專利名稱：利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及環(huán)境保護領域及可再生能源領域，具體涉及一種利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法。
背景技術：
資源、能源和環(huán)境是當前人類社會發(fā)展面臨和必須解決的三大難題，我國是世界上經(jīng)濟發(fā)展最為迅速的國家之一，對能源的需求量長期持續(xù)高速增長，石油供給遠不能滿足經(jīng)濟發(fā)展的需要。2009年，我國累計進口原油2. 04億噸，對國際依存度首次超過50%。 國際石油價格的波動，不僅增加了購買石油的外匯消耗，而且給我國的可持續(xù)發(fā)展帶來潛在威脅。發(fā)展替代能源是保障我國能源安全的重大戰(zhàn)略舉措。微藻是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，微藻的含油量在5% 20%，部分微藻的含油量可高達40-60%，甚至80%。微藻的產(chǎn)油率是油料作物如大豆的30-100倍，為生產(chǎn)替代性燃料油奠定了基礎。藻類是自養(yǎng)型生物，以光能作為能源，利用氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)合成復雜的有機質(zhì)。因此，藻類可降低污水中的氮、磷含量。對沼液中氮、磷的去處起到了較好的效果。另外制約微藻生物柴油發(fā)展的瓶頸性因素為成本太高，利用沼液養(yǎng)藻為節(jié)約成本起到了一定的作用。沼液是畜禽糞便及其他有機廢棄物經(jīng)厭氧發(fā)酵后的殘留液，含有大量的氮、磷及重金屬，被視為高濃度污水，直接排放會導致水體富營養(yǎng)化，污染水源，《農(nóng)業(yè)生物質(zhì)能產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃O007-2015年)》中提出，到2015年，全國農(nóng)村戶用沼氣總數(shù)將達到6000萬戶左右，年生產(chǎn)沼氣233億立方米左右，建成規(guī)?；B(yǎng)殖場，養(yǎng)殖小區(qū)沼氣工程8000處，年產(chǎn)沼氣6. 7億立方米。約每天排放沼液量7. 5萬噸，盡管少量的沼液可作為有機肥，但隨著我國沼氣工程的蓬勃發(fā)展，大量的沼液處理也就成了一個問題，因此，隨著我國沼氣工程的蓬勃發(fā)展，大量的沼液需要進行資源化利用。微藻自身含油量高，可以用各種水體養(yǎng)殖，具有不占用耕地等優(yōu)勢，但利用微藻生產(chǎn)生物柴油的方法存在很多問題，成本太高阻礙了該項技術的產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明利用沼液培養(yǎng)微藻，不僅解決了沼液直接排放的環(huán)境方面問題，還實現(xiàn)了沼液的資源化利用，降低了微藻生產(chǎn)生物柴油的成本，對能源和環(huán)境兩方面均產(chǎn)生了積極的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法，該方法不但降低了微藻生物柴油生產(chǎn)成本，而且為環(huán)境中大量沼液處理提供了好的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法，其包括如下步驟(1)微藻種子液的制備利用微生物分離純化法分離微藻，得到純化微藻；(2)沼液的預處理
3CN 102433362 A
說明書
2/4頁 將沼液過濾、離心，取上清液；(3)將處理后沼液轉(zhuǎn)移入內(nèi)循環(huán)式光反應器中，接種種子液，培養(yǎng)，定期測定微藻生長量和營養(yǎng)物質(zhì)變化(微藻生長量用分光光度計OD54tl表示，OD54tl與微藻濃度成正比關系)，評價實驗效果；所述營養(yǎng)物質(zhì)用沼液中TN、TP(均用國標的方法)等變化來衡量。(4)收集微藻，并提取微藻中的油脂，得生物柴油。其中，所述微藻優(yōu)選為小球藻，其從養(yǎng)殖廠排除污水中分離。其中，所述沼液為各種生物質(zhì)經(jīng)過沼氣池厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物。其中，所述步驟⑴還包括對純化的微藻用液體BGll培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，直至培養(yǎng)至對數(shù)期。其中，步驟(1)中所述微生物分離純化法優(yōu)選平板劃線法，所用培養(yǎng)基優(yōu)選為 BGll 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括下述成分=NaNO3L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, NaCO3O. 02g/ L, K2HPO4 · 3Η200· 04g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L,檸檬酸(citic acid)0. 006g/L,檸檬酸鐵銨(Ferric ammonium citrate) 0. 006g/L, EDTA-Na 0. OOlg/L, A5+co solution lml/L, 其中 A5+co solution 成分為 H3B032. 86g/L, MnCl2 · H2O 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 390g/L, Co(NO3)2 · 6H20 0. 049g/L。其中，步驟⑵中所述過濾優(yōu)選8-10層紗布過濾；所述離心條件優(yōu)選轉(zhuǎn)數(shù) 8000-10000rpm、溫度4°C，離心時間10-15分鐘；離心后的沼液上清液需稀釋2_15倍，優(yōu)選 10-15倍，更優(yōu)選15倍。其中，步驟(3)所述種子液為對數(shù)期種子液，接種量按稀釋后沼液總體積的 2% -5%接種量接種，使接種后OD54tl在0. 100附近。其中，步驟(3)所述培養(yǎng)條件為室溫，一般M_27°C，自然光照，通氣培養(yǎng)。其中，步驟中收集微藻的時間為OD值基本不再變化時；收集微藻的方法為離心法，離心條件優(yōu)選4°C，IOOOOrpm離心10分鐘，棄上清。所述步驟(4)收集微藻后、抽提之前，微藻還經(jīng)過烘箱干燥和研缽研磨；所用烘箱溫度為80°C，烘5-7個小時(至微藻恒重)；研磨至微藻成粉末狀。本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明利用沼液培養(yǎng)微藻，不僅解決了沼液直接排放的環(huán)境方面問題，還實現(xiàn)了沼液的資源化利用，降低了微藻生產(chǎn)生物柴油的成本，實現(xiàn)了可再生能源及環(huán)境治理雙益，也為微藻產(chǎn)業(yè)化提供了基礎。


圖1是本發(fā)明提供的利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法一個實例中從污水中按提供方法分離純化的微藻藻種。圖2是本發(fā)明提供的利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法一個實施例中藻種種子液制備的結果。圖3是本發(fā)明提供的利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法一個實施例中用提供沼液養(yǎng)殖微藻的生長曲線變化圖。圖4是本發(fā)明提供的利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法一個實施例中用沼液養(yǎng)殖微藻的總氮變化曲線圖。
4
圖5是本發(fā)明提供的利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法一個實施例中用沼液養(yǎng)殖微藻的總磷變化曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1沼液離心和稀釋倍數(shù)的優(yōu)化取過濾后的沼液，設置離心機的離心梯度6000rpm，8000rpm，IOOOOrpm, 12000rpm 接種相同量藻種，在同一條件下培養(yǎng)，十天后0D540分別為0. 560,0. 590,0. 608,0. 534。從而得出8000-10000rpm得出效果最好。根據(jù)初始沼液的氮、磷含量，參照BGll培養(yǎng)基的氮、磷含量，確定稀釋倍數(shù)大致在 5-20倍附近。固取分別稀釋度為2、5、10、15、20幾個稀釋度，接種藻種起始OD54tl —致，在相同條件下培養(yǎng)，十天后，得到OD值為0. 200,0. 372,0. 510,0. 642,0. 563。從而得出10-15倍稀釋對微藻生長最有利。綜上所述，選擇轉(zhuǎn)速8000-10000rpm離心，選擇10_15倍為稀釋倍數(shù)，對微藻生長是最優(yōu)的。實施例2利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法1、藻種分離純化及種子液制備配制BGll 培養(yǎng)基NaNO3L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 075g/L，NaCO3O. 02g/L， K2HPO4· 3H20 0.04g/L, CaCl2 · 2H20 0.036g/L, citic acidO. 006g/L, Ferric ammonium citrate 0.006g/L, EDTA-Na 0.OOlg/L, A5+cosolution lml/L, ^ 中 A5+co solution
分為 Η3Β032· 86g/L, MnCl2 · H2Ol. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 390g/L, Co(NO3)2 · 6H20 0. 049g/L。用平板劃線的方法分離純化污水中的小球藻，直至出現(xiàn)單藻株，用牙簽挑單藻株接種三角瓶培養(yǎng)，如圖1，圖2。2、取北京X沼氣廠沼液2升，先用8層紗布過濾，濾液用離心機10000rpm，4°C， lOmin，收集上清液，取處理后的上清液1L，用去離子水稀釋至15L，將稀釋15倍的沼液轉(zhuǎn)入光合反應器中，將上一步中生長至對數(shù)期的純種微藻種子液OD54tl值大約是2. 0-5. 0，按 2%-5% (起始OD54tl在0. 1附近)的接種量接種，通氣培養(yǎng)，自然光照，室溫對_271。3、隔天檢測OD54tl,總氮，總磷變化情況，實驗結果如圖3、圖4和圖5。如圖3所示 OD在十天左右基本不再變化，說明到達穩(wěn)定期，圖4所示為沼液中總氮的變化情況，起始稀釋15倍沼液的總氮含量為53. 3;3mg/L，起始四天氮含量急劇下降，到第八天接近lmg/L，到第十天時總氮去除率達到99. 5%，總氮去除效果較為理想。圖5為沼液中總磷的變化情況， 起始稀釋15倍沼液的總磷含量為5. 92mg/L，變化趨勢與總氮較為相似，起始前四天濃度急劇下降，到第八天時為0. 25mg/L,到第十天時總磷去除率接近99. 8%，總磷去除效果相當
王困相4、離心收集微藻，烘干測干重，微藻干重達到0. 5354g/L, 一般自養(yǎng)微藻干重為 0. 2-0. 5g/L左右。說明用稀釋沼液養(yǎng)殖微藻效果較為良好，含量不低于相同條件下專門配
置的微藻培養(yǎng)培養(yǎng)基。
5、用氯仿甲醇法(Bligh and Dyer, 1959)提取微藻中的油脂將冷凍干燥后的微藻干粉，按Ig藻粉3g石英砂的比例混合，置于研缽中充分研磨后加入氯仿甲醇的混合溶劑(氯仿甲醇水=1 2 0.8)，提取油脂。將混合體系于渦旋振蕩器上振蕩5min， 靜置15min后離心，6000rpm，2min,收集上層提取液，下層沉淀重復上述操作，共提取3次。 合并所有的提取液，加入氯仿和水，使氯仿、甲醇和水的最終體積比為1 1 0.9。將混合溶液搖勻后靜置分層，收集下層氯仿層，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60°C蒸去溶劑氯仿，即得到油脂。測得含油量為14 %，一般自養(yǎng)微藻含油量為5 % -20 %。沼液培養(yǎng)微藻油脂含量在一般范圍內(nèi)，說明沼液養(yǎng)藻的可行性。相同條件下，用小球藻Chlorella vulgaris (1068，購自武漢水生所)與污水分離出微藻作對照培養(yǎng)，Chlorella vulgaris處理沼液氮、磷去除率分別為72. 7%和77. 24%, 生物量干重達到0. 4(^9g/L，油脂含量達到10. 33%，而污水處理沼液氮、磷去除率分別達到99. 5%和99. 8 %，生物量干重達到0. 53Mg/L，油脂含量達14%，通過比較可知，污水分離微藻相對其他來源微藻在沼液處理方面優(yōu)勢較明顯。本實驗充分說明了沼液在養(yǎng)殖微藻方面的效果良好，氮、磷去除效果較理想，微藻生長狀況良好，獲得了微藻生物柴油制備的可能性，并且降低了微藻養(yǎng)殖成本。因此本發(fā)明提供的方法是一種耦合生物柴油制備及沼液處理的好方法，一方面降低了微藻養(yǎng)殖成本， 另一方面對環(huán)境治理有較好的效果，實現(xiàn)了可再生能源及環(huán)境治理雙益，有較好的使用前景。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法，其包括如下步驟(1)微藻種子液的制備利用微生物分離純化法分離微藻，得到純化微藻；(2)沼液的預處理將沼液過濾、離心，取上清液；(3)將處理后沼液轉(zhuǎn)移入內(nèi)循環(huán)式光反應器中，接種種子液，培養(yǎng)，定期測定微藻生長量和營養(yǎng)物質(zhì)變化，評價實驗效果；(4)收集微藻，并提取微藻中的油脂，得生物柴油。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻為小球藻。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)還包括對純化微藻進行擴大培養(yǎng)。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述擴大培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為液體BGll 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括下述成分=NaNO3L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, NaCO3O. 02g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 04g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L,檸檬酸 0. 006g/L,檸檬酸鐵銨 0. 006g/L, EDTA-Na 0. OOlg/L, A5+co solution lml/L。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述離心條件為轉(zhuǎn)數(shù) 8000-10000rpm、溫度4°C，離心時間10-15分鐘。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述離心后的沼液上清液需稀釋 10-15 倍。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述種子液為對數(shù)期種子液，接種量按稀釋后沼液總體積的2% -5%接種量接種。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述培養(yǎng)條件為室溫，自然光照，通氣培養(yǎng)。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟中收集微藻的時間為OD值基本不再變化時，收集微藻的方法為離心法。
10.如權利要求1-9任意一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)收集微藻后、抽提之前，微藻還經(jīng)過烘箱干燥和研缽研磨。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用微藻處理沼液耦合生產(chǎn)生物柴油的方法，它包括(1)微藻種子液的制備，利用微生物分離純化法分離微藻，得到純化微藻；(2)沼液的預處理，將沼液過濾、離心，取上清液；(3)將處理后沼液轉(zhuǎn)移入內(nèi)循環(huán)式光反應器中，接種種子液，培養(yǎng)，定期測定微藻生長量和營養(yǎng)物質(zhì)變化，評價實驗效果；(4)收集微藻，并提取微藻中的油脂，得生物柴油。本發(fā)明利用沼液培養(yǎng)微藻，不僅解決了沼液直接排放的環(huán)境方面問題，還實現(xiàn)了沼液的資源化利用，降低了微藻生產(chǎn)生物柴油的成本，實現(xiàn)了可再生能源及環(huán)境治理雙益，也為微藻產(chǎn)業(yè)化提供了基礎。
文檔編號C12P7/64GK102433362SQ20111034026
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權日2011年11月1日
發(fā)明者李朋飛, 賀國強, 鄧志平, 陳三鳳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學