專利名稱：一株芽孢桿菌及其在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株芽孢桿菌及其在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白酶(Protease)能夠水解蛋白質(zhì)肽鍵，廣泛存在于細菌、放線菌、真菌、病毒、植物與動物體內(nèi)，在自然界物質(zhì)循環(huán)和生物體新陳代謝中發(fā)揮重要作用。蛋白酶不僅在自然界與生物體中具有重要作用，而且是一種非常重要的工業(yè)生物催化劑，采用酶制劑取代傳統(tǒng)化學(xué)生產(chǎn)工藝，在降低污染、減少能耗、保護環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用。自從19世紀(jì)50年代酶制劑被首次發(fā)現(xiàn)，已被普遍應(yīng)用于各種生產(chǎn)行業(yè)中，如洗滌劑、食品、化妝品、水產(chǎn)飼料、制革、紡織、醫(yī)藥和生物化學(xué)試劑等領(lǐng)域，目前已占世界酶制劑銷售總量的60%。隨著社會的快速發(fā)展和經(jīng)濟的迅猛提升，各行業(yè)對酶制劑的品種和性能要求越來越高，同時又要求酶制劑成本進一步降低。目前工業(yè)蛋白酶常用深層液體發(fā)酵法生產(chǎn)，也可以用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)，其中培養(yǎng)基占據(jù)了 30%-40%的生產(chǎn)成本，因而在獲得適用于工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)酶菌株后，還必須對菌種的發(fā)酵條件進行優(yōu)化以獲得最佳生產(chǎn)工藝。由于蛋白酶一般在生長穩(wěn)定期大量產(chǎn)生，其發(fā)酵生產(chǎn)受到分解代謝阻遏的調(diào)控，酶產(chǎn)量也很大程度上受到碳氮影響。此外，其它理化因素，如溶氧量、接種量、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)基PH等因素也會影響酶產(chǎn)量，很難實現(xiàn)蛋白酶產(chǎn)量的高效穩(wěn)定提高。因此，采用發(fā)酵條件優(yōu)化可實現(xiàn)蛋白酶的高效穩(wěn)定生產(chǎn)，是降低蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)成本的重要方法之一，對蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)具有非常重要的現(xiàn)實意義。目前上述蛋白酶發(fā)酵技術(shù)雖然可以在一定程度上提高蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)效率，但是還存在以下問題和不足之處其一，多數(shù)菌株酶產(chǎn)量不高，發(fā)酵條件優(yōu)化后酶產(chǎn)量提高不顯著，往往在實際應(yīng)用中產(chǎn)生不理想的結(jié)果；其二，大多技術(shù)所使用培養(yǎng)基常為高濃度的復(fù)合營養(yǎng)成分，發(fā)酵原料較昂貴，雖然也有一些技術(shù)也采用了廉價原料，但是酶產(chǎn)量沒有明顯提高，因而在單位酶產(chǎn)量的發(fā)酵原料上沒有明顯降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株芽孢桿菌及其在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一株產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌(Bacillus sp. )BS036，該菌種已于2011年08月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 5178。芽孢桿菌(Bacillus sp.)BS036 CGMCC No. 5178簡稱菌株BS036。芽孢桿菌又稱芽胞桿菌。本發(fā)明還保護一種種子培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和水組成；所述溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度如下葡萄糖4-20g/L(優(yōu)選為5-15g/L)、蛋白胨3_8g/L、酵母粉3_8g/L、KH2P040. 5-1. 5g/L、MgSO4 0. 1-1. Og/L和Na2CO3 5_15g/L。所述種子培養(yǎng)基可為自然pH，可也為PH7. 0-11. 5，優(yōu)選為pHll. 0。所述溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度具體如下葡萄糖10g/L、蛋白胨 5g/L、酵母粉 5g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4 0. 2-0. 8g/L 和 Na2CO3 10g/L。
本發(fā)明還保護一種發(fā)酵培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和水組成；所述溶質(zhì)由碳源、氮源和無機鹽組成；所述碳源可為葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜、麥芽糖和小麥麩皮中的至少一種；所述氮源可為棉籽餅粉、豆餅粉、大豆蛋白胨、酪素、水溶性植物水解蛋白、魚蛋白胨、酵母粉和Oxide蛋白胨中的至少一種；所述無機鹽可為檸檬酸鈉、NaN03> CaCl2, FeSO4, CuSO4,ZnCl2, KH2PO4, MgSO4 和 Na2CO3 中的至少一種。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可為自然pH，可也為pH7. 0至11.5(7. 0、8.0、9.0、9.5、10.0、10. 5、11. 0 或 11. 5)，優(yōu)選為 ρΗ9· 0-11. 0，最優(yōu)選為 pHll. 0。每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述碳源的加入量可為4-Mg。每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述氮源的加入量可為4_20gL。每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種所述無機鹽的加入量可為0. 064_20g。所述碳源可為葡萄糖(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入4、8、12、16或20力、玉米粉(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、9、12、15、18、21或Mg)、可溶性淀粉(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、9、12、15或18g)、糖蜜(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、9、12、15、18或21g)、麥芽糖(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、
9、12、15或18g)和小麥麩皮(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、9、12、15、18或21g)中的至少一種。所述氮源可為棉籽餅粉(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、8、10、12或14g)、豆餅粉(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入4、6、8、10、12或14g)、大豆蛋白胨(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入8、10、12、14或16g)、酪素(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入8、10、12、14或16g)、水溶性植物水解蛋白(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入1、2、3、4、5、6或7g)、魚蛋白胨(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入8、10、12、14或16g)、酵母粉(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入8、10、12、14或16g)和Oxide蛋白胨(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入6、8、
10、12、14、16、18或 20g)中的至少一種。所述無機鹽可為檸檬酸鈉(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入2、3、4、5或6g)、NaN03(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入4、8、12、16或20g)、CaCl2 (每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入0. 2、0. 4、0. 6、0. 8或1. Og)、FeSO4 ·7Η20(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入0. 6,1. 2,1. 8,2. 4或3. 0g) ,CuSO4 ·5Η20(每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4 或 0. 5g)、ZnC12 (每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4 或 0. 5g)、KH2PO4 (每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入0. 4、0. 8、1. 2、1. 6或2. 0g) ,MgSO4 (每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入0. 2、0. 4、0. 6、0. 8或l.Og)和Na2CO3 (每升發(fā)酵培養(yǎng)基加入5.0、10. 0或15. Og)中的至少一種。所述溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下葡萄糖5_15g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母粉 3-8g/L、KH2PO4 0. 5-1. 5g/L、MgSO4 0. 1-1. Og/L 和 Na2CO3 5_15g/L。所述溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體如下葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH2P04 lg/L、MgSO4 0. 2-0. 8g/L 和 Na2CO3 10g/L。所述溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下玉米粉18. 0-20. 0g/L (18. 0g/L、18. 9g/L、19. 0g/L 或 20. Og/L)、大豆蛋白胨 6. 0-7. 0g/L (6. 0g/L,6. lg/L、6. 5g/L 或 7. Og/L)、檸檬酸鈉 2. 0-6. Og/L(2. 0g/L、4. Og/L 或 6. Og/L)、MgSO4 0. 1-1. 2g/L(0. Ig/L、0. 4g/L、0. 7g/L 或 1. 2g/L)、KH2PO4 1. 0-1. 2g/L(l. 0g/L、l. lg/L 或 1. 2g/L)、CaCl2 0. 2-1. 2g/L(0. 2g/L、l. Og/L 或 1. 2g/L)和 Na2CO3 10. 0g/L。本發(fā)明還保護一種制備所述芽孢桿菌BS036的種子液的方法，包括如下步驟將所述芽孢桿菌BS036接種于所述種子培養(yǎng)基中，26-37°C、120-220rpm振蕩培養(yǎng)，得到種子液。所述振蕩優(yōu)選為200rpm振蕩。所述振蕩培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30-34°C，最優(yōu)選為340C。所述種子液的 OD600 為 0. 5-18. 0 (0. 5、1. 0、3. 0、7. 0、9. 0、12. 0、14. 0 或 18. 0)，優(yōu)選為3. 0-12. 0，更優(yōu)選為 7. 0 至 12. 0。本發(fā)明還保護一種制備蛋白酶的方法，是發(fā)酵所述芽孢桿菌BS036，得到蛋白酶。所述方法包括如下步驟將以上所述方法制備得到的種子液接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，26-37°C、120-220rpm振蕩培養(yǎng)，得到蛋白酶。所述振蕩優(yōu)選為200rpm振蕩。所述振蕩培養(yǎng)的溫度可為26-37°C (洸1、沘1、301、321、341或37°0，優(yōu)選為30_37°C，最優(yōu)選為;34°C。所述種子液的接種量可為0.5%-5.0% (0. 5%、1.0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%或5. 0% )，優(yōu)選為1. 5% -5. 0%，最優(yōu)選為2. 0%。所述振蕩培養(yǎng)的時間可為3-48小時，優(yōu)選為M-40小時，最優(yōu)選為27-30小時。所述方法還可包括如下步驟將所述振蕩培養(yǎng)得到的發(fā)酵液12000X g離心lOmin，收集上清，即為粗酶液(含有蛋白酶)。以上所述方法制備得到的蛋白酶也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護采用以上所述方法制備得到的蛋白酶在降解蛋白中的應(yīng)用。應(yīng)用所述蛋白酶降解所述蛋白時，采用的溫度為20-90°C，采用的pH為5. 0-13. O。所述溫度可為20-90 "C (20 °C、30 °C、40 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 V、80 °C 或 90 °C )，優(yōu)選為 60-65 °C。所述pH可為 5. 0-13. 0(5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0,10. 0,11. 0,12. O 或 13. 0)，優(yōu)選為 10. 0-11. O。所述蛋白具體可為酪蛋白或偶聯(lián)酪蛋白。所述芽孢桿菌BS036在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供了一株產(chǎn)蛋白酶性能良好的菌株。本發(fā)明的蛋白酶生產(chǎn)菌種酶產(chǎn)量高，發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基配方簡單，廉價原料來源廣泛、價格低，發(fā)酵周期短，耗能低，蛋白酶生產(chǎn)效率高、成本低。本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述菌株高效生產(chǎn)蛋白酶的方法，采用此方法酶的生產(chǎn)周期縮短、產(chǎn)酶穩(wěn)定、成本低，酶產(chǎn)量可以達到1000-100000U/mL。


圖1為PCR擴增菌種BS036的ITS與GyrB基因產(chǎn)物電泳圖。圖2為芽孢桿菌蛋白酶發(fā)酵的培養(yǎng)基因素間相互作用三維空間響應(yīng)曲面圖及對應(yīng)的二維等高線圖A1與A2為玉米粉和大豆蛋白胨的相互作用圖；Bl與B2為玉米粉和KH2PO4的相互作用圖；Cl與C2為大豆蛋白胨和KH2PO4的相互作用圖。圖3為聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測芽孢桿菌BS036不同發(fā)酵時期的胞外蛋白酶。圖4為利用芽孢桿菌BS036發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵曲線圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。偶聯(lián)酪蛋白(Azocasein)購自美國Sigma-Aldrich公司，貨號為A2765。接種量(%)即種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比。蛋白酶酶活測定的方法以偶聯(lián)酪蛋白(Azocasein)為底物，將底物溶于緩沖液中配成lg/100mL的底物緩沖液；取1. 49mL底物緩沖液在預(yù)定溫度的水浴中預(yù)熱5分鐘，然后加入10 μ L待測溶液，快速混合，在所述預(yù)定溫度下反應(yīng)5分鐘，然后加入0.5mL 20%(體積比)三氯乙酸水溶液終止反應(yīng)，12000Xg離心IOmin收集上清，在440nm波長下測定上清液的光吸收值；一個酶活力單位(U)定義為每分鐘光吸收值改變0. 001所需要的酶量。實施例1、菌株BS036的篩選及鑒定一、菌株BS036的篩選利用酪素溶液從肥堆樣品中富集蛋白酶生產(chǎn)菌株，在酪素培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，在酪素平板上篩選蛋白水解圈最大的菌株，命名為菌株BS036。二、菌株BS036的生理化學(xué)特征鑒定將菌株BS036在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)小時，菌落呈黃色圓球形、濕潤粘稠、不透明，菌落隨培養(yǎng)時間逐漸變大。通過革蘭氏染色和顯微鏡觀察，該細菌為桿狀、革蘭氏陽性。生理生化實驗顯示，菌株BS036能夠生長于15-40°C、pH 7-11的條件下，具有水解蛋白和淀粉的能力，具體生理生化特征見表1。表1菌株BS036的生理生化特征
權(quán)利要求
1.芽孢桿菌(Bacillussp. BS036) BS036，它的保藏編號為 CGMCC NO. 5178。
2.權(quán)利要求1所述芽孢桿菌BS036的種子培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和水組成；所述溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度如下葡萄糖4-20g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母粉3-8g/L、KH2PO40. 5-1. 5g/L、MgSO4 0. 1-1. Og/L 禾Π Na2CO3 5_15g/L。
3.權(quán)利要求1所述芽孢桿菌BS036的發(fā)酵培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和水組成；所述溶質(zhì)由碳源、氮源和無機鹽組成；所述碳源為葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜、麥芽糖和小麥麩皮中的至少一種；所述氮源為棉籽餅粉、豆餅粉、大豆蛋白胨、酪素、水溶性植物水解蛋白、魚蛋白胨、酵母粉和Oxide蛋白胨中的至少一種；所述無機鹽為檸檬酸鈉、NaNO3^ CaCl2, FeSO4,CuSO4, ZnCl2, KH2PO4, MgSO4 和 Na2CO3 中的至少一種。
4.制備權(quán)利要求1所述芽孢桿菌BS036的種子液的方法，包括如下步驟將所述芽孢桿菌BS036接種于權(quán)利要求2所述種子培養(yǎng)基中，26-370C、120_220rpm振蕩培養(yǎng)，得到種子液。
5.一種制備蛋白酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述芽孢桿菌BS036，得到蛋白酶。
6.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟將權(quán)利要求4所述方法制備得到的種子液接種于權(quán)利要求3所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，26-37°C、120-220rpm振蕩培養(yǎng)，得到蛋白酶。
7.權(quán)利要求5或6所述方法制備得到的蛋白酶。
8.權(quán)利要求7所述蛋白酶在降解蛋白中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用所述蛋白酶降解所述蛋白時，采用的溫度為 20-90°C，采用的 pH 為 5. 0-13.0。
10.權(quán)利要求1所述芽孢桿菌BS036在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株芽孢桿菌及其在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.)BS036，保藏號為CGMCC NO.5178。本發(fā)明的蛋白酶生產(chǎn)菌種酶產(chǎn)量高，發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基配方簡單，廉價原料來源廣泛、價格低。本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述菌株高效生產(chǎn)蛋白酶的方法，采用此方法酶的生產(chǎn)周期縮短、產(chǎn)酶穩(wěn)定、成本低，酶產(chǎn)量可以達到1000-100000U/mL。
文檔編號C12R1/07GK102559537SQ20111036201
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者吳杰, 溫廷益, 鄧愛華 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所