專(zhuān)利名稱(chēng)：一種表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯液體深層發(fā)酵制備的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用白腐真菌液體深層發(fā)酵制備表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的工藝，屬于生物技術(shù)或生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)是抗氧化活性最強(qiáng)的茶兒茶素，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)。目前主要從茶葉中獲得，然而從茶葉中提取分離存在以下幾個(gè) 問(wèn)題:需要有機(jī)溶劑提取，獲得的混合物需要繁瑣的純化過(guò)程導(dǎo)致成本高和環(huán)境影響，以及得率低。制備方法存在著有害有機(jī)溶劑(氯仿、二氯甲烷)殘留問(wèn)題；獲得高純度表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的純化制備成本高、價(jià)格昂貴；提取物的顏色較深影響在飲料、高檔護(hù)膚品中應(yīng)用等問(wèn)題。而植物組織細(xì)胞培養(yǎng)又面臨不經(jīng)濟(jì)和難以大規(guī)模培養(yǎng)的問(wèn)題，因此科學(xué)界已經(jīng)過(guò)10年努力尚沒(méi)有商業(yè)化大規(guī)模的植物組織細(xì)胞產(chǎn)茶兒茶素的系統(tǒng)出現(xiàn)。真菌被人類(lèi)發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)、利用已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，最為人們所熟知的是大型食藥用真菌。它們不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有的許多成分有較強(qiáng)的生理和藥理活性?，F(xiàn)代研究表明高級(jí)擔(dān)子菌具有廣泛的治療和預(yù)防疾病的功能。多孔菌真菌是擔(dān)子菌中的一大類(lèi)群，我國(guó)的菌類(lèi)藥物中許多屬于這一類(lèi)真菌，如有名的傳統(tǒng)中藥?kù)`芝、豬苓、茯苓等等。采用液體深層發(fā)酵的方法，和傳統(tǒng)的真菌培育方法相比，具有生產(chǎn)周期短，成本低，產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品可以控制等優(yōu)越性。利用生物技術(shù)生產(chǎn)真菌的生物有效成分是必然的趨勢(shì)，目前國(guó)際上已有許多藥用真菌商業(yè)上采用液體深層發(fā)酵來(lái)獲得有效成分。自1948年美國(guó)成功地對(duì)蘑菇進(jìn)行深層發(fā)酵和1957年以發(fā)酵罐對(duì)羊肚菌的液體深層培養(yǎng)以來(lái)，液體深層發(fā)酵技術(shù)在食藥用菌制種、綜合利用等方面的應(yīng)用日趨廣泛。目前，世界上已有50多種食藥用菌進(jìn)行了液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)已進(jìn)行深層發(fā)酵并工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的食藥用菌有冬蟲(chóng)夏草、云芝、靈芝、銀耳、猴頭、竹蓀、豬苓、蜜環(huán)菌、香菇、麥角菌、小杯珊瑚菌、小刺猴頭
坐寸ο在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，各種理化因素都會(huì)影響真菌的生長(zhǎng)速度、生物量以及代謝途徑，所以開(kāi)發(fā)合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是提高食藥用真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量，得到高活性產(chǎn)物的有效途徑。本發(fā)明利用白腐真菌液體深層發(fā)酵制備表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)，而且為了提高白腐真菌在液體深層發(fā)酵中EGCG和ECG的生物合成，在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘蔗渣、玉米秸桿、稻桿、麥桿和木屑，以及脂肪酸、有機(jī)溶劑、表面活性劑等促進(jìn)劑，來(lái)提高EGCG和ECG的產(chǎn)量。本發(fā)明以屬于白腐真菌的珍稀藥用真菌樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又名白樺茸為例。樺褐孔菌屬擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，非褐菌目，多孔菌科，褐臥孔菌屬。生于白樺、銀樺、榆樹(shù)、赤楊等的樹(shù)皮下或砍伐后的枯干上。十六世紀(jì)以來(lái)，樺褐孔菌作為一種民間藥用真菌，在俄羅斯及西伯利亞、東歐地區(qū)被用來(lái)防治疑難雜癥，包括糖尿病、傳染性病毒及多種癌癥，被認(rèn)為是具有顯著的藥理活性而對(duì)人體沒(méi)有任何副作用的一種藥用真菌。本發(fā)明利用纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解以及促進(jìn)劑的作用來(lái)提高樺褐孔菌液體發(fā)酵的EGCG和ECG生物合成的效率，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以生產(chǎn)樺褐孔菌液體發(fā)酵兒茶素類(lèi)物質(zhì)EGCG和ECG為目標(biāo)，建立了一種樺褐孔菌液體發(fā)酵高效、高產(chǎn)制備EGCG和ECG的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案:樺褐孔菌真菌為出發(fā)菌種，采用斜面菌種進(jìn)行液體種子培養(yǎng)。在玉米淀粉水解糖為發(fā)酵碳源的基礎(chǔ)上，在液體培養(yǎng)基中添加一定量的秸桿或木屑、以及脂肪酸、有機(jī)溶劑、表面活性劑，進(jìn)行液體深層發(fā)酵。發(fā)酵條件為:27_28°C，空氣流量
0.5-1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為70-150轉(zhuǎn)/分鐘，內(nèi)部壓力0.1-0.25公斤/立方厘米，發(fā)酵周期10-14天。胞外EGCG和ECG的產(chǎn)量提高200%以上。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體步驟如下:(1)取出斜面菌株接入新鮮配置的斜面培養(yǎng)基中，斜面菌種培養(yǎng)溫度為25-30°C，培養(yǎng)200-250小時(shí)。(2)將步驟I中的斜面菌種轉(zhuǎn)入裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，液體種子培養(yǎng)條件:溫度為27-28°C，搖床轉(zhuǎn)速70-150轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)96-120小時(shí)。(3)將步驟2中的液體菌種轉(zhuǎn)入裝有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進(jìn)行液體深層發(fā)酵。發(fā)酵條件:溫度為27-28°C，搖床轉(zhuǎn)速70-150轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)288小時(shí)。本發(fā)明中斜面菌種培養(yǎng)基組成(g/100mL):麥芽浸膏30，蛋白胨3，瓊脂15。pH值為 5.4-5.6。本發(fā)明中搖瓶種子培養(yǎng)基組成(g/100mL):葡萄糖2，蛋白胨0.3，酵母浸膏0.2，KH2P04 0.1，MgS04 0.15，CaCl2 0.01。本發(fā)明中秸桿液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/100mL):玉米粉5，蛋白胨0.3，KH2P04 0.1，ZnS04.2H20 0.001, K2HP04 0.04, FeS04.7H20 0.005, MgS04.7H20 0.05，CuS04.5H200.002，CoC12 0.001，MnS04.H20 0.008。pH值 6.0。本發(fā)明的發(fā)酵終點(diǎn)確立的標(biāo)準(zhǔn)為還原糖含量低于2%，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開(kāi)始衰老。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體說(shuō)明實(shí)施例1:在斜面培養(yǎng)基中接種荷蘭CBS菌種保藏庫(kù)的樺褐孔菌菌絲體。培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)240小時(shí)。將新鮮的斜面菌種接入裝有200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，28°C培養(yǎng)96小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘。將培養(yǎng)好的液體種子按照10% (v/v)接入裝有稻桿發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。28°C培養(yǎng)約288小時(shí)。空氣流量1.0vvm,內(nèi)部壓力0.2公斤/立方厘米，攪拌轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘。本實(shí)施例1中斜面菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成是(g/100mL):麥芽浸膏25,蛋白胨4,瓊脂 15，pH 值為 5.4-5.6。
本實(shí)施例1中搖瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成(g/100mL):葡萄糖3，蛋白胨0.4，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.1，MgS04 0.15，CaCl2 0.01。本實(shí)施例1中玉米秸桿液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成(g/100mL):玉米粉3.5，木屑粉末 4，油酸 0.1，蛋白胨 0.2，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.LZnSO4.2Η20 0.0OLK2HPO4 0.04,FeSO4.7Η20 0.005，MgSO4.7Η20 0.05，CuSO4.5Η20 0.002。pH 值為 6.0。本實(shí)施例1中發(fā)酵終止的標(biāo)準(zhǔn)為還原糖含量低于2%，鏡檢菌絲體出現(xiàn)衰老癥狀。發(fā)酵胞外EGCG和ECG的提取:發(fā)酵結(jié)束后用真空抽濾法分離出發(fā)酵液，或是經(jīng)乙醇沉淀分離多糖后的發(fā)酵濃縮液，用體積比1:1乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮、真空或冷凍干燥獲總兒茶素。采用色譜等方法進(jìn)一步純化。圖1為液體深層發(fā)酵過(guò)程中胞外EGCG和ECG含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律。樺褐孔菌在本發(fā)明秸桿發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生胞外發(fā)酵EGCG和ECG的產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，在發(fā)酵第13天達(dá)到最高。產(chǎn)量比對(duì)照培養(yǎng)基中所產(chǎn)生胞外發(fā)酵EGCG和ECG提高400%。實(shí)施例2:在斜面培養(yǎng)基中接種荷蘭CBS菌種保藏庫(kù)的樺褐孔菌菌絲體。培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)240小時(shí)。將新鮮的斜面菌種接入裝有200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，28°C培養(yǎng)96小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分鐘。將培養(yǎng)好的液體種子按照10% (v/v)接入裝有木屑發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。28°C培養(yǎng)約302小時(shí)?？諝饬髁?.5vvm,內(nèi)部壓力0.1公斤/立方厘米，攪拌轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘。本實(shí)施例2中斜面菌種培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是(g/100mL):麥芽浸膏25,蛋白胨4,瓊脂 15，pH 值為 5.4-5.6。

本實(shí)施例2中搖瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成(g/100mL):葡萄糖3，蛋白胨0.4，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.1，MgS04 0.15, CaCl2 0.01。搖床轉(zhuǎn)速為 150 轉(zhuǎn) / 分鐘。本實(shí)施例2中液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成(g/100mL):玉米粉2.5，玉米/水稻/ 麥秸桿粉末 3.5，吐溫 80 0.1，蛋白胨 0.2，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.1，ZnSO4.2H20 0.001，K2HPO40.04，F(xiàn)eSO4.7H20 0.005，MgSO4.7H20 0.05，CuSO4.5H20 0.002。pH 值 6.0。本實(shí)施例2中發(fā)酵終止的標(biāo)準(zhǔn)為還原糖含量低于2%，鏡檢菌絲體出現(xiàn)衰老癥狀。樺褐孔菌在本發(fā)明秸桿發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生胞外發(fā)酵EGCG和ECG的產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，在發(fā)酵第9天達(dá)到最高(附圖1，藍(lán)色曲線)。產(chǎn)量比對(duì)照培養(yǎng)基中所產(chǎn)生胞外發(fā)酵EGCG和ECG提高300% (附圖1，紅色曲線)。


圖1是樺褐孔菌液體深層發(fā)酵過(guò)程中胞外EGCG和ECG產(chǎn)量圖，發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(紅色曲線)，添加秸桿培養(yǎng)基(藍(lán)色曲線)，添加木屑培養(yǎng)基(黑色曲線)。
權(quán)利要求
1.一種利用白腐真菌，液體深層發(fā)酵生產(chǎn)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的方法。其特征是以白腐真菌為出發(fā)菌種，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶種子培養(yǎng)，發(fā)酵罐發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中除采用傳統(tǒng)的玉米淀粉水解糖或葡萄糖為發(fā)酵碳源，另補(bǔ)充一定量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，使菌種在發(fā)酵過(guò)程中除利用玉米淀粉水解糖外，分解利用這些物質(zhì)。同時(shí)在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的脂肪酸、有機(jī)溶劑、表面活性劑。此方法大大提高了液體深層發(fā)酵表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用白腐真菌發(fā)酵制備表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的方法，其特征是以白腐真菌如樺褐孔菌為出發(fā)菌種的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1利用玉米秸桿液體深層發(fā)酵生產(chǎn)白腐真菌如樺褐孔菌發(fā)酵制備表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的工藝，其特征是添加玉米秸桿、水稻秸桿、大、小麥秸桿、甘蔗渣、木屑、廢紙等含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素類(lèi)的廢棄物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1利用玉米秸桿液體深層發(fā)酵生產(chǎn)白腐真菌如樺褐孔菌發(fā)酵制備表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的工藝，其特征是添加脂肪酸(亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸)、有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、正己烷、甲苯)、表面活性劑(吐溫 80、吐溫 20、Span80、Triton X-100)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1利用白腐真菌如樺褐孔菌發(fā)酵制備表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的方法，其特征是液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，以及脂肪酸、有機(jī)溶劑、表面活性劑，培養(yǎng)基組成(g/100mL):玉米粉3-5，農(nóng)作物秸桿粉末或木屑2-10%，脂肪酸、有機(jī)溶劑、表面活性劑0.1-0.5%，蛋白胨 0.2，酵母浸膏 0.1，KH2PO4 0.1，ZnSO4.2H20 0.001，K2HPO4 0.04，F(xiàn)eSO4.7H20 0.005，MgSO4.7H20 0.05，CuSO4.5H20 0.002。pH 值 6.0。液體發(fā)酵條件:27-28 °C，空氣流量·0.5-1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速70-150轉(zhuǎn)/分鐘，內(nèi)部壓力0.1-0.25公斤/立方厘米，發(fā)酵周期12-14 天。
全文摘要
通過(guò)添加纖維素、半纖維素和木質(zhì)素、以及脂肪酸、有機(jī)溶劑和表面活性劑提高白腐真菌液體深層發(fā)酵的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的產(chǎn)量的方法。以通過(guò)液體深層發(fā)酵白腐真菌如樺褐孔菌兒茶素類(lèi)物質(zhì)為目標(biāo)，以荷蘭CBS菌種庫(kù)樺褐孔菌為出發(fā)菌種，進(jìn)行液體發(fā)酵罐發(fā)酵。發(fā)酵條件27-28℃，空氣流量0.5-1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速80-160轉(zhuǎn)/分鐘，內(nèi)部壓力0.15-0.35公斤/立方厘米，發(fā)酵周期10-14天。此方法提高樺褐孔菌液體深層發(fā)酵的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12P17/06GK103146775SQ201110403598
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者徐向群 申請(qǐng)人:徐向群