專利名稱：生物材料及其用途的制作方法
生物材料及其用途
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年12月8日，申請(qǐng)?zhí)枮?00680051213. 0，題目為“生物材料及其用途”的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)有關(guān)的分子和用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物、方法及其用途。
目前，抗體不但是用于靶向癌癥的選擇性蛋白治療劑，也用于治療其他的癥候 (Brekke et al. Nat Rev Drug Discov 2003:2:52-62)。抗體工程的出現(xiàn)為從合成噬菌體文庫(kù)中產(chǎn)生人抗體提供了工具。由于人源的性質(zhì)和更好的多樣性，其表現(xiàn)出了降低的免疫原性且增高的特異性和親和性(Weiner et al. Nat Biotechnol 2005 ；23 :556-7) 天然文庫(kù)(na'ive library)特別引人注目，因?yàn)樗鼈儾灰蕾囉谛挛膸?kù)的免疫和重建，而可用于分離任何特異性的抗體，包括自身抗原(Griffiths et al. Embo J1993 ； 12 :725-34)。細(xì)胞表面受體目前組成了最成功的一類被當(dāng)前治療劑靶向的抗原，所述治療劑包括小分子抑制劑和抗體。特別有意思的是細(xì)胞表面受體，其在靶細(xì)胞中獨(dú)特表達(dá)或表現(xiàn)出增加的表達(dá)水平， 并且另外能夠向細(xì)胞中轉(zhuǎn)死亡或生存信號(hào)。這種具有內(nèi)在信號(hào)特性的、差異表達(dá)的受體使基于抗體靶向微生物感染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其它的功能障礙的細(xì)胞成為可能。
對(duì)于腫瘤的治療，能在靶標(biāo)腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡但不傷害正常組織的抗體特別有用。幾種此類單抗已經(jīng)被使用，其已在美國(guó)食品和藥品管理局登記并且為常規(guī)的癌癥治療如淋巴瘤(利妥昔單抗(rituximab)靶向⑶20)或乳腺癌(妥珠單抗(trastuzumab) 或西妥昔單抗(cetuximab)分別靶向Her_2和EGFR)提供了替代。
目前，在臨床研究中，也存在其他的具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的抗體。然而，即便這些抗體在患者或者動(dòng)物試驗(yàn)中顯示有益作用，但仍然存在未能滿足的臨床需要。
靶向B細(xì)胞腫瘤的抗獨(dú)特型的免疫球蛋白是第一個(gè)實(shí)施于人的單克隆抗體治療(Miller et al. N Engl J Med 1982 ;306 :517-2 。已經(jīng)表明通過被動(dòng)抗體施用 (Riechmann et al. Nature 1988 ;332 :323-7)或者用患者自身的腫瘤免疫球蛋白的主動(dòng)接種(Kwak et al.N Engl J Med 1992 ；327 =1209-15)方法的腫瘤細(xì)胞破壞，賦予患有不同類型B細(xì)胞惡性腫瘤的患者腫瘤消退(tumour regression)或腫瘤休眠(tumour dormancy) 0最近的一篇文獻(xiàn)描述了使用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生完全的人抗獨(dú)特型抗體(Suarez et al.Mol Immunol 2004 ;41 :519- )，該小鼠在產(chǎn)生小鼠抗體和表達(dá)選擇的人抗體鏈?zhǔn)交蜃?human antibody chain loci)方面是有缺陷的。
在本發(fā)明中，使用了競(jìng)爭(zhēng)生物淘洗(competition biopanning)法，其中將全細(xì)胞形式的靶細(xì)胞抗原和膜囊(membrance vesicles)形式的過量相減細(xì)胞抗原 (excess subtracter cell antigen)同時(shí)暴露于天然的CoDeR 抗體噬菌體文庫(kù)(W0 2004/023140 ；Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000 ； 18 :852-6)，以重新得到并隨后試驗(yàn)具有良好的B淋巴瘤靶細(xì)胞選擇性的抗體片段。而且，試驗(yàn)的抗體在靶細(xì)胞但不是在非靶細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，證明了所選擇的結(jié)合分子的功能性。
鑒定的特異性抗體包括HLA-DR/DP(本發(fā)明的Bl抗體)和表面IgM(本發(fā)明的Cll 抗體)，以及ICAM-I (本發(fā)明的Bll抗體)，其是以前與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)無(wú)關(guān)的粘附分子。分離的抗體在亞納摩爾(subnanomolar)到納摩爾(nanomolar)的范圍內(nèi)都具有親和性，直接使他們成為用于靶向抗體治療法的可能的選擇。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供了在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包括下列步驟
a.提供一種或多種展示細(xì)胞表面抗原ICAM-I的靶細(xì)胞；
b.提供一種或多種結(jié)合分子，其選擇性地與細(xì)胞表面ICAM-I結(jié)合，且一旦結(jié)合 ICAM-I，則誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；
c.將(a)的靶細(xì)胞暴露于(b)的結(jié)合法分子中，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
優(yōu)選，結(jié)合分子是抗體分子。
第二方面，本發(fā)明提供了在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包括下列步驟
a.提供一種或多種展示細(xì)胞表面抗原HLA-DR/DP和/或表面IgM的靶細(xì)胞；
b.提供一種或多種抗體，其選擇性地與細(xì)胞表面HLA-DR/DP和/或表面IgM結(jié)合， 且一旦結(jié)合HLA-DR/DP和/或表面IgM，則誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；
c.將(a)的靶細(xì)胞暴露于(b)的抗體分子中，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
第三方面，本發(fā)明提供了結(jié)合分子，其選擇性地與細(xì)胞表面ICAM-I結(jié)合，一旦結(jié)合ICAM-1，則誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。或結(jié)合分子是選擇性地與細(xì)胞表面HLA-DR/DP和/ 或表面Ig M結(jié)合的抗體分子。
I CAM-1也稱為⑶M，但出于本發(fā)明的目的，使用I CAM-1。
結(jié)合分子可來源于抗體并以在許多文庫(kù)中已經(jīng)廣泛使用的抗體支架(antibody scaffold)為基礎(chǔ)[Clackson T et al, Nature. 1991Aug 15 ；352 (6336) :624-8, Marks JD et al，J MoI Biol. 1991Dec 5 ；222 (3) :581-97]，但結(jié)合分子也可以來自其他的分子支架， 如纖連蛋白支架[Weng S et al. ,Proteomics. 2002Jan ；2(1) 48-57]和蛋白 A支架[Nord K,et ah,Nat Biotechnol1997Aug ； 15 (8) :772-7,Hogbom M et al,Proc Natl Acad Sci U S A. 2003Marl8 ； 100 (6) :3191-6]。這些支架中的每一個(gè)根據(jù)應(yīng)用，有其自身的優(yōu)勢(shì)，例如， 抗體支架可有利地用于產(chǎn)生難以與天然變異區(qū)分的變異。
對(duì)抗體的基本結(jié)構(gòu)，即最常用的支架，已經(jīng)了解的相當(dāng)透徹。大體上，框架區(qū)，其包括順序排列成二個(gè)折疊片的β鏈，表現(xiàn)為一組可變環(huán)，就是所謂的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其具有結(jié)合抗原分子的能力。盡管抗體在支架結(jié)構(gòu)中可以變化，但最廣泛的變異性見于CDRs 中?？贵w間良好的變異性是它們以特異性方式與大體上所有類型的分子結(jié)構(gòu)相互作用的能力的基礎(chǔ)。由于這種能力，抗體已經(jīng)廣泛用于產(chǎn)生在疾病的診斷/預(yù)后中具有適用性的特異粘合分子(specific binder)，并作為對(duì)確定的靶結(jié)構(gòu)具有特異性的治療劑[Borrebaeck CA and Carlsson R，Curr Opin Pharmacol. 200IAug ； 1(4) :404-8]。
另外，用于本發(fā)明的其他非抗體結(jié)合分子，是具有支架結(jié)構(gòu)的分子，所述支架結(jié)構(gòu)具有高度穩(wěn)定性但允許在某些位置引入變異。另一個(gè)結(jié)合分子的實(shí)例是容忍變異的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和58個(gè)氨基酸的大蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域。也有其他的允許某種程度變異的分子折疊。 此類實(shí)例包括I型和II型主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)分子，以及最近鑒定的一類新穎的分子，即所謂的防衛(wèi)素，其在基本結(jié)構(gòu)上相似，而仍然在基因家族成員之間具有廣泛的序列變異性，這表明它們適宜作為具有分子多樣性的支架。另外，在ICAM-I作為靶分子的情況下，天然配體如LFA-I或其重組變體組成能在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性結(jié)合分子。
而且，結(jié)合分子可以是選擇性結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面ICAM-I的任何分子，并且一旦結(jié)合，則誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
結(jié)合分子優(yōu)選是抗體分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表面抗原是ICAM-I。
本發(fā)明的篩選重新獲得對(duì)ICAM-I特異的抗體(B11)，其是一個(gè)以前認(rèn)為與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)且認(rèn)為在細(xì)胞中無(wú)助于固有的負(fù)信號(hào)特性(intrinsic negative signaling properties)的受體。
確定ICAM-I作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)分子是經(jīng)設(shè)計(jì)以分離針對(duì)在靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞之間差異表達(dá)的所有表面受體的特異性而篩選的直接結(jié)果，而無(wú)論并在沒有它們各自的同一性的先前了解的情況下。已證實(shí)ICAM-I誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為主動(dòng)凋亡過程，該過程與線粒體膜的去極化有關(guān)。對(duì)于依賴和不依賴半胱氨酸蛋白酶caspase的細(xì)胞凋亡兩者的線粒體膜的去極化已有記載(Nagy et al. J MoI Med 2003 ；81 :757-65)。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還表明，被Bll抗體結(jié)合的表位在不同來源的B淋巴瘤組織中表達(dá)， 并且與其他的外周血白細(xì)胞相比，其在某些B淋巴瘤細(xì)胞中被上調(diào)。重要的是，除了 B淋巴瘤細(xì)胞外，表達(dá)ICAM-I的癌細(xì)胞在體外遭受ICAM-I特異性Bll抗體時(shí)也經(jīng)歷了細(xì)胞凋亡 (參閱實(shí)施例6)。
以前的研究已經(jīng)證明ICAM-I在正常人組織中的限制表達(dá)(Smith et al. J Clin Pathol 1990 ；43 :893-900)。ICAM-I與細(xì)胞和細(xì)胞的粘附有關(guān)，并通過與其受體LFA-I結(jié)合在免疫應(yīng)答和炎癥中起重要作用。針對(duì)ICAM-I的抗體已用于干擾病理免疫應(yīng)答和炎癥。 已經(jīng)表明小鼠抗ICAM-ImAb在獼猴(cyhomolgus monkey)的體內(nèi)施用(Cosimi et al J Immunol 1990 ； 144 :4604-12)，或在患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者或者接受了腎移植患者的臨床試驗(yàn)中的使用，沒有明顯的毒性(Kavanaugh et al. Arthritis Rheuml994 ；37 :992-9 ；Haug et al.Transplantation 1993 ；55 :766-72)。
ICAM-I靶向可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡這一新的發(fā)現(xiàn)表明，只要不同來源的癌癥表達(dá)抗原， 利用ICAM-I的特異性結(jié)合分子如抗體來治療所述癌癥是可能的。
基于ICAM-I的表達(dá)，可潛在地用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抗ICAM-I抗體如Bll治療的癌癥類型包括B 淋巴瘤、骨髓瘤(Huang et al. (1993)Hybridoma 12p661-75 ；Huang et al.， (1995)Cancer Res 55p610-6 ；Smallshaw et al, (2004)J Immunother 27p419_24)、胃癌(Maruo et al, (2002) Int J Cancer 100p486_90)、乳腺癌(Rosette et al, (2005) Carcinogenesis 26p943_50)、月干癌(Sun et al, (1999) J Cancer Res Clin Oncol 125p28-34)、肺癌(Grothey et al, (1998)Br J Cancer 77p801_7)、黑色素瘤(Wang et al, (2005) Int J Cancer 27p419_24)、膀胱癌(Roche et al, (2003)Thromb Haemost 891089-97)以及前列腺癌(Aalinkeel et al, (2004)Cancer Res 64p5311_21)。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，已確定了 ICAM-I 的表達(dá)，如同 Maruo 等(Maruo et al，2002)、Rosette 等(Rosette et al，2005)、Sun 等(Sun et al，1999)、Grothey 等(Grothey et al，1998)、Aalinkeel 等 (Aalinkeel et al,2004)所證明的，指出利用ICAM-I特異性抗體干擾轉(zhuǎn)移過程是可能的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表面抗體是HLA-DR/DP。
HLA-DR/DP通常存在于例如B細(xì)胞上，并發(fā)現(xiàn)在B淋巴瘤細(xì)胞中被上調(diào)。
到目前為止，三種不同的HLA-DR特異性單克隆抗體已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。其中最近增加的是完整的人IgG4 1D09C3，其分離自與n_CoDeR 相比大小相似的天然噬菌體文庫(kù)，但對(duì)純化的抗原使用固相淘洗(solid phase panning) (Nagy et at. Nat Med 2002 ； 8 :801-7)。
在本發(fā)明中，已經(jīng)確定了針對(duì)HLA-DR/DP的新的人抗體(Bi)，其快速和高效地在血多B淋巴瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，據(jù)此，證明HLA-DR/DP與靶細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)。
Bl抗體結(jié)合許多不同來源的B淋巴瘤細(xì)胞系(參閱實(shí)施例1和表1)，并且表示其在表達(dá)HLA-DR/DP抗原的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且，當(dāng)在Raji B淋巴瘤細(xì)胞系中試驗(yàn)時(shí)， 所述Bl抗體比利妥昔單抗更高效。當(dāng)使用Bl抗體的IgQB式時(shí)，這點(diǎn)特別明顯(圖8)。
根據(jù)已經(jīng)獲得的數(shù)據(jù)，這種抗體具有治療表達(dá)HLA-DR/DP的B淋巴瘤細(xì)胞系的適宜特征。另外，與利妥昔單抗靶向風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE相似，Bl抗體可有效消除處于障礙中的激活的B細(xì)胞，其中，表達(dá)HLA-DR/DP的B細(xì)胞是有害的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表面抗原是表面IgM。
游離形式的IgM以大的四聚體結(jié)構(gòu)存在，其較高的分子量?jī)A向于將其限制于血管內(nèi)。
單聚體IgM可發(fā)現(xiàn)于B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞壁上，并且作為抗原識(shí)別的抗體受體起作用。
本發(fā)明的Cll抗體，一旦和表達(dá)在B淋巴細(xì)胞上的表面IgM結(jié)合，則快速并高效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(參閱實(shí)施例1和表1)。與以前在治療B淋巴瘤的臨床中使用的獨(dú)特型特異性抗IgM抗體相反，Cll抗體與表達(dá)在來自不同供體的B細(xì)胞上的非多態(tài)性表位結(jié)合，因此適宜用于治療患有B淋巴瘤的患者，而不管B淋巴瘤的獨(dú)特型。
特別地，效應(yīng)物分子例如抗IgM抗體也可能是任何類型的特異結(jié)合分子，其在不同獨(dú)特型的表達(dá)IgM的細(xì)胞中引起細(xì)胞凋亡。
Bi、Bll和Cll IgG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的動(dòng)力學(xué)非常快速，已觀察到在一些細(xì)胞系中3小時(shí)后具有最大功效?？焖俚男?yīng)物功能對(duì)治療功效非常重要，因?yàn)槠溆衫缛狈δ[瘤抗原表達(dá)(Uyttenhove et al. J. Exp. Med. 1983 ； 157 :1040-52 ；Kennedy et al. Br J Haematol 2002 ； 119 :412-6)或表位突變(Weiner et al. J Immunol 1989 ； 142 :343-51 ； Bai et al. J. Clin. Invest. 2003 ；111 :1487-96)而導(dǎo)致的腫瘤侵入的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，并且潛在地限制治療持續(xù)時(shí)期和副作用(Robert et al Lancet Oncol 2005 ；6 :491-500)。
優(yōu)選地，靶細(xì)胞是免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞，并且有利地該免疫細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞。
方便地，該靶細(xì)胞與疾病有關(guān)。優(yōu)選地，所述疾病選自下組癌癥、自身免疫病(包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE)、急性和慢性炎癥性疾病、敗血癥以及包括但不限于HIV 的傳染性疾病。
有利地，所述疾病是選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脈絡(luò)叢癌(chorioid cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、結(jié)腸癌和前列腺癌中的癌癥。
如在本發(fā)明的定義部分所限定的，出于方便而使用術(shù)語(yǔ)抗體分子，除了其他的以外，還包括抗體、抗體片段和抗體衍生物。
方便地，抗體分子是IgG。IgG可以是任何的IgG^ IgG2, IgG3或IgG4,但優(yōu)選是任何的IgG1和Ig(i4?？贵w分子優(yōu)選是人源化的或人的。
方便地，本發(fā)明的結(jié)合分子或抗體分子具有圖9-11的可變區(qū)序列，或具有其功能上等同的同源物中任一個(gè)的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合分子或抗體分子具有圖9的可變區(qū)序列，或具有其功能上等同的同源物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合分子或抗體分子具有

圖10的可變區(qū)序列，或具有其功能上等同的同源物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合分子或抗體分子具有圖11的可變區(qū)序列，或具有其功能上等同的同源物。
第四方面，本發(fā)明提供了核酸，所述核酸具有編碼任何以上的權(quán)利要求所要求保護(hù)的結(jié)合分子或抗體分子的核苷酸序列。
通常，該核酸分子具有圖9-11中任一個(gè)的核苷酸序列。
第五方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明的第一或第二方面所限定的結(jié)合分子或抗體分子在診斷和/或治療和/或預(yù)防需要破壞靶細(xì)胞的疾病中的用途。也提供了如本發(fā)明的第一或第二方面所限定的結(jié)合分子或抗體分子在制備用于治療和/或預(yù)防需要破壞靶細(xì)胞的疾病的藥物中的用途。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合分子是抗體分子。
方便地，待治療的疾病選自下組癌癥、自身免疫疾病(包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE)、急性和慢性炎癥性疾病、敗血癥和包括但不限于HIV的傳染性疾病。
方便地，待治療的疾病選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、 黑色素瘤、膀胱瘤、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌中的癌癥。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子或抗體分子特異性地與ICAM-I結(jié)合和/或具有圖10的序列并且用于上文所述的疾病。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體分子特異性地與HLA-DR/DP結(jié)合，和/或具有圖9的序列，并且用于淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱瘤、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌疾病中。
第六方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明的結(jié)合分子或抗體分子和藥學(xué)可接受載體、賦形劑或稀釋劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合分子是抗體分子。
第七方面，本發(fā)明提供了體外誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡的方法，其包括下列步驟
(i)提供一種或多種靶細(xì)胞；
(ii)提供一種或多種如本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案所限定的結(jié)合分子或抗體分子；
(iii)將(i)的靶細(xì)胞暴露于(ii)的結(jié)合分子或抗體分子中，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合分子是抗體分子。
優(yōu)選地，(i)中提供的靶細(xì)胞是面向細(xì)胞或上皮細(xì)胞。有力地，所述免疫細(xì)胞是B 淋巴細(xì)胞。
方便地，靶細(xì)胞與疾病有關(guān)，并且其中所述疾病選自下組癌癥、自身免疫疾病 (包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE)、急性和慢性炎癥性疾病、敗血癥和包括但不限于HIV 的傳染性疾病。
通常，所述疾病選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱瘤、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌中的癌癥。
所用術(shù)語(yǔ)的涵義
術(shù)語(yǔ)“抗體分子”用于指抗體、抗體片段或抗體衍生物中的任何一種。其意在包括野生型抗體、合成抗體、重組抗體或雜交抗體(antibody hybrids)，例如，但不限于，由免疫球蛋白輕和/或重鏈可變和/或恒定區(qū)的噬菌體展示(phage-display)所產(chǎn)生的單鏈修飾抗體分子，或其它的能在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的免疫測(cè)定模式中與抗原結(jié)合的免疫相互作用分子。
術(shù)語(yǔ)“抗體片段”用于指抗體、抗體片段或抗體衍生物中的任何一種。其意在包括野生型抗體(即包含4條多肽鏈的分子)、合成抗體、重組抗體或雜交抗體，例如，但不限于， 由免疫球蛋白輕和/或重鏈可變和/或恒定區(qū)的噬菌體展示所產(chǎn)生的單鏈修飾抗體分子， 或其它的能在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的免疫測(cè)定模式中與抗原結(jié)合的免疫相互作用分子。
術(shù)語(yǔ)“抗體衍生物”指任何修飾的抗體分子，其能在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的免疫測(cè)定模式中與抗原結(jié)合，如抗體片段(如Fab或Fv片段)，或通過加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而修飾的修飾抗體分子，或促進(jìn)抗體與另一個(gè)肽或多肽、與大的載體蛋白或與固體支持體(如氨基酸酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和其衍生物，除其它以外還包括 NH2-乙?；駽OOH-末端氨基)偶聯(lián)的其他分子。
術(shù)語(yǔ)“kFv分子”指任何分子，其中Vh和\伴侶結(jié)構(gòu)域經(jīng)通過彈性寡肽而連接。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互換使用，指核苷酸或這些核苷酸的序列的雜聚物。這些術(shù)語(yǔ)也指基因組來源或合成來源的DNA或RNA，其可以是單鏈的或雙鏈的，并且代表肽核酸或任何DNA樣或RNA樣材料的有義鏈或反義鏈。在本發(fā)明的序列中，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鳥嘌呤，N是A、C、G或T(U)。 可預(yù)期到是，當(dāng)多核苷酸是RNA時(shí)，在本發(fā)明提供的序列中的T(胸腺嘧啶)用U(尿嘧啶) 取代。通常，由本發(fā)明提供的核酸片段可由基因組的片段或短的寡核苷酸連接體、或由一系列寡核苷酸、或由單獨(dú)的核苷酸組裝，來提供能在重組的轉(zhuǎn)錄單元中表達(dá)的合成的核酸，所述重組的轉(zhuǎn)錄單元包括來源于微生物或病毒操縱子或真核基因的調(diào)控元件。
術(shù)語(yǔ)“多肽”或“肽”或“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白序列或其片段，并且指天然存在的或合成的分子。多肽“片段”、“部分”或“片段”是至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約7個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少約9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至少約17個(gè)或更多個(gè)氨基酸的氨基酸殘基的一段。為了具有活性，任何多肽必須具有足夠的長(zhǎng)度來展示生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性。
如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“純化的”或“基本上純化的”表示指定的核酸或多肽基本上不含有其他的生物大分子，如多核苷酸、蛋白質(zhì)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，純化該多核苷酸或多肽，使其組成指定的生物大分子重量的至少95%，更優(yōu)選重量的至少99% (但水、緩沖液和其他的小分子，特別是具有小于1000道爾頓分子量的分子可以存在)。
如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”指分離于至少一種其他組分(例如核酸或多肽的核酸或多肽，該組分與其天然來源中的核酸或多肽一起存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅存在(如果有什么區(qū)別的話)溶劑、緩沖液、離子或正常存在于其溶液中的其他組分時(shí)，通?？稍谠撊芤褐邪l(fā)現(xiàn)核酸或多肽。術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”不包括存在于其天然來源中的核酸或多肽。
術(shù)語(yǔ)“重組體”，當(dāng)在本發(fā)明中用于指多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，其意指來自重組(如微生物的、昆蟲的或哺乳動(dòng)物的)表達(dá)體系的多肽或蛋白質(zhì)。“微生物的”指在細(xì)菌或真菌(如酵母)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組多肽或蛋白質(zhì)。作為產(chǎn)物，“重組微生物的”指基本上不含天然內(nèi)源性物質(zhì)的多肽或蛋白質(zhì)，并且不伴隨相關(guān)的天然糖基化。在大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)物(如 E. coli)中表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)沒有糖基化修飾；酵母中表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)具有通常不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的那些多肽或蛋白的糖基化模式。
術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”和“結(jié)合選擇性”表示，本發(fā)明的抗體的可變區(qū)專有地識(shí)別和結(jié)合本發(fā)明的多肽(即，不管在多肽家族中發(fā)現(xiàn)的序列的同一性、同源性或相似性如何， 能從其他相似的多肽中區(qū)分本發(fā)明的多肽)，但通過與抗體可變區(qū)外的序列(特別是該分子的恒定區(qū)中的序列)相互作用，其也可與其他的蛋白質(zhì)相互作用(如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A或ELISA技術(shù)中的其他抗體)。測(cè)定本發(fā)明抗體的結(jié)合選擇性的篩選分析在本領(lǐng)域中是熟知的并且是按常規(guī)實(shí)施的。對(duì)于此類分析的廣泛討論，參閱 Harlow 等編輯的，Antibodies A Laboratory Manual ； Co Id Spring Harbor Laboratory ； Co Id Spring Harbor, N. Y. (1988)，第6章。也思考了識(shí)別和結(jié)合本發(fā)明多肽片段的抗體，只要所述抗體對(duì)上述本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽是首先選擇的。因?yàn)榭贵w對(duì)本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽是選擇性的，因此，能識(shí)別片段的本發(fā)明的抗體是不管于蛋白家族中發(fā)現(xiàn)的固有的序列同一性、同源性或相似性如何，而能從多肽的同一個(gè)多肽家族中區(qū)分多肽的抗體。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合親和性”包括抗體分子和抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度的涵義。
通過術(shù)語(yǔ)“免疫細(xì)胞”，我們意指與宿主免疫應(yīng)答或炎癥應(yīng)答有關(guān)的任何細(xì)胞，包括但不限于B細(xì)胞和T細(xì)胞。
通過術(shù)語(yǔ)“上皮細(xì)胞”，我們意指上皮的細(xì)胞。上皮是由一層細(xì)胞組成的組織。上皮可發(fā)現(xiàn)附在身體的內(nèi)自由表面(如內(nèi)皮，其附在血管內(nèi)側(cè)直線排列)或外自由表面(如皮膚)上。
我們皮膚的最外層是由鱗狀上皮細(xì)胞組成的，如同襯在口和體腔(body cavities)內(nèi)側(cè)的粘膜一樣。其他的上皮細(xì)胞襯在肺、胃腸道、生殖道和尿道的內(nèi)側(cè)，并且構(gòu)成外分泌腺和內(nèi)分泌腺。上皮細(xì)胞的功能包括分泌、吸收和保護(hù)。上皮細(xì)胞位于基膜(basal lamina)上。
優(yōu)選的實(shí)施方式
體現(xiàn)本發(fā)明某些優(yōu)選方面的實(shí)施例將參考附圖進(jìn)描述，其中
圖1 通過差異的全細(xì)胞/細(xì)胞膜囊生物淘洗分離的scFv表現(xiàn)出了高度的靶細(xì)胞特異性
通過差異生物淘洗而分離的scFv克隆在大腸桿菌T0P10細(xì)胞中表達(dá)并與Ramos 細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞和(A)為進(jìn)行初級(jí)篩選而表達(dá)的scFv克隆或(B) 72個(gè)隨機(jī)選擇并再表達(dá)的scFv克隆一起溫育。用抗His MAb和Cy5-抗小鼠多克隆Ab檢測(cè)結(jié)合的scFv。用 FMAT Macroconfocal Hight Throughput Screening儀檢測(cè)細(xì)胞的結(jié)合。細(xì)胞結(jié)合圖示為靶Ramos細(xì)胞(Y軸)對(duì)非靶Jurkat細(xì)胞(X軸)的平均熒光強(qiáng)度。(C) 7種獨(dú)特的scFv克隆與Ramos細(xì)胞(實(shí)心柱)和Jurkat細(xì)胞(空心柱)的結(jié)合。對(duì)照ScFV(ctrl)未與任何細(xì)胞結(jié)合。
圖2 抗Ramos scFv的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)
將Ramos淋巴細(xì)胞與抗Ramos scFv、抗His mAb和抗小鼠多克隆Ab在冰上順序溫育(并不間斷洗滌以除去過量的未結(jié)合抗體)，并在5% C02、37°C的濕潤(rùn)空氣中溫育M小時(shí)。隨后收獲細(xì)胞，并用膜聯(lián)蛋白V-AF488(AV) (Armexin V-AF488 (AV))和碘化丙啶(PI) 進(jìn)行組合染色。根據(jù)不同的AV和PI染色陽(yáng)性(如圖2B中正方形通道(square gates)所定義)，將細(xì)胞評(píng)價(jià)為存活(AV-PI-實(shí)心圓，圖2C)、早期細(xì)胞凋亡(AV+PI-，空心三角形，圖 2C)或晚期細(xì)胞凋亡/壞死(AV+PI+，空心菱形圖2C)。通過圖示(A)針對(duì)Side Scatter的 Forward Scatter (FSC-Height)以及(B)針對(duì) PI (FL-3)的 AV(FL-I)來表示結(jié)果。也表示了 scFv Bl和Fl的滴定效果(C)。將7種獨(dú)特的scFv與各種濃度的(D)Ramos或(E)Raji B淋巴細(xì)胞在37°C —起溫育M小時(shí)，并研究對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用。三種scFv，Bl、Bll和 Cll表現(xiàn)出了對(duì)兩種細(xì)胞系的滴定活性，而scFv BlOXlO和G12的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力局限于Ramos B淋巴瘤細(xì)胞。
圖3 分離的抗體的特異性包括HLA-DR/DP、IgM和ICAM-I
A)用 0. 5% ν/ν 的非離子去污劑 Triton X-1000 裂解 50-600 X IO6 個(gè) Raji B 淋巴瘤細(xì)胞，并用100 Ug Bl(泳道1)和Bll (泳道11)的完整人IgGl形式免疫沉淀，隨后用蛋白A瓊脂糖(Protein A Sepharose)進(jìn)行交聯(lián)。來自50X IO6個(gè)細(xì)胞的Ramos B淋巴瘤細(xì)胞裂解物用于沉淀20 μ g Cll (泳道3)。切除抗體特異性條帶并進(jìn)行胰蛋白酶消化并通過MALDI-T0F進(jìn)行分析。
B)分別通過與抗HLA-DR/DP、抗ICAM-I或抗IgM抗體一起預(yù)溫育封閉與B淋巴瘤細(xì)胞結(jié)合的 Bl IgG、Bll IgG 和 Cll IgG0
為了證實(shí)抗體克隆B1、B11和Cll的重新得到的MALDI-T0F抗原的同一性，進(jìn)行用購(gòu)買的抗體進(jìn)行的封閉研究，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。與多于10倍摩爾(與人抗體相比) 的物種匹配的封閉抗體(species-matched blocking antibodies) 一起預(yù)溫育1小時(shí)，隨后加入任何分離的人抗體克隆。30分鐘后，洗滌細(xì)胞，并通過PE-共軛的羊抗人IgG(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)，檢測(cè)人抗體與細(xì)胞的結(jié)合。在該研究中，對(duì)于Bi，所用的封閉抗體是小鼠單克隆抗HLA DR (Sigma, clone HK14)或抗CD40 (Beckton Dickinson, clone 5C3)；對(duì)于B11，所用封閉抗體是兔多克隆抗ICAM-I (Abeam，ab7815_250)或抗 CD22 (Abeam，ab25135-100)；對(duì)于 C11，所用的封閉抗體是羊多克隆抗 IgM (Zymed，South San Francisco, CA, USA, 62-7500)或抗 IgG(Zymed, 62-8400)。
圖4 =ICAM-I是能介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的B淋巴瘤相關(guān)的細(xì)胞表面受體
A.將2yg/ml Bll或抗FITC-8 (對(duì)照)IgG1加入至4X IO5個(gè)CL-01B淋巴瘤細(xì)胞， 在冰上溫育2小時(shí)，隨后加入10 μ g/ml交聯(lián)的第二 Fab' 2羊抗人Fc抗體。細(xì)胞在37°C 下溫育6小時(shí)，通過兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞凋亡分析，測(cè)定抗體溫育的效果。通過與上文所述相似的AV/PI (上組)或通過與5 μ g/ml線粒體膜區(qū)極化試劑JC-I在RT下一起溫育30分(下組)，來染色細(xì)胞。通過紅(y軸)/綠(χ軸)熒光強(qiáng)度比的降低，可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。 (B)顯示了 Bll抗體與B淋巴瘤組織代表性結(jié)合的組織切片。將從患有間變性大細(xì)胞淋巴瘤(Anaplastic Large Cell B Lymphoma)獲得的冰凍保存的組織用Bll或FITC-8 (對(duì)照)12scFv抗體染色。用DAB(褐色)檢測(cè)抗體的結(jié)合。插入的圖片顯示用對(duì)照scFv進(jìn)行的染色。(C)將CD45-PerCp-Cy5. 5mAb預(yù)標(biāo)記的Ramos細(xì)胞與供給來源的PBMCs混合，并用熒光燃料共軛的CD特異抗體和Alexa Flour 647Zenon預(yù)標(biāo)記的Bll IgGl或?qū)φ誇ITC_8IgGl 對(duì)不同的細(xì)胞群進(jìn)行染色。在FL-4通道中記錄與不同細(xì)胞群結(jié)合的IgG Bll0
圖5 :IgG Bl和IgG Bll對(duì)B淋巴瘤細(xì)胞的親和性
在存在或不存在0. 2mg/ml對(duì)應(yīng)的未標(biāo)記IgG蛋白的情況下，將Raji (左組，IgG Bi)或Ramos細(xì)胞(右組，IgG Bll)與漸增量的放射性碘標(biāo)記IgG Bl或放射性碘標(biāo)記的 IgG Bll蛋白一起溫育。通過從總的結(jié)合中減去在存在未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性蛋白情況下的結(jié)合， 測(cè)定特異性結(jié)合。結(jié)合的IgG Bl或IgG Bll蛋白的量隨著游離IgG蛋白量的增加而增加， 分別在 30nM IgG Bl和 InMIgG Bll時(shí)(上組)，達(dá)到飽和結(jié)合。Rosenthal-Scatchard 圖分析(較下的組)證明了對(duì)于IgG Bi， 30nM的解離常數(shù)和每一個(gè)Raji細(xì)胞400，000 個(gè)功能結(jié)合位點(diǎn)，以及對(duì)于IgG BlKRaji細(xì)胞)， 0. 3nM的解離常數(shù)和每一個(gè)Raji細(xì)胞 47，400個(gè)功能結(jié)合位點(diǎn)，
圖6 =BuBiucilIgG1與不同來源的腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合
通過流式細(xì)胞術(shù)，研究了 Bi、BlU Cll抗體靶向的抗原在不同癌細(xì)胞系中的抗原分布。柱狀圖顯示了利妥昔單抗抗⑶20Mab (第一行前面的大部分峰)、B1 IgG1 (第二行的峰)、B11 IgG1 (第三行的峰)或Cll IgG1 (第四行后面大部分的峰)與MCF-7乳腺癌細(xì)胞、 HPAC胰腺癌、PC-3前列腺癌細(xì)胞、LS174T結(jié)腸直腸癌細(xì)胞以及THP-I單細(xì)胞白血病細(xì)胞的結(jié)合，如所示的。
圖7 :B11 IgG1在癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)
在6 孔板中，在完全培養(yǎng)基(Complete Growth Medium, RPMI 1640，補(bǔ)充了 10% FCSUOmM HEPES以及2mM L-谷氨酸)內(nèi)將前列腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)至80 %的融合 (confluency)。將前列腺癌細(xì)胞系DU145培養(yǎng)于具有Earl，s鹽的MEM中，其補(bǔ)充了 10% FCS、lmM丙酮酸鈉以及ImM非必須氨基酸，并且將癌細(xì)胞系MDA MB 435的衍生物培養(yǎng)于補(bǔ)充了 10% FCS 的 DMEM 中。
對(duì)于細(xì)胞凋亡分析，在PBS中洗滌細(xì)胞，并將連續(xù)稀釋的Bll IgGJ或Bl 18&、妥珠單抗或用于對(duì)照的陰性對(duì)照抗體)加入到每個(gè)孔中，并且使結(jié)合在4°C下1-2個(gè)小時(shí)的溫育。洗滌細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10yg/ml的交聯(lián)抗體、Fab’2羊抗人Fab’2。 將細(xì)胞在37°C、具有5%的(X)2的空氣中溫育16- 小時(shí)。通過胰蛋白酶化作用，收集細(xì)胞， 并用Alexa FlUor488-膜聯(lián)蛋白V(AF488_AV)和碘化丙啶(PI)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行染色。以下列公式，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比％凋亡細(xì)胞=100-% AF488-AV/PV-/-。
A)等高圖(contour plots)顯示用2 μ g/ml IgG Bll或IgG Bl如上述溫育后，作為膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶陽(yáng)性的函數(shù)的PC-3細(xì)胞的相對(duì)分布。
B)柱狀圖顯示，與連續(xù)稀釋的Bll 1861或2(^8/1111 Bl IgG1—起溫育后，凋亡的 PC-3細(xì)胞的平均百分比。
C)柱狀圖顯示，與無(wú)抗體的對(duì)照、10 μ g/ml陰性對(duì)照抗體、連續(xù)稀釋的Bll IgG1或 10 μ g/ml妥珠單抗IgG1 —起溫育后，凋亡的MDA MB435細(xì)胞的平均百分比。
D)柱狀圖顯示，與無(wú)抗體的對(duì)照、10 μ g/ml陰性對(duì)照抗體、連續(xù)稀釋的Bll IgG1或 10 μ g/ml妥珠單抗IgG1 —起溫育后，凋亡的DU145細(xì)胞的平均百分比。
圖8 在缺少交聯(lián)劑的情況下，Bl IgG1和Bl IgG4誘導(dǎo)對(duì)Raji B淋巴瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性
將Raji細(xì)胞與20,6. 7或2. 2 μ g/ml的Bl IgG、Bl IgG4、利妥昔單抗IgG1或?qū)φ?CT-HIgG1 —起溫育M小時(shí)。收獲細(xì)胞，并將存活力測(cè)定為膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶的雙重陰性細(xì)胞(double negative cells)。
圖9 =Bl抗體的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)
圖10 =Bll抗體的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)
圖11 =Cll抗體的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)
實(shí)施例1 具有對(duì)與細(xì)胞表面受體有關(guān)的B淋巴瘤特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抗體的切片和篩選(生物淘洗)
細(xì)胞培養(yǎng)
除非另有說明，在本研究中所用的細(xì)胞系是從ATCC(Manassas, VA, USA)或 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) GmbH(Braunschweig, Germany)獲得的，并培養(yǎng)于補(bǔ)充了 10% FCS、2mM L-谷氨酸、IOmM HEPES和ImM丙酮酸鈉 (均來自 hvitrogen，Carlsbad，CA，USA)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中。Jurkat T 白血病細(xì)胞系 (clone E6-1、TIB-152、ATCC)、B 淋巴瘤細(xì)胞系 D0HH-2 (ACC47，DSMZ)、SC-I (ACC558, DSMZ)、 WSU-NHL (ACC58, DSMZ)、JVM-2 (ACC12, DSMZ)、Jeko-I (ACC553, DSMZ,培養(yǎng)于 20% FCS 中)、 Rec-I(ACC 584，DSMZ)、SP-53 (Daibata et al Cancer 1989 ;64 :1248-53)、RL(CRL_2261， ATCC)、Granta 519 (DSMZ)、NCEB-I (Saltman et al. Blood 1988 ；72 :2026-30)、BJAB (Menezes et al. Biomedicine 1975 ；22 :276-84)、Ramos (CRL-1596，ATCC)、Raji (CCL-86， ATCC)、Daudi (CCL-213，ATCC)、CL-Ol (Cerutti et al. J Immunol 1998 ；160 :2145-57)、前 B細(xì)胞淋巴瘤KM-3/Reh(CRL-^86，ATCC)以及多發(fā)性骨髓瘤UCICAK (CRL-8083，ATCC，培養(yǎng)于補(bǔ)充了 20% FCS的IMDM(Invitrogen)中)均不含支原體，將其培養(yǎng)于37°C、5% CO2的濕潤(rùn)空氣中。將細(xì)胞維持在2X IO5-IX IO6個(gè)細(xì)胞/ml之間。
Juarkat細(xì)胞膜囊的制備
通過在500ml 桶(bucket) (Corning Inc. Life Sciences, New York, USA)中，以 300Xg離心15分鐘，收獲細(xì)胞，在Dulbecco，s PBS(Invitrogen)中洗滌，并重懸浮于緩沖液A(lmM NaHCO3,1. 5mM MgAc, pH 7.4)中。細(xì)胞的濃度大約是5X IO7個(gè)Jurkat細(xì)胞/ ml (在IOOml緩沖液A中，是5 X IO9個(gè)細(xì)胞)。
通過在冰上10-30分鐘的高滲透性休克處理(緩沖液A)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎，隨后用氮空化彈(Nitrogen cavilation bomb, (Parr Instrument Company, Moline, IL, USA)對(duì)其進(jìn)行氮空化。將細(xì)胞置于0°C、40baH4，000kPa)的恒壓下15分鐘。
將破碎的細(xì)胞收集于含有500 μ 1的0. 5Μ EDTA的50ml Sarstedt管(SarstedtAG & Co，Niimbrecht, Germany)中，來產(chǎn)生終濃度為2. 5nM的EDTA。加入EDTA預(yù)防膜囊的聚集。將均菜(100ml)分配于4X25ml的Beckman厚壁離心管(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton，CA，USA)中，將其在 4°C 以 1900 X g (在 Sorvall SS!34 離心機(jī)中 4，OOOrpm)離心 10分鐘，以除去未破碎的細(xì)胞、細(xì)胞核以及重線粒體。
收集上清液，并將顆粒狀物重懸浮于含有ImM EDTA的25ml NaHCO3緩沖液中，并再次離心(進(jìn)一步回收顆粒狀的粗Jurkat膜)。將Jurkat膜與來自第一次離心的膜合并。用Beckman 45Τ 型離心機(jī)40，OOOrpm(約200，OOOXg)在4°C，將含有粗Jurkat膜囊的上清液超離心2.5小時(shí)。倒出上清液，通過依靠著棉紙(例如Kleenex )傾斜試管的邊緣，除去剩余的緩沖液。
在金屬棒的輔助下，將粗膜顆粒物轉(zhuǎn)移至Doimce勻漿機(jī)中，并通過在勻漿機(jī)中幾次小心的敲打，將其重懸浮于2. 5mlHES緩沖液(IOmM Hepes, ImM EDTA，0. 25M蔗糖，pH 7.4)中。從而獲得含有SO-IOOmg蛋白質(zhì)的、濃度相當(dāng)于2X109cellS/ml的膜懸浮物。
通過全細(xì)胞/細(xì)胞膜囊競(jìng)爭(zhēng)生物淘洗選擇噬菌體Abs
將約2 X IO13個(gè)噬菌體顆粒在37°C預(yù)熱15分鐘，并間斷地混合，14，000 X g離心15 分鐘以除去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至新鮮的Eppendorf管中。加入脫脂奶，至2%的終濃度(w/ ν)。將來源于2 X IO9個(gè)細(xì)胞(第一輪選擇；第二輪和第三輪選擇，2 X IO8個(gè)細(xì)胞)的Jurkat 膜囊制備物在冰上解凍，并與封閉的噬菌體顆?；旌稀⒃摶旌衔镌诒蠝赜?5分鐘。
通過4°C、1，200rpm離心6分鐘，收獲5 X IO7 (5 X IO6第二輪和第三輪)個(gè)Ramos 細(xì)胞。丟棄上清液并將Ramos細(xì)胞重懸浮于奶-噬菌體-Jurkat膜囊混合物中。將懸浮液在10°C、緩慢完全旋轉(zhuǎn)的條件下溫育4小時(shí)。
將細(xì)胞/細(xì)胞膜囊/噬菌體混合物轉(zhuǎn)移至15ml的!^alcon管(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)中，該Falcon管含有在底部的0. 5ml 100 % (臺(tái)盼藍(lán)染色的) Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)以及 2 % (w/ν)BSA/ PBS(Ficoll-柱)中覆蓋的 40% (ν/ν)的 Ficoll 9.5ml。于 4°C、1，500rmp，將試管離心 10 分鐘。將試管從離心機(jī)中拿走并旋上試管的蓋子并進(jìn)行不透氣密封。
使用雪茄切碎機(jī)(cigar-chopper)切掉含有100% Ficoll的i^ilcon管的底部尖端。從而，從試管中除去了包括膜囊片和細(xì)胞核的密度非常高的物質(zhì)。隨后，小心地打開試管的蓋子，從而破壞試管內(nèi)的真空并打開(切割)使得液體通過在試管底部開孔逐滴排出。
將收獲的細(xì)胞懸浮液在PBS中洗滌一次，以除去多余的Ficoll。將顆粒物重懸浮于Iml的PBS中(不要在最終的洗滌后進(jìn)行)，并將懸浮液重新裝載于新鮮Ficoll柱的上部，重復(fù)洗滌方法(在第二輪和第三輪中2次)。
通過在PBS中加入150 μ 1 76mM的檸檬酸(pH 2. 5)，從細(xì)胞中洗提噬菌體，隨后在室溫下溫育5分鐘。通過加入200 μ 1的IM Tris-HCl, Ph 7. 4，中和該混合物。在將細(xì)胞200Xg沉淀5分鐘后，保存洗提的噬菌體的上清液。通過在Iml胰蛋白酶中，在室溫下將細(xì)胞顆粒物重懸浮并溫育10分鐘進(jìn)一步洗提噬菌體。
在用40μ llmg/ml抑酶肽滅活后，離心細(xì)胞，保存含有洗提的噬菌體的上清液。洗提的噬菌體用于感染大腸桿菌HB101F’，并將該細(xì)菌涂布于含有適當(dāng)抗生素和葡萄糖的TB 培養(yǎng)基上。計(jì)數(shù)細(xì)菌的菌落，從平板中刮下，并用作下一輪淘洗的接種體。
向scFv模式的轉(zhuǎn)化、scFv的表達(dá)、純化以及細(xì)胞結(jié)合的分析
將三輪選擇后獲得的噬菌粒庫(kù)用fegl消化，以除去基因III。將所得的載體再連接。通過用EcoRI酶消化，將含有再連接的、未切割的基因III的片段線性化。用由此而產(chǎn)生的scFv載體庫(kù)基本上按更早時(shí)的描述(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000 ； 18 852-6)轉(zhuǎn)化 E. coli T0P10 細(xì)胞。
將細(xì)菌涂布于大的500cm2瓊脂平板上，挑選單個(gè)克隆，轉(zhuǎn)移至96孔板中，并使用自動(dòng)化的系統(tǒng)(Hallborn Biotechniques 2002 ;Suppl :30_7)，通過 37°C、220rpm 過夜培養(yǎng)，在TB培養(yǎng)基上表達(dá)。在含有適當(dāng)抗生素的TB培養(yǎng)基中產(chǎn)生重組scFv片段。
對(duì)于與 Raomos 革巴細(xì)胞(target Raomos cells)禾口 Jurkat 非革巴細(xì)胞(Jurkat non-target cells)結(jié)合的sc Fv克隆的初級(jí)篩選，將5，000個(gè)Ramos細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞與960個(gè)scFv克隆的任一個(gè)一起溫育，所述scFv來自第三輪選擇并如上文所述而產(chǎn)生。 將細(xì)胞與 0. 5 μ g/ml 抗 6xHis mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN5 USA)和 0. 7 μ g/ml Cy5-共軛的羊抗小鼠試劑(Amersham Biosciences) 一起溫育。在8200Cellular Detection System Fluorescence Macroconfocal High Throughput Screening(FMAT)儀(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中檢測(cè)細(xì)胞的結(jié)合。
初級(jí)篩選后，隨機(jī)挑選(即，不管在初級(jí)篩選中，靶細(xì)胞對(duì)非靶細(xì)胞的反應(yīng)性)72 個(gè)細(xì)菌克隆用于如以前所述的DNA測(cè)序(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000，18 852-6.) (Soderlind et al，2000)。為了通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞表面結(jié)合，將Ramos細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞(每個(gè)試驗(yàn)，兩者都加入2X IO5個(gè)細(xì)胞)與在含有0. 5% w/v BSA(DPBS-B) 的PBS(Invitrogen)中、濃度為2-10 μ g/ml的單個(gè)scFv克隆一起溫育1小時(shí)。
通過在300 Xg離心60分鐘，洗滌細(xì)胞。隨后將細(xì)胞分別與FITC共軛的⑶19mAb 和PE共軛的CD3mAb(BD) —起溫育，從而使隨后的靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞的鑒定成為可能。在與生物素化的抗6xHis mAb—起溫育后，通過與RPE-Cy5_鏈霉抗生素(Dako Cytomation, Glostrup,Denmark) 一起溫育，實(shí)現(xiàn)scFv結(jié)合的檢測(cè)。將細(xì)胞與第二和第三試劑分別一起溫育40分鐘和15分鐘。所有的溫育在冰上使用冰冷的溶液進(jìn)行。
差異的全細(xì)胞/細(xì)胞膜囊淘洗
本研究利用了新的淘洗方案，以分離靶向在其天然細(xì)胞表面構(gòu)型中差異表達(dá)的抗原的抗體。三輪競(jìng)爭(zhēng)生物淘洗后，利用來源于Jurkat T白血病細(xì)胞的全Ramos B淋巴瘤細(xì)胞和膜囊，分離重組的噬菌體scFv。將它們轉(zhuǎn)化為可溶的scFv并在E. coli TOPlO細(xì)胞中表達(dá)。
將重組scFv與靶(Ramos)或非靶(Jurkat)全細(xì)胞一起溫育，并檢測(cè)細(xì)胞的結(jié)合。 抗體克隆對(duì)靶細(xì)胞抗原的特異性是顯著的，因?yàn)橐扬@示表達(dá)的482個(gè)scFv克隆以微弱至非常強(qiáng)烈范圍內(nèi)的強(qiáng)度選擇性地與Ramos靶細(xì)胞結(jié)合(圖1A)。僅確定了微弱地染色Jurkat 非靶細(xì)胞的兩個(gè)克隆(圖1A)。
我們接下來測(cè)定分離的噬菌體展示的scFv的基因型多樣性。隨機(jī)挑選(即，不管如初級(jí)篩選中所測(cè)定的結(jié)合取向)72個(gè)scFv克隆用于DNA測(cè)序。
通過FMAT技術(shù)，以靶細(xì)胞的特異性(Ramos對(duì)Jurkat)同時(shí)對(duì)克隆進(jìn)行再表達(dá)和再評(píng)估，如圖18所述。通過它們不同的CDRH3和CDRL3序列(數(shù)據(jù)為顯示)所測(cè)定，鑒定了 7種不同的抗體基因型。
與等量的Ramos細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞一起溫育并通過抗標(biāo)簽抗體的方式檢測(cè)scFv 的結(jié)合后，通過三色流式細(xì)胞術(shù)分析，證實(shí)了抗Ramos scFv的高度特異性(圖1C)。
使用熒光染料共軛的⑶特異性單克隆抗體，分別通過⑶19和⑶3的表達(dá)，鑒定靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞。當(dāng)與陰性對(duì)照scFv相比時(shí)，7種基因型獨(dú)特的scFv顯示了與Ramos靶細(xì)胞的高度且可變的結(jié)合強(qiáng)度，但與Jurkat非靶細(xì)胞沒有結(jié)合。
細(xì)胞凋亡分析
使用Detoxigel 柱，根據(jù)制造商的說明書(Pierce Biotechnology, Rockford, IL,USA)，降低重組產(chǎn)生的scFv片段的脂多糖水平。通過LAL阿米巴樣細(xì)胞的溶解產(chǎn)物分析 (Cambrex Bioscience, ffalkersville, MD, USA)，對(duì)剩余的內(nèi)毒素水平進(jìn)行定量。
發(fā)現(xiàn)所有的樣品含有不到0. lIU/ml的脂多糖。嵌合的抗⑶20抗體Mabthera (利妥昔單抗)購(gòu)買自隆德大學(xué)醫(yī)院(Lund University Hospital (Lund, Sweden)) 將 2X IO5個(gè)B淋巴瘤細(xì)胞(Raji或Ramos)或Jurkat T細(xì)胞與連續(xù)稀釋且消毒的scFv，s 一起在在培養(yǎng)基中，冰上溫育1小時(shí)。
將細(xì)胞順序地與第二抗6xHis mAb (5 μ g/ml)和第三羊Fab' 2抗小鼠Fab' 2抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ,West Grove, PA, USA) 一起溫育。間斷地洗滌確保除去過量的未結(jié)合的抗體試劑。在37°C、5% CO2的濕潤(rùn)空氣中溫育細(xì)胞M小時(shí)。
當(dāng)用全I(xiàn)g(iS進(jìn)行細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)時(shí)，用與非IgG抗體同種型具有最小交叉反應(yīng)性的羊Fab' 2抗人Fc γ抗體(Jackson ImmunoResearch)取代交聯(lián)劑(為了避免內(nèi)源性B淋巴瘤相關(guān)的表面免疫球蛋白的非特異性交聯(lián))，并如上文所述溫育6小時(shí)。
除非另有說明，通過用膜聯(lián)蛋白V Alexa Fluor 4S8 (AV)和碘化丙啶(PI)(兩者都來自^witrogen的分子探針)組合染色以及隨后的流式細(xì)胞術(shù)分析，來檢測(cè)凋亡的細(xì)胞。將細(xì)胞鑒定為可變的(AV-/PI-)、早期凋亡的(AV+/PI-)晚期凋亡的/壞死的(AV+/ PI+)。使用 FACSCAlibur 儀(BD Biosciences)，分別在 FLl 和 FL2 或 FL3 通道中記錄 AV 和 PI信號(hào)(如在下文中所表示的)。
為了研究分離的scFv的功能性，基于用scFv和交聯(lián)劑順序地溫育和洗滌細(xì)胞，我們建立了高通量細(xì)胞凋亡篩選分析。在圖2A-C中，證明了在細(xì)胞凋亡分析中對(duì)scFv克隆和濃度的依賴，其中，將選擇的scFv克隆Bl的凋亡作用和scFv克隆Fl的凋亡作用做了比較，該scFv克隆Fl未顯示細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。在用任何檢查的scFv處理后，缺乏靶抗原表達(dá)的Jurkat細(xì)胞未死于細(xì)胞凋亡，證明細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)依賴于與靶抗原的結(jié)合(未顯示數(shù)據(jù))。
利用已建立的scFv-細(xì)胞凋亡分析，我們對(duì)Ramos和Raji B淋巴瘤細(xì)胞以細(xì)胞調(diào)亡篩選克隆。將scFv誘導(dǎo)的凋亡作用與利妥昔單抗抗CD20mAb誘導(dǎo)的凋亡作用進(jìn)行了比較(圖2D)。鑒定三個(gè)scFv克隆-B1、B11和C11，其誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞和Raji細(xì)胞兩者的顯著細(xì)胞凋亡(圖2D和E)。通過scFv誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和與這些細(xì)胞的結(jié)合相關(guān) (圖2D)，因?yàn)椴荒芙Y(jié)合Raji細(xì)胞的scFv克隆未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
將Bi、Bll和Cll克隆轉(zhuǎn)化至完整的人IgGl抗體。重構(gòu)型后，它們的特異性和功能性保持完整，如通過它們對(duì)廣泛的B淋巴瘤細(xì)胞系的強(qiáng)烈結(jié)合和有力的細(xì)胞毒性(表1) 所證明。值得注意的是，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是快速的，幾個(gè)細(xì)胞系在3-6小時(shí)后就達(dá)到膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的最大百分?jǐn)?shù)(表1以及未顯示的數(shù)據(jù))。
IgG的產(chǎn)生和內(nèi)毒素篩選分析
通過克隆至修飾的ρ⑶NA3載體將scFv抗體片段轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)的人IgGl λ形式 (Norderhaug et al, J Immunol Methods 1997 ；204 :77-87), Lipofectamine 2000 劑根據(jù)制造商(Invitrogen)說明書轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。
在Mabklect蛋白 A 柱(Amersham Biosciences)上，從失去效能的培養(yǎng)基(spent cultivation medium)中純化人IgG。通過SDS-PAGE分析所測(cè)定的制劑的純度> 98%。篩選抗體制劑，并通過LAL阿米巴樣細(xì)胞溶解產(chǎn)物試驗(yàn)所測(cè)定的(Cambrex Bioscience)發(fā)現(xiàn)其在本發(fā)明所用的濃度中含有< 0. lIU/ml的內(nèi)毒素。
實(shí)施例2 抗體特異性分析
抗原鑒定
通過B淋巴瘤細(xì)胞裂解物的免疫沉淀鑒定靶向抗原的特性。通過離心收獲細(xì)胞 (根據(jù)抗體和細(xì)胞系50-600 X IO6個(gè)/ml溶解緩沖液)，在PBS中沖洗兩次，并溫育于含有 0. 5% ν/ν 去污劑 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis,MO, USA)的裂解緩沖液(Lysis Buffer, (25mM Tris-HCl, pH 7. 5,150mM NaCl,5mM EDTA，以及完全的 EDTA-free 蛋白酶抑 ^MWM^ (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany))巾。
將細(xì)胞碎片在常規(guī)的臺(tái)式離心機(jī)中以16，000Xg、15分鐘旋轉(zhuǎn)沉降，通過旋轉(zhuǎn)，用 Protein A Sepharose 4Fast Flow (Amersham Biosciences) (1/10 反應(yīng)體禾只)予頁(yè)先除去雜質(zhì)。對(duì)于每一個(gè)樣品，用20-100 μ g任何人抗體將Iml預(yù)先除去雜質(zhì)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物免疫沉淀2小時(shí)。再次加入ftOtein A Sepharose4Fast Flow，并溫育30分鐘，其中，在裂解緩沖液中對(duì)免疫復(fù)合物(immimo-complexes)徹底洗滌后，煮沸5分鐘，最后重懸浮于樣品緩沖液(IXNuPAGE LDS Sample Buffer, IX NuPAGE Sample Reducing Agent)中，并在NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel(均來自 hvitrogen)中進(jìn)行分離。
染色(SimplyBlue Safestain, Invitrogen)后，將目標(biāo)蛋白條帶從 SDS-PAGE 中切除并進(jìn)行胰蛋白酶消化，如Edvardsson等所述(Edvardsson et al. Electrophoresis 1999；20 :935-42)。
簡(jiǎn)單來說，對(duì)凝膠塊(gel plugs)脫色，并通過在攪拌的情況下，用200 μ 150%乙腈(ACN)洗滌 3 次來平衡。在 SpeedVac 濃縮器(Savant,Farmingdale,NY,USA)中干燥 15 分鐘后，通過加入25μ1 IOmM DTT/100mM NH4HCO3，還原樣品，并在56°C溫育1小時(shí)，并且通過加入25 μ 1 55mM乙酰胺/IOOmMNH4HCO3進(jìn)行烷基化，隨后在室溫下溫育45分鐘。
兩次在IOOmM NH4HCO3中洗滌10分鐘的額外步驟，隨后在50% v/vCAN洗滌一次后，在SpeedVac濃縮器內(nèi)干燥凝膠塊，并再膨大，并在含有15 μ 1 15ng/y 1胰蛋白酶 (Promega Corporation，Madison，WI，USA)的 25mMNH4HC03 中 37°C消化過夜。通過加入 50% v/v ACN/1% v/v TFA并在室溫下溫育10分鐘，來提取肽。將1 μ 1提取物點(diǎn)樣于MALDI樣品平板上并進(jìn)行干燥。將1 μ 1基質(zhì)溶液(5mg/ml α -氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)溶解于 75% v/v ACN/1% v/v TFA中)點(diǎn)樣于肽的上面。
用Applied Biosystems 4700Maldi Workstation 測(cè)定肽質(zhì)量。使用 Mascot 搜索工具(Matrixscience，UK)，通過肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)搜索，鑒定肽。使用相似的方法，鑒定 B10、C10和G12克隆的抗原特異性，除了 scFv，s和抗His包被的磁微珠(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)用于免疫沉淀外。
轉(zhuǎn)化為完整的抗體形式后，Bi、Bll和Cll IgG用于從Raji和Ramos B淋巴瘤細(xì)胞中沉淀抗原。IgG Bl沉淀了分別為大約^kDa和34kDa的兩條帶(圖3A，泳道1)。制備含有這些條帶的凝膠切片，用胰蛋白酶消化，并通過質(zhì)譜測(cè)定法(mass spectrometry)進(jìn)行分析，從而將HLADR/DP鑒定為靶抗原。
通過使用購(gòu)買獲得的單克隆抗體的western印跡法和HLA-DR/DP蛋白檢測(cè)，以及通過將細(xì)胞與商業(yè)上購(gòu)買的HLA-DR特異性單克隆抗體一起預(yù)溫育后，阻抑Bl IgG的結(jié)合， 都證明了 IgG Bl對(duì)HLA-DR/DP的特異性(圖。
用相似的方法，確定IgG Bll和Cll限定的抗原的特性。發(fā)現(xiàn)IgG Cll沉淀68kDa 的蛋白帶，其被鑒定為B細(xì)胞受體μ鏈的膜結(jié)合形式(圖3Α，泳道幻。IgG Bll沉淀90kDa 的蛋白帶，其被鑒定為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附分子I(ICAM-I)(圖3A，泳道2)。利用購(gòu)買獲得的抗體，通過MS-MS分析、抗體阻抑研究(圖3B)和western印跡分析(數(shù)據(jù)未顯示)，證實(shí)了 IgG Bll對(duì)ICAM-I以及Cll IgG對(duì)IgM的特異性。
利用scFv和用于免疫沉淀的抗His包被的磁微珠，測(cè)定克隆B10、C10和G12的特異性。三個(gè)scFv克隆沉淀了 68kDa的蛋白條帶，而且含有這些條帶的胰蛋白酶消化的凝膠切片的MS分析，表明它們對(duì)表面IgM的特異性。推測(cè)這些抗體識(shí)別Ramos IgM獨(dú)特型，因?yàn)樗鼈冎械娜魏我粋€(gè)都不與外周血B淋巴細(xì)胞或其他的IgM陽(yáng)性B細(xì)胞系交叉反應(yīng)。
實(shí)施例3 抗體的親和性分析
Bl和Bll免疫球蛋白的體外碘化
用Iodogen 預(yù)包被的碘化管(Pierce)，在 PBS 中用[125IjNaI 碘化 lmg/ml 的 IgG1 Bl或IgG1 Bll蛋白10分鐘。通過在PD-IO柱(Amersham Biosciences)上脫鹽，除去游離的[125I]NaI，產(chǎn)生 1000-1600Cpm/ng 蛋白的特異放射活性。[125IjIgG1 Bl 和[125IjIgG1 Bll 用于測(cè)定抗體的親和性。
IgG Bl和IgG Bll親和性常數(shù)的測(cè)定
放射性碘標(biāo)記的IgG Bl或IgG Bll與B淋巴瘤細(xì)胞DPBS_B_hIgG(含有0. 2mg/ml 人IgG的DPBS-B)在間斷混合的情況下一起在冰上溫育2小時(shí)。如果適合，在存在0. 2mg/ ml未標(biāo)記的IgG Bl或IgG Bll蛋白的情況下，測(cè)定非特異性結(jié)合。分析進(jìn)行3次重復(fù)。
將細(xì)胞裝載于單個(gè)試管中的40% v/v Ficoll/DPBS-B墊(cushion)上，4°C、 400Xg離心6分鐘。將樣品在-80°C冰凍。將試管切割為兩半后，分離細(xì)胞顆粒物和細(xì)胞上清液，并在在Y計(jì)數(shù)器(gamma counter)中分別分析125I-IgG蛋白含量。
如之前所述(Brixet al. J. Clin. Invest. 1998 ；102 :283-93)，依照 Rosenthal 等 (Anal Biochem 1967 ；20 :525-32)、Bylund 禾口 Yamamura (Methods in Neurotransmitter Analysed. New York Raven Press Ltd. , 1990)以及 Marquardt (J. Soc. Indust. App 1. Math 1963 ；11 :431-41),根據(jù) Scatchard 圖法分析(Scatchard plot analysis)，測(cè)定每個(gè)細(xì)胞的抗體親和性常數(shù)(Kd值)和表位數(shù)。
在存在或不存在0. 2mg/ml對(duì)應(yīng)的未標(biāo)記的IgG蛋白的情況下，通過在4°C時(shí)，將放射性碘標(biāo)記的蛋白與Raji細(xì)胞或Ramos細(xì)胞一起溫育，表征與HLA-DR和ICAM-I結(jié)合的 IgG1和IgG Bll0通過從總的結(jié)合中減去非特異性結(jié)合(存在過量的未標(biāo)記的IgG時(shí)的結(jié)合)，計(jì)算[125I] IgG與細(xì)胞表面的特異性結(jié)合。
在 30nM IgG Bl時(shí)，達(dá)到與Raji細(xì)胞的特異性IgG Bl結(jié)合的飽和。 Rosenthal-Scatchard 圖分析(Rosenthal-Scatchard plot analysis)表明， 3nM解離常數(shù)和4000，000功能結(jié)合位點(diǎn)/Raji細(xì)胞，呈現(xiàn)二價(jià)表位-IgG相互作用(圖5)。同樣，測(cè)定 IgG Bll的解離常數(shù)為 0. 2nM和47，400個(gè)受體/Ramos細(xì)胞。
表1.完整的人Bi、Blljncil IgG抗體顯示動(dòng)態(tài)結(jié)合模式以及在各種B淋巴瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡的方法，包括下列步驟a.提供一種或多種展示細(xì)胞表面抗原ICAM-I的靶細(xì)胞；b.提供一種或多種結(jié)合分子，其選擇性地與細(xì)胞表面ICAM-I結(jié)合，且一旦結(jié)合 ICAM-I，則誘導(dǎo)所述靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；c.將(a)的靶細(xì)胞暴露于(b)的結(jié)合分子，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的結(jié)合分子是抗體分子。
3.誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡的方法，包括下列步驟a.提供一種或多種展示細(xì)胞表面抗原HLA-DR/DP和/或表面IgM的靶細(xì)胞；b.提供一種或多種抗體分子，其選擇性地與細(xì)胞表面HLA-DR/DP和/或表面IgM結(jié)合， 且一旦結(jié)合HLA-DR/DP和/或表面IgM，則誘導(dǎo)所述靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；c.將(a)的靶細(xì)胞暴露于(b)的抗體分子，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
4.用于權(quán)利要求1或2所述方法中的結(jié)合分子，其選擇性地與細(xì)胞表面ICAM-I結(jié)合， 且一旦結(jié)合ICAM-I，則誘導(dǎo)所述靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
5.用于權(quán)利要求3所述方法中的抗體分子，其選擇性地與靶細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原結(jié)合，且一旦結(jié)合所述細(xì)胞表面抗原，則誘導(dǎo)所述靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，其中所述細(xì)胞表面抗原是HLA-DR/DP和/或表面1#。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是抗體分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的結(jié)合分子，其中所述細(xì)胞表面抗原是ICAM-I。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體分子，其中所述細(xì)胞表面抗原是HLA-DR/DP。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體分子，其中所述細(xì)胞表面抗原是表面IgM。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述靶細(xì)胞是免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述免疫細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述靶細(xì)胞與疾病有關(guān)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述疾病選自下組癌癥；自身免疫病，其包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE ；急性和慢性炎癥性疾病；敗血癥以及包括但不限于HIV的傳染性疾病。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述疾病是選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的癌癥。
15.根據(jù)權(quán)利要求6-14中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述抗體分子是IgG0
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述單鏈抗體選自下組=IgGp IgG2、IgG3 或 IgG40
17.根據(jù)權(quán)利要求6-16中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述抗體分子是人抗體或人源化抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求6-17中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述抗體具有可變區(qū)，所述可變區(qū)具有圖9-11中任一圖的序列或具有其功能等同的同源物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述抗體具有可變區(qū)，所述可變區(qū)具有圖9的序列或其功能等同的同源物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述抗體具有可變區(qū)，所述可變區(qū)具有圖10的序列或其功能等同的同源物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)合分子或抗體分子，其中所述抗體具有可變區(qū)，所述可變區(qū)具有圖11的序列或其功能等同的同源物。
22.核酸，其具有編碼權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所述抗體分子的核苷酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的核酸，其具有圖9-11中任一圖的核苷酸序列。
24.權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子在診斷和/或治療和/或預(yù)防疾病中的用途，所述診斷和/或治療和/或預(yù)防要求破壞靶細(xì)胞。
25.權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途，所述診斷和/或治療和/或預(yù)防要求破壞靶細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或25所述的用途，其中所述待治療的疾病選自下組癌癥；自身免疫病，其包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE ；急性和慢性炎癥性疾??；敗血癥以及包括但不限于HIV的傳染性疾病。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的用途，其中所述待治療的疾病是選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的癌癥。
28.根據(jù)權(quán)利要求M-27中任一項(xiàng)所述用途，其中所述結(jié)合分子或抗體分子如權(quán)利要求8或19所定義，所述待治療的疾病如權(quán)利要求M或25所定義。
29.根據(jù)權(quán)利要求M-27中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的結(jié)合分子或抗體分子如權(quán)利要求7或20所定義，所述待治療疾病是如權(quán)利要求27所定義的淋巴瘤。
30.根據(jù)權(quán)利要求M-27中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的結(jié)合分子或抗體分子如權(quán)利要求9或21所定義，所述待治療疾病是如權(quán)利要求27所定義的淋巴瘤。
31.藥物組合物，其包含權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所定義的結(jié)合分子或抗體分子以及藥學(xué)可接受載體、賦形劑或稀釋劑。
32.體外誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡的方法，包括下列步驟a.提供一種或多種靶細(xì)胞；b.提供權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所述的一種或多種結(jié)合分子或抗體分子；c.將(a)的靶細(xì)胞暴露于(b)的結(jié)合分子或抗體分子，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中步驟(a)中提供的所述靶細(xì)胞是免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求32-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶細(xì)胞與疾病有關(guān)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病選自下組癌癥；自身免疫病，其包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE ；急性和慢性炎癥性疾病；敗血癥以及包括但不限于HIV的傳染性疾病。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述疾病是選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的癌癥。
38.體內(nèi)誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡的方法，包括下列步驟a.提供一種或多種靶細(xì)胞；b.提供一種或多種權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子或抗體分子；c.將(a)的靶細(xì)胞暴露于(b)的結(jié)合分子或抗體分子，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中(a)中提供的所述的靶細(xì)胞是免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述免疫細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶細(xì)胞與疾病有關(guān)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述疾病選自下組癌癥；自身免疫病，其包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE ；急性和慢性炎癥性疾??；敗血癥以及包括但不限于HIV的傳染性疾病。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述疾病是選自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、脈絡(luò)叢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的癌癥。
44.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其基本上參照實(shí)施例和附圖如本文所述。
45.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)合分子或抗體分子，其基本上參照實(shí)施例和附圖如本文所述。
46.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)合分子或抗體分子的用途，其基本上參照實(shí)施例和附圖如本文所述。
47.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其基本上參照實(shí)施例和附圖如本文所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物材料及其用途。本發(fā)明提供了結(jié)合分子，包括與靶細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原選擇性結(jié)合的抗體分子，其中，一旦結(jié)合分子結(jié)合細(xì)胞表面的抗原，則誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。也提供了用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物、方法，以及其用途。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102517252SQ20111035626
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日
發(fā)明者比約恩·弗倫多斯, 羅蘭·卡爾松 申請(qǐng)人:生物發(fā)明國(guó)際公司