白基序可應(yīng)用于制備治療腫瘤的藥物，可將其制成活性成分，在腫瘤治療中通過各種途徑給藥，包括但不限于腫瘤內(nèi)給藥以及局部腫瘤血管內(nèi)給藥或通過脂質(zhì)體包裝該病毒2B蛋白自噬功能基序為一種脂質(zhì)體藥物制劑直接導(dǎo)入腫瘤內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤效應(yīng)。 此外，該蛋白基序還可用于聯(lián)合其他自噬功能蛋白或其自噬功能基序治療腫瘤。也可用于聯(lián)合其他治療惡性腫瘤的手段如化學(xué)藥物療法、局部或腫瘤內(nèi)放射療法等手術(shù)治療手段， 而作為一種輔助治療腫瘤的手段。以柯薩奇病毒蛋白為活性成分制備抗腫瘤藥物具有以下優(yōu)點(1)作為良好的自噬誘導(dǎo)劑，抑制腫瘤細(xì)胞的生長；(2)此氨基酸基序為病毒蛋白的一段氨基酸，不含有活病毒，無致病性；(3)此氨基酸基序分子量小，易于加工、吸收。


圖1是柯薩奇病毒B組3型2B與綠熒光蛋白融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建模式圖；圖2是熒光顯微鏡觀察CVB3_2B36_83在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)；圖3是熒光顯微鏡觀察CVB3_2B36_83誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中LC3聚集情況；圖4是CVB3_2B36_83誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞LC3的表達(dá)；圖5是電鏡觀察CVB3_2B36_83引起HeLa細(xì)胞凋亡。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1柯薩奇病毒B組3型2B融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞表達(dá)鑒定本實施例中的CVB3_2B36_83自噬功能基序氨基酸序列為(SEQ ID NO. 1所示)Asp-Ser-Ile-Leu-Glu-Lys-Ser-Leu-Lys-Ala-Leu-Val-Lys-Ile-Ile-Ser-Ala-L eu-Val-IIe-Val-Val-Arg-Asn-His-Asp-Asp-Leu-IIe-Thr-Val-Thr-Ala-Thr-Leu-Ala-Le u-IIe-Gly-Cys-Thr-Ser-Ser-Pro-Trp-Arg-Trp-Leu本實施例中的CVB3_2B36_83自噬功能基序核苷酸序列為(SEQ ID NO. 2所示)GACTCCATCTTAGAGAAGTCTCTAAAAGCCTTAGTTAAGATAATATCAGCCTTAGTAATTGTGGTGAGG AACCACGATGACCTAATCACGGTGACTGCCACACTAGCCCTCATTGGTTGTACCTCGTCCCCATGGCGGTGGCTT1. 1CVB3_2B36_83與綠熒光蛋白(EGFP)融合基因的表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1. 1CVB3-2B、CVB3_2B36_83 核酸片段的制備以含有 CVB3 全基因的質(zhì)粒 pMKSl (Mark K. Slifka, Robb Pagarigan，Ignacio Mena, Ralph Feuer, J.Lindsay ffhitton. Using recombinant coxsackievirus B3to evaluate the induction and protective efficacy of CD8+T cells during picornavirus infection. J Virol. 2001 ；75 (5) :2377-2387.)為模板，引物為2B PF :5，ATATATAAGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGAG TGAAGGACTATGTGGAAC3‘；2B PR :5’ ATAGCGTCTAGATTATTGGCGTTCAGCCATGGGTATTCCGT3，；2B36_83PF 5 ’ ATATATAAGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGA CTCCATCTTAGAGAAGTCTCT3‘； 2B36_83PR 5 ’ ATATATTCTAGATTAAAGCCACCGCCATGGGGACGAGGTAC3 ’引物2B PF、2B I3R用于擴增CVB3-2B全長基因，引物2B36_83PF、2B36_83PR用于擴增 CVB3-2B36_83 基因。用上述引物PCR擴增CVB3-2B基因、CVB3_2B36_83基因片段，DNA聚合酶為LA Taq DNA Polymerase (購自日本 TaKaRa)。反應(yīng)條件95°C5min，95°C 45s，61°C 45s, 72°C lmin，共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸 IOmin01. 1. 2pEGFP-Cl質(zhì)粒平臺的構(gòu)建以pcDNA3. 1 (+)(購自美國Invitrogen)作為基本質(zhì)粒骨架，從pEGFP-Nl質(zhì)粒 (購自美國Irwitrogen)上擴增出EGFP的核酸片段，將綠熒光蛋白EGFP基因片段插入 pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒，構(gòu)建pEGFP-Cl質(zhì)粒平臺，用于CVB3各功能蛋白與EGFP的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。1. 1. 2. IEGFP核酸片段的制備在上下游引物的5’端分別加入限制性內(nèi)切酶核酸位點NheI(TAGCTA)和 HindIII (AAGCTT)用于之后的載體連接。以pEGFP-Nl為模板，利用引物PF_pEGFP_Cl (5' -A TATATAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3')和PR-pEGFP-Cl(5' -GCTTTAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3' ) PCR擴增3，端不含終止密碼子的EGFP片段。反應(yīng)條件為95°C 5min， 95°C 45s, 56°C 45s, 72°C lmin，共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸 lOmin，DNA 聚合酶為 LA Taq DNA Polymerase (購自日本TaKaRa)。膠回收純化EGFP片段(膠回收試劑盒購自中國華舜)，膠回收操作參考試劑說明書。雙酶切EGFP片段后再通過膠回收的方法進行純化。雙酶切反應(yīng)條件為37°C 4h， 限制性內(nèi)切酶NheI和HindIII (購自日本TaKaRa)，膠回收純化酶切后的目的片段。1. 1. 2. 2克隆用載體的制備所用載體由NheI和HindIII雙酶切質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)后膠回收而獲得。雙酶切反應(yīng)條件為37°C 4h，限制性內(nèi)切酶NheI和HindIII (購自日本TaKaRa)，膠回收純化酶切后的目的載體。1. 1. 2. 3目的片段與載體的連接按目的片段與各自載體5 1的質(zhì)量比建立連接體系，混勻后，16°C過夜連接。 T4DNA Ligase (購自日本 TaKaRa)。1. 1.2. 4將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并鑒定陽性克隆1.1. 3pEGFP-2B、pEGFP_2B36_83 融合重組質(zhì)粒的構(gòu)建應(yīng)用限制性內(nèi)切酶核酸位點Hindi 11 (AAGCTT)和XbaI (TCTAGA)對pEGFP_Cl進行雙酶切處理并對酶切后開環(huán)質(zhì)粒進行膠回收。再分別與CVB3-2B、CVB3-2B36_83核酸片段連接，并在EGFP讀碼框下游連接了保證兩側(cè)蛋白空間結(jié)構(gòu)相對獨立的柔性連接(5’-GGTGGAG GCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3，)，載體構(gòu)建如圖1所示,可分別得到所述的兩種融合蛋白表達(dá)載體pEGFP-CVB3-2B36_83及pEGFP_CVB3_2B。載體測序結(jié)果正確。1.2融合蛋白的表達(dá)1.2.1真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗將人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞(購自美國ATCC)以2 X IO4 個/孔的密度鋪于48孔板內(nèi)，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85% -90%時，將0. 8 μ g的融合蛋白質(zhì)粒pEGFP-CVB3-2B36_83及pEGFP_CVB3_2B 分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)，所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipof ectamine 2000 (購自美國hvitrogen)， 轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。1. 2. 2培養(yǎng)1 后在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)試驗結(jié)果見圖2，從試驗結(jié)果可見，CVB3-2B、CVB3_2B36_83均與EGFP融合蛋白可以表達(dá)綠色熒光。實施例2病毒蛋白表達(dá)載體引起HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡2. 1.融合重組質(zhì)粒與pmCherry-LC3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞觀察細(xì)胞自噬2. 1. lpmCherry-LC3 質(zhì)粒構(gòu)建2. 1. 1. 1LC3目的片段的獲取應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI (購自日本TaKaRa)酶切pEGFP_LC3 (Kabeya Y, Mizushima N,Ueno Τ,Yamamoto A,Kirisako Τ,Noda Τ,Kominami Ε,Ohsumi Y,Yoshimori Τ. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000 ；19 (21) :5720-5728.)獲取目的片段LC3，雙酶切核酸片段反應(yīng)條件為37°C 4h。膠回收純化酶切后的LC3目的片段。2. 1. 1. 2克隆用載體pmCherry-Cl的制備
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應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI酶切載體pmCherry-Cl (購自日本Clontech公司)，雙酶切核酸片段反應(yīng)條件為37°C 4h。膠回收純化酶切后的載體。2. 1. 1. 3目的片段與載體的連接按目的片段與載體5 1的質(zhì)量比建立連接體系，混勻后，16°C過夜連接。T4DNA Ligase (購自日本 TaKaRa)。2. 1. 1.4將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并鑒定陽性克隆
2.1.2融合重組質(zhì)粒與pmCherry_LC3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa將人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞(購自美國ATCC)以2X IO4個/孔的密度鋪于48孔板內(nèi)，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85% -90% 時，將 0. 8 μ g 的融合蛋白質(zhì)粒 pEGFP-CVB3-2B36_83 及 pEGFP_CVB3_2B，分別與 0. 8 μ g 的 pmCherry_LC3質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)，所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000 (購自美國hvitrogen)，轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。培養(yǎng)1 后在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白與 LC3的定位情況。試驗結(jié)果見圖3，從試驗結(jié)果可見，帶有紅色熒光的LC3發(fā)生點狀聚集，說明融合蛋白引起細(xì)胞自噬。2. 2融合基因表達(dá)載體誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-II與LC3-I的表達(dá)2. 2. 1融合重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞將人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞(購自美國ATCC)以1 X IO5個/孔的密度鋪于6孔板內(nèi)，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85% -90% 時，將 4 μ g 的融合蛋白質(zhì)粒 pEGFP-CVB3-2B36_83，pEGFP_CVB3_2B 及對照 pEGFP-Cl (NC)，分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)，所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipof ectamine 2000 (購自美國hvitrogen)，轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。2. 2. 2表達(dá)產(chǎn)物的收獲轉(zhuǎn)染1 后，每孔加入200 μ L的1 XPBS，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來，放入2ml離心管中，1500轉(zhuǎn)離心5min。小心棄掉上清，在離心管中加入300 μ L已經(jīng)放好蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解lOmin。離心14，000轉(zhuǎn)4°C lOmin，用1. 5mL 離心管收取上清液，分裝放入-20°C冰箱儲存。2. 2. 3利用特異性抗體通過western blotting方法檢測LC3-II與LC3-I的表達(dá)2.2.3. 1聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳向125 μ L收獲的細(xì)胞上清中加入 25 μ L6X loading buffer (0. 35M Tris-HCl ρΗ6· 8，30 % 甘油，10 % SDS，0· 012 % 溴酚藍(lán)， 6% β-巰基乙醇)或 6Xnon-reduced loading buffer (0. 35M Tris-HCl ρΗ6·8，30% 甘油，10% SDS，0. 012%溴酚藍(lán))，充分混勻，100°C煮沸2min，離心8000轉(zhuǎn)，4°C lOmin，蛋白樣品加載至8% SDS-PAGE凝膠中，80V電泳lh, 120V電泳2h。2. 2. 3. 2ffestern blotting 電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉于4°C封閉過夜。封閉后的PVDF膜與兔抗人LC3單克隆抗體(1 500，購自美國MBL) 于37°C孵育lh，再與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(購自中國中杉金橋)于 37°C孵育lh。加入過氧化物酶底物，顯示蛋白條帶。試驗結(jié)果見圖4，從試驗結(jié)果可見，CVB3-2B、CVB3-2C、CVB3-3A組可以促進LC3II/ LC3I 的比值增加，但 CVB3-;3B 無此作用。CVB3_2B36_83、CVB3-2CU、CVB3_3A51_89 組也可促進 LC3II/LC3I的比值增加。
2. 3利用電鏡觀察融合基因表達(dá)載體誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡將人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞(購自美國ATCC)以1 X IO5個/孔的密度鋪于6孔板內(nèi)，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85% -90% 時，將4yg的融合蛋白質(zhì)粒，5 μ L脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，所用的轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine 2000 (購自美國hvitrogen)，轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。培養(yǎng)1 后在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)。棄掉板內(nèi)培養(yǎng)液，加入ImL 1父？85( !17.4)，靜置5111土11， 棄掉重復(fù)3次，用消化液消化，用500 μ Ll XPBS (ρΗ7. 4)將細(xì)胞吹勻放入500 μ L離心管中， 1500轉(zhuǎn)離心IOmin棄上清。每個離心管中加入500 μ L戊二醛固定液，固定4 后，電鏡觀察。試驗結(jié)果見圖5，從試驗結(jié)果可見，pEGFP-CVB3-2B、pEGFP-CVB3-2B36_83轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，發(fā)生凋亡。
權(quán)利要求
1.含有SEQID NO. 1所示序列的蛋白質(zhì)在制備治療腫瘤藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的蛋白質(zhì)為柯薩奇B3病毒2B蛋白，優(yōu)選的所述的蛋白質(zhì)為截短型柯薩奇B3病毒2B重組蛋白，更優(yōu)選的所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
3.權(quán)利要求2所述的氨基酸序列如SEQID NO. 1所示的蛋白質(zhì)。
4.編碼權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQID NO. 2所7J\ ο
6.一種表達(dá)載體，其特征在于含有如權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為真核表達(dá)載體，優(yōu)選的所述表達(dá)載體為pEGFP-Cl。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有如權(quán)利要求6或7所述的表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞。
10.權(quán)利要求4所述的核苷酸序列在制備治療腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有柯薩奇B3病毒2B蛋白中36-83位氨基酸基序(SEQ ID NO.1所示)的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的蛋白質(zhì)為柯薩奇B3病毒2B蛋白及其截短型蛋白，更優(yōu)選為SEQ ID NO.1所示的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及編碼該所述的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，含有該核苷酸序列的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞，將所述的載體轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，可進一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡，證明所表達(dá)的蛋白具有引起腫瘤細(xì)胞自噬而抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。
文檔編號C12N15/41GK102512662SQ201110422868
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者佟雷, 林樂勛, 王燕, 王瑞雪, 秦穎, 趙文然, 鐘照華 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)