專利名稱：一種檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種利用PCR擴增檢測κ-ras基因突變的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
K-ras基因是重要的原癌基因，K-ras基因突變使ras蛋白一直處于激活狀態(tài)，刺激細胞不斷的生長或分化，最終導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。大約30%的人類腫瘤細胞中出現(xiàn) K-ras基因突變。Bosetal分析了人體腫瘤中K-ras基因點突變的發(fā)生率，胰腺癌82%，結(jié)腸癌43%，肺癌30% c,甲狀腺癌四％，膀胱、肝、腎和子宮癌10%或低于10%。Mok等報道交界瘤中，K-ras突變發(fā)生率為48%，突變分別發(fā)生于12號密碼子及13號密碼子。直結(jié)腸癌 K-ras基因點突變率達40% -50%以上，且點突變幾乎皆位于12，13，61號密碼子，其中大多數(shù)點突變位于12號密碼子。Pontieri-Lewis等研究證實約50%的大腸癌組織中檢測出 K-ras基因突變，其中約80%的點突變位于K-ras基因12號密碼子，另約15%發(fā)生在K-ras 基因13號密碼子。K-ras基因突變的位點最常見于第12，13號密碼子，可導致p21-ras蛋白的生長信號的異常變化。過度的生長信號可刺激細胞生長和增殖從而導致了癌癥的發(fā)生。2008年6月在美國臨床腫瘤學會(ASCO)年會上發(fā)布了最新臨床研究結(jié)果，即K-ras突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用；而K-ras野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益。同年10月，K-ras基因突變檢測被寫入最新版 (2008年第3版)《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》。該指南明確指出兩點，一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)，二是只有K-ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑(如西妥昔單抗和帕尼單抗)治療。國家衛(wèi)生部于2010年10 月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范O010版)》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)0010)165號)。該規(guī)范明確指出在患者確定為復發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受愛必妥、帕尼單抗治療前，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。另外，《09年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出當K-ras 基因如果發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)進行分子靶向治療。綜上所述檢測K-ras基因突變的情況不僅僅有助于腫瘤的早期診斷及預防， 也有利于腫瘤患者的臨床治療。準確且迅速的診斷出K-ras基因有無12，13號密碼子突變對腫瘤的早期診斷及預后有著重要的意義。目前，主要用于基因突變檢測的方法包括如下幾種(1)利用單堿基變化產(chǎn)生新的或消除已有的內(nèi)切酶識別位點；(2)利用單堿基變化造成的堿基互補性對引物延伸反應(yīng)的影響；C3)利用單堿基變異對核酸分子雜交的影響；(4)利用單堿基變異對核酸分子在電場中遷移速度的影響；( 直接測定單堿基變異。其中第一類的代表方法為限制性內(nèi)切酶酶解片段長度多態(tài)性，這一方法具有簡便、經(jīng)濟和十分可靠的特點，但這一方法的顯著弱點是僅能用于研究小部分涉及了限制性內(nèi)切酶酶解位點變化的突變，且該類方法難以直接應(yīng)用于高通量平行分析。另一類種類繁多且獲得廣泛應(yīng)用的突變檢測方法，是堿基特異引物延伸反應(yīng)，包括雙向引物延伸反應(yīng)，即應(yīng)用堿基特異性引物與常規(guī)的多聚酶鏈式反應(yīng)相結(jié)合、引物延伸反應(yīng)與連接酶相結(jié)合、引物延伸反應(yīng)與雜交分析相結(jié)合等。所有這些方法的共同點是使用了無校正功能的DNA聚合酶。上述不同方法所得的假陰性高低各不相同，但其共用的無校正功能的低保真聚合酶使所有這一類方法具有其結(jié)構(gòu)上的缺陷，即無可避免地產(chǎn)生較高的假陽性。而目前常規(guī)使用的Sanger酶法測序即雙脫氧核苷酸介導的單堿基延伸反應(yīng)，對突變含量較低的相嵌體、突變較少的線粒體異質(zhì)體、體細胞突變和頻態(tài)分布較低的DNA池分析均難以應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒，通過采用一組特異性PCR引物對待測樣本進行擴增，檢測是否產(chǎn)生擴增產(chǎn)物條帶，以及條帶的大小判斷K-ras基因型，可快速、準確、簡便、經(jīng)濟地判斷待測樣本是否存在K-ras基因的3個熱點突變12號密碼子GGT-GAT，GGT-GTT, 13號密碼子GGC-GAC。為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，包括常規(guī)PCR組件，還包括特異性引物；所述特異性引物包括三條正向引物和一條反向引物，其中三條正向引物的序列分別具有SEQ ID No. USEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 PJf 示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No. 4所示核苷酸序列；所述特異性引物的核苷酸序列具體如下所示SEQ ID No. 1 :5，-TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3‘；SEQ ID No. 2 5' -TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3‘；SEQ ID No. 3 5' -TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3‘；SEQ ID No. 4 5' -TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3，。上述技術(shù)方案中，正向引物SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和反向引物序列SEQ ID NO. 4檢測的位點分別對應(yīng)12號密碼子GGT-GAT、GGT-GTT、13號密碼子GGC-GAC， 正向引物三末端第二個堿基(下劃線標記)為硫化修飾堿基。上述技術(shù)方案中，所述常規(guī)PCR組件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸鎂的Pfu緩沖液，dNIPs。上述技術(shù)方案中，所述檢測K-ras基因突變的試劑盒還包括三個檢測位點的陽性對照突變質(zhì)粒，所述三個檢測位點的陽性對照突變質(zhì)粒分別為，PGEM-T質(zhì)粒載體插入包含 K-ras基因12號密碼子GGT-GAT的突變序列，pGEM-T質(zhì)粒載體插入包含K_ras基因12號密碼子GGT-GTT的突變序列，pGEM-T質(zhì)粒載體插入包含K_ras基因13號密碼子GGC-GAC的突變序列。采用上述檢測K-ras基因突變的試劑盒檢測待測樣本是否存在K-ras基因的3個熱點突變(12號密碼子GGT-GAT，GGT-GTT, 13號密碼子GGC-GAC)的方法，包括以下步驟(1)采用常規(guī)方法提取待測組織樣本基因組DNA或外周血游離DNA ；(2)以步驟(1)所得樣本基因組DNA或外周血游離DNA為模板，采用特異性引物進行多重PCR擴增，根據(jù)PCR擴增的結(jié)果判斷樣本中是否含有K-ras基因的3個熱點突變中的至少一種；判斷規(guī)則為如果出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則表明樣本中含有上述3個熱點突變中的至少一種；如果沒有出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則表明樣本中不含上述3個熱點突變中的任意一種；所述3 個熱點突變?yōu)?2號密碼子GGT-GAT突變，12號密碼子GGT-GTT突變，13號密碼子GGC-GAC
4突變。上述技術(shù)方案中，進行多重PCR擴增時，每25 μ L的多重PCR擴增體系包括lyL 模板^)ι^/μυ，2. 5yL IOX含有硫酸鎂的Pfu緩沖液，1. 5 μ L反向引物(10 μ Μ)，三條正向引物(ΙΟμΜ)各 0. 5μ L，0. 2μ L Pfu 酶(2. 5U/μ L)，0. 4 μ LdNTPs (各 10 μ Μ)，剩下加水補足；多重PCR反應(yīng)條件為95°C預變性5分鐘，95°C變性20秒，68°C退火20秒(退火溫度每個循環(huán)遞減1°C )，72 °C延伸30秒，共10個循環(huán)；95 °C變性20秒，59 V退火20秒，72 °C 延伸30秒，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。進一步的技術(shù)方案中，PCR擴增結(jié)束后采用常規(guī)技術(shù)進行純化和電泳鑒定。本發(fā)明的基本原理為由于低保真酶對突變的分辨率僅為10_4，而高保真酶的分辨率為10_7，遠遠大于低保真酶對突變的識別能力。采用高保真聚合酶與硫化修飾引物構(gòu)成的分子開關(guān)系統(tǒng)，具備對突變位點高度辨認的能力。對三末端錯配的硫化修飾堿基的特異性引物而言，由于其修飾了的三末端耐外切酶的特點，致使高保真聚合酶分子中無法酶解錯配堿基，造成“關(guān)”閉DNA聚合反應(yīng)的效果；對于配對的引物，高保真聚合酶則繼續(xù)完成 DNA聚合反應(yīng)，形成“開”的效應(yīng)。這種配對引物被延伸，而不配對引物則不被延伸的二元化效果，滿足了突變分析時需要對特定位點進行非此即彼的二元化辨認。具體地，當待測樣本為K-ras野生型時，三條正向引物的三末端第二個堿基與K-ras野生型模板序列不配對，且硫化修飾，利用高保真酶的分子開關(guān)效應(yīng)，無目的產(chǎn)物擴增；當待測樣本中至少含有K-ras 的三個熱點突變中的一個時，三條正向引物的三末端第二個堿基在與K-ras突變模板互補的情況下，可以擴增出相對應(yīng)的目的產(chǎn)物。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點1.采用本發(fā)明所述檢測K-ras基因突變的試劑盒和檢測方法檢測K-ras基因突變時，具備快速，準確、方法簡單、成本低的優(yōu)點，因采用多重PCR技術(shù)，在2小時內(nèi)可檢測出三種K-ras基因突變位點，與臨床檢測金標準序列測定至少所需5小時相比，檢測時間大大縮短；本發(fā)明所述試劑盒對突變模板最低檢測拷貝數(shù)可達IO2拷貝數(shù)，且出現(xiàn)假陽性的檢測起始模板拷貝數(shù)為106，遠高于臨床樣本基因組DNA起始模板IO4拷貝數(shù)(如圖4)；本發(fā)明所述試劑盒在檢測臨床腫瘤樣本中突變檢出率，經(jīng)測序驗證結(jié)果一致(如圖幻。由于上述優(yōu)點，有利用臨床使用和推廣。


圖1為實施例一中K-ras野生型DNA測序圖譜；圖2為實施例二中K-ras 12號密碼子GGT-GAT或GGT-GTT DNA測序圖譜；圖3為實施例二中K-ras 13號密碼子GGC-GAC測序圖譜；圖4為實施例二中分子開關(guān)敏感性與特異性的電泳圖；圖5為實施例二中9個腫瘤組織DNA模板的分子開關(guān)檢測電泳圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一制備K-ras野生型及突變型質(zhì)粒DNA，具體步驟如下1)用常規(guī)方法提取人全血樣本基因組DNA，DNA測序證明樣本為k_ras野生型，測序結(jié)果如圖1所示。2)設(shè)計并制備k-ras基因12號及13號密碼子的三個點突變模板的引物分別為引物A對和引物對B，引物對C和引物對D，引物對E和引物對F，序列如下其中，引物對A包括正向引物Tlk-rasmut和反向引物T3k_rasmut，擴增突變模板上游引物；引物對B包括正向引物T4k-rasmut和反向引物T2k-rasmut，擴增突變模板下游引物；引物對A和引物對B擴增k-rasl2號密碼子GGT-GTT的突變模板。其中，引物對C包括正向引物Tlk-rasmut和反向引物T5k_rasmut，擴增突變模板上游引物；引物對D包括正向引物T6k-rasmut和反向引物T2k-rasmut ；擴增突變模板下游引物；引物對C和引物對D擴增k-rasl2號密碼子GGT-GAT的突變模板。其中，引物對E包括正向引物Tlk-rasmut和反向引物T7k_rasmut，擴增突變模板上游引物；引物對F包括正向引物T8k-rasmut和反向引物T2k-rasmut，擴增突變模板下游引物；引物對E和引物對F擴增k-ras12號密碼子GGT-GAT的突變模板。具體的引物序列
請參見下表
權(quán)利要求
1.一種檢測κ-ras基因突變的試劑盒，包括常規(guī)PCR組件，其特征在于，還包括特異性引物；所述特異性引物包括三條正向引物和一條反向引物，并且每一條正向引物的三末端第二個堿基為硫化修飾堿基；其中三條正向引物的序列分別具有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No. 4所示核苷酸序列；所述特異性引物的核苷酸序列具體如下所示SEQ ID No. 1 :5’ -TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3‘；SEQ ID No. 2 :5’ -TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3‘；SEQ ID No. 3 :5’ -TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3‘；SEQ ID No. 4:5’ -TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’ ；所述常規(guī)PCR組件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸鎂的Pfu緩沖液，dNTPs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測K-ras基因突變的試劑盒，其特征在于，所述檢測K-ras基因突變的試劑盒還包括三個檢測位點的陽性對照突變質(zhì)粒，所述三個檢測位點的陽性對照突變質(zhì)粒分別為pGEM-T質(zhì)粒載體插入包含K-ras基因12號密碼子GGT-GAT的突變序列， pGEM-Τ質(zhì)粒載體插入包含K-ras基因12號密碼子GGT-GTT的突變序列，pGEM-T質(zhì)粒載體插入包含K-ras基因13號密碼子GGC-GAC的突變序列。
3.采用權(quán)利要求1所述檢測K-ras基因突變的試劑盒檢測待測樣本是否存在K-ras基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)采用常規(guī)方法提取待測組織樣本基因組DNA或外周血游離DNA；(2)以步驟(1)所得樣本基因組DNA或外周血游離DNA為模板，采用特異性引物進行多重PCR擴增，根據(jù)PCR擴增的結(jié)果判斷樣本中是否含有K-ras基因的3個熱點突變中的至少一種；判斷規(guī)則為如果出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則表明樣本中含有上述3個熱點突變中的至少一種；如果沒有出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則表明樣本中不含上述3個熱點突變中的任意一種；所述3 個熱點突變?yōu)?2號密碼子GGT-GAT突變，12號密碼子GGT-GTT突變，13號密碼子GGC-GAC 突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測K-ras基因突變的試劑盒檢測待測樣本是否存在K-ras基因突變的方法，其特征在于，進行多重PCR擴增時，每25 μ L的多重PCR擴增體系包括1 μ L 模板，2. 5 μ L IOX含有硫酸鎂的Pfu緩沖液，1. 5 μ L反向引物，三條正向引物各0. 5 μ L， 0. 2yL Pfu酶，0.4yL dNTPs，剩下加水補足；多重PCR反應(yīng)條件為95°C預變性5分鐘， 95°C變性20秒，68°C退火20秒，退火溫度每個循環(huán)遞減1°C，72°C延伸30秒，共10個循環(huán)； 95°C變性20秒，59°C退火20秒，72°C延伸30秒，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
5.如SEQID No. 1所述的核苷酸序列。
6.如SEQID No. 2所述的核苷酸序列。
7.如SEQID No. 3所述的核苷酸序列。
8.如SEQID No. 4所述的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，公開了一種利用PCR擴增檢測K-ras基因突變的方法及試劑盒，包括常規(guī)PCR組件，特異性引物；所述特異性引物包括三條正向引物和一條反向引物，其中三條正向引物的序列分別具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列。然后利用電泳分離PCR擴增的目的產(chǎn)物條帶的有無，來判斷K-ras基因是否存在12號密碼子的GGT-GAT，GGT-GTT，13號密碼子GGC-GAC三個熱點突變中的至少一個。采用本發(fā)明所述檢測K-ras基因突變的試劑盒和檢測方法檢測K-ras基因突變時，快速、準確、方法簡單、成本低的優(yōu)點，有利用臨床使用和推廣。
文檔編號C12N15/11GK102399872SQ20111033079
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者姬云, 張佳, 李凱, 王偉大, 王慶琳, 肖莉 申請人:蘇州科貝生物技術(shù)有限公司