專利名稱：一個與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖標記的開發(fā)與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水稻分子標記輔助選育和種子純度鑒定的技術領域，具體地說是利用一種水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記對水稻溫敏核不育系進行輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。
背景技術：
水稻光、溫敏不育資源(即兩系不育資源)的發(fā)現及其在雜交水稻上的成功應用， 為保障我國糧食安全問題發(fā)揮了重要作用。與三系不育系相比，兩系不育系具有自我繁殖、 恢復譜廣等優(yōu)點，因此，近年兩系法雜交水稻在我國發(fā)展較快，種植面積和推廣范圍迅速擴大。據農業(yè)部統(tǒng)計，2009年全國種植面積超過400萬畝的雜交水稻品種全部為兩系水稻。兩系不育系的快速選育，是推動兩系雜交水稻迅速發(fā)展的重要前提。傳統(tǒng)的光溫敏不育系的選育往往是以不育材料為母本，與可育材料雜交或回交，將F2代或回交后代正季種植，在長日高溫條件下選擇不育單株，然后割蔸帶至海南進行冬春季隔離繁殖；繁殖收獲的種子帶回內地種植，正季進行不育性狀鑒定，再割蔸帶至海南冬春季隔離繁殖。正季不育性狀鑒定和海南島繁殖交替進行數次，以選育穩(wěn)定的兩系不育系。若在選育過程中，正季出現連續(xù)低溫多雨天氣，無法進行不育性狀鑒定，必須待到下一年正季重新鑒定，大大延緩了兩系不育系的選育進度。分子標記輔助育種是指利用與特定性狀相關聯(lián)的分子標記作為輔助手段進行的育種。開發(fā)與水稻光、溫敏不育性狀關聯(lián)的分子標記，并應用于兩系不育系的輔助選育，將大大提高不育系的選育效率。InDel (insertion-deletion)標記即插入缺失標記，指的是兩種基因型在全基因組中的差異，相對于另一個基因型而言，其中一個基因型的基因組中有一定數量的核苷酸插入或缺失。根據基因組中插入缺失位點，設計一些特異擴增識別這些插入缺失位點的PCR引物，這就是InDel標記，是一類共顯性標記。目前我國生產應用的大多數溫敏核不育系的不育基因來源于安農S或其同型系及衍生系，表現為高溫不育、低溫可育，其育性主要由溫敏核不育基因 tms5(Thermo-sensitive Genic Male Sterile Gene)控制。本實驗室前期研究發(fā)現，溫敏核兩系不育系(如安農S-1)和其恢復系(如93-11)等在tms5區(qū)域存在序列差異。依據此段序列差異開發(fā)了一個MDel標記，驗證實驗表明該標記能夠通過特異識別tms5位點， 從而實現對溫敏核不育基因的鑒定，一方面能夠用于溫敏核兩系不育系的輔助選育，另一方面也可以用于溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對溫敏核不育系與恢復系(或具恢復能力的雜交親本)在tms5區(qū)域的序列差異，開發(fā)了一個與tms5緊密連鎖的InDel標記SJ001，利用PCR技術對該標記位點進行擴增，通過電泳檢測擴增產物的片段數量和大小，判斷被檢水稻樣品是否為溫敏型不育材料，進而實現對溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。本發(fā)明解決技術問題采用如下方案一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記SJ001，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。本發(fā)明水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記的應用方法為，設計如下引物對水稻樣品DNA進行擴增，根據擴增差異，實現水稻溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定，SJ001-F 5' ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3，
SJ001-R 5，GGCCAAGTGTTATGATCACT 3，。所述擴增差異，指產物電泳譜帶類型攜有tms5基因的溫敏核不育系會擴增出一條387bp的譜帶；攜有tms5基因的溫敏型兩系雜交水稻會擴增出大小分別為463bp和 387bp的兩條譜帶；不攜有tms5基因的水稻會擴增出一條46;3bp的譜帶。本發(fā)明水稻樣品包括但不限于水稻的種子、幼苗、葉片、根、莖、穗；所述的水稻溫敏核兩系不育系包括但不限于安農3-1、廣占633、189233583、新安S、新華S、03S、新二 S、 綠102S、株1S、廣茉S、2301S、綠敏S、63_4S或其同型系及衍生溫敏型核不育系；所述的溫敏型兩系水稻包括水稻溫敏核不育系和以水稻溫敏核不育系為親本選配的雜交組合。其詳細步驟按如下所述1. CTAB法提取水稻基因組DNA1. 1用于溫敏核不育系的輔助選育的DNA樣品提取將溫敏核不育基因供體材料(即不育系)和不育基因受體材料設為對照；剪取水稻雜交(或回交)后代成株期幼嫩葉片100-200mg，移入2. OmL離心管中，并將溫敏核不育基因供體材料(即不育系)和不育基因受體材料設為對照；向離心管中加液氮用玻棒充分研磨至粉末狀，再加入700 μ L 65°C預熱的DNA提取液(81. 7g NaCl和20g CTAB充分溶于適量水中，然后加入 lmol/L Tris-HCl lOOmL，0. 5mol/L EDTA 40mL，定容至 lOOOmL，4°CC: 存。)，65°C孵育lh，每隔15min顛倒混勻一次；加入等體積氯仿/異戊醇，輕緩混勻，室溫靜置15min ； 12，OOOrpm離心15min，吸取上清移至另一支1. 5mL離心管中，再加入等體積異丙醇混勻，置于_20°C 30min，4°C、12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入200 μ L 70%乙醇洗滌沉淀；12，OOOrpm離心IOmin后棄去乙醇，室溫干燥后加入50 μ L滅菌水，充分溶解后備用。1. 2用于溫敏型兩系雜交稻純度鑒定的DNA樣品提取每樣品取50-500粒單株(對于雜交種檢測，盡量將其父母本作為對照)，種子發(fā)芽后取幼苗置于2. OmL離心管中，其余過程同1. 1。2.水稻基因組DNA的PCR擴增利用引物對水稻基因組DNA進行擴增，引物序列如下SJ001-F 5' ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3，SJ001-R :5，GGCCAAGTGTTATGATCACT 3，擴增體系中各組分配制見表1表IPCR反應體系反應組分原濃度終濃度推薦反應體積(20 μ L)ddH2012. 35IOXBufferIOXIX2. 0MgC1225mmol/L2.5mmol/L2. 0dNTPs2. 5mmol/L 每種0. 15mmol/L 每種1. 2Teig 酶5. OU/ μ L1. OU0. 2SJOOl-F20umol/L0. 25ymol/L0. 25SJOOl-R20umol/L0. 25ymol/L0. 25模板DNA2. 0注反應體積可選擇在5-25 μ L之間，模板DNA原濃度在20-200ng/μ L之間。擴增條件為反應程序為95°C變性5min 后，94°C 30sec，56°C 30sec，72°C 30sec, 循環(huán)35次，72°C延伸lOmin，12°C保溫。擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。3.溫敏核不育系輔助選育為了將具優(yōu)異的性狀水稻可育品系改良成兩系不育系，用優(yōu)良水稻品系與溫敏核不育系雜交并回交，利用引物SJ001-F、SJ001-R擴增各雜交(回交)世代單株SJOOl位點， 根據引物在各單株上的擴增情況，判斷溫敏核不育基因tms5的存在與否，從而輔助選育具優(yōu)良特性的溫敏核兩系不育系。其中，僅擴增出一條387bp譜帶的單株為攜有tms5基因的不育單株；僅擴增出 463bp譜帶的單株為不攜有tms5基因的可育單株；擴增出大小分別為463bp和387bp的兩條譜帶的單株為可育雜合單株。4.溫敏型兩系水稻純度鑒定根據標記SJOOl在水稻溫敏核不育系、恢復系和溫敏型兩系雜交稻種中擴增結果的差異，判別受檢溫敏核不育系中是否存在可育單株混雜；或判別受檢溫敏型兩系雜交稻種中是否存在溫敏核不育系或恢復系(或其它親本)單株混雜。攜有tms5基因的溫敏核不育系僅擴增出一條387bp的譜帶；攜有tms5基因的兩系雜交水稻會擴增出大小分別為463bp和387bp的兩條譜帶；不攜有tms5基因的水稻僅擴增出一條463bp的譜帶。因此，當對溫敏兩系不育系進行純度鑒定時，凡是未擴增出大小 387bp單一譜帶的單株，都判定為混雜株；當對溫敏兩系雜交水稻進行純度鑒定時，凡是僅擴增出大小為387bp單一譜帶的，判定為溫敏核不育系混雜，凡是僅擴增出大小為463bp單一譜帶的，都判定為恢復系(或其它親本)混雜。水稻樣品純度檢驗結果按以下公式計算P (%) =Nt_NdX\00%
5
式中P-樣品純度；Nt-為供檢種子粒數(幼苗數、株數)；Nd-為判定為混雜株的種子粒數(幼苗數、株數)。


圖1 本發(fā)明中測序引物對安農S-I中溫敏核不育基因tms5區(qū)域的擴增情況M 分子量標準；1 測序引物(tms5_PlF、tms5_PlR)的擴增結果；2 測序引物 (tms5-P2F、tms5-P2R)的擴增結果圖2A、B、C 本發(fā)明攜有溫敏核不育基因tms5的安農S-1與日本晴、93-11 (揚稻6 號)在同一位點上的DNA序列比對結果日本晴不攜有溫敏核不育基因tms5水稻日本晴在此位點的DNA序列93-11 不攜有溫敏核不育基因tms5水稻93-11在此位點的DNA序列安農S-I 攜有溫敏核不育基因tms5水稻安農S-1在此位點的DNA序列圖3 本發(fā)明引物SJ001-F、SJ001-R在標記SJ001序列上的位置安農S-I 標記SJ001在水稻溫敏型核不育系安農S-I基因組中的DNA序列圖4 本發(fā)明中引物SJ001-F、SJ001-R在部分水稻溫敏核不育系和非溫敏型材料中的擴增情況1、珍汕 97A，2、明恢 100，3、成恢 047，4、桂 99，5、明恢 63，6、明恢 72,7,制選，8、蜀恢 527,9,93-11,10、日本晴，11、新安 S, 12、03S，13、新二 S, 14U892S, 15、綠 102S, 16、安農 S-1,17、Y58S, 18、株 1S, 19、新華 S，20、廣茉 S，21、2301S，22、C815S，23、63_4S，24、綠敏 S, 25、N632S，26、rA63S，27、2310SA，28、2310S，29、2312S，30、78S，31、7001S其中，1-10為非兩系不育系材料，11-26為溫敏核不育系材料，27-31為光敏核不育系材料圖5A、B、C、D 本發(fā)明中引物SJ001-F、SJ001-R在部分溫敏型兩系雜交水稻及親本中的擴增情況U Y58S(早)，2、Y 兩優(yōu) 1 號，3、93_11 (S); 4、廣占 63_4S(早)，5、揚兩優(yōu) 6 號，6、 93-11 (( ); 7、新安S(早)，8、新兩優(yōu)6號，9、安選6號(而；13、新華S(早)，14、兩優(yōu)華6，15、 安選6號(( )； 16、廣茉S(早)，17、廣兩優(yōu)100，18、紫恢100 ((5); 19、廣茉S(早)，20、兩優(yōu) 100，21、紫恢 100 選⑶；22、2301S(早)，23、皖稻 199,24,3401 0)； 28、廣占 63S(早)，29、 豐兩優(yōu) 1 號，30、93-11 (3); 31、1892S(早)，32、徽兩優(yōu) 6 號，33、93_11 34、1892S (早)， ；35、皖稻 153，36、RH003 (3)圖6 本發(fā)明溫敏核不育系選育流程圖7 本發(fā)明引物SJ001-F、SJ001-R對溫敏核不育系的輔助選育M 分子量標準；G 廣占 63S ；S :1892S ；X :Xa21/Xa23 ；1-19 廣占 63S 與 Xa21/Xa23 所配 BC3F3 單株；20-38 :1892S 與 Xa21/Xa23 所配 BC1F3 單株。箭頭所示不育單株，星號所示僅有父本帶型的可育單株，其余為可育雜交單株。圖8 本發(fā)明廣占63S、1892S雜交(回交)后代花粉碘染情況
A 廣占63S雜交(回交)后代不育單株花粉；B 廣占63S雜交(回交)后代可育單株花粉；C:1892S雜交(回交)后代不育單株花粉；D:1892S雜交(回交)后代可育單株花粉。圖9A、B、C、D 本發(fā)明中引物SJ001-F、SJ001-R對溫敏型兩系雜交水稻皖稻 153 (1892SX RHO(XB)純度鑒定情況(部分單株電泳結果)M 分子量標準 ’母母本(1892S)對照；父父本(RH003)對照；48、63、141 檢出的母本(1892 混雜；67 檢出的父本(RH00;3)混雜圖10A、B 本發(fā)明圖9中皖稻153各單株經SSR引物RM7120檢測驗證情況(部分單株電泳結果)母母本(1892S)對照；父父本(RH003)對照；48,63,141 檢出的母本(1892S) 混雜；67 檢出的父本(RH00;3)混雜
具體實施例方式以下敘述本發(fā)明的實施事例。應該說明，本發(fā)明的實施事例只對本發(fā)明起說明作用，而沒有任何限制作用。本領域技術人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進。1、CTAB法提取溫敏核不育系安農S-I基因組DNA 1)取安農S-I種子100粒左右，28°C發(fā)苗約1周；2)單株幼苗置于2. OmL離心管中，加入液氮，用玻棒充分研磨至粉末狀，處理6個單株；3)向離心管中加入700 μ L 65°C預熱的DNA提取液(81. 7g NaCl和20g CTAB充分溶于適量水中，然后加入 lmol/L Tris-HCl 100mL,0. 5mol/L EDTA40mL，定容至 lOOOmL，
4°C貯存。)；4) 65°C孵育lh，每隔15min顛倒混勻一次；5)加入等體積氯仿/異戊醇，輕緩混勻，室溫靜置15min ；6) 12，OOOrpm離心15min，吸取上清移至另一支1. 5mL離心管中，再加入等體積異丙醇混勻，置于 _20°C冷凍 30min，4°C、12，OOOrpm 離心 IOmin ；7)棄上清，加入200 μ L 70%乙醇洗滌沉淀；8) 12，OOOrpm 離心 IOmin 后棄去乙醇；9)室溫干燥后加入50 μ L滅菌水，充分溶解后備用。2、溫敏核不育基因tms5區(qū)域序列測定1)測序引物設計根據我們先前的研究，認為溫敏型核不育系(如安農S-I等)與恢復系(如93-11 等)在溫敏型核不育基因tms5區(qū)域上存在序列差異，我們依據NCBI公布的日本晴、93-11 相關位點的核酸序列，設計了 2對針對安農S-I中tms5區(qū)域的測序引物tms5--PlF:5，TTCTCTGAAGCTGAAAGATAAAG 3
tms5--PlR:5，CAGTACAAATGTAGACGCTCATA 3
tms5--P2F:5，GAACTCGTTGGTGACATTGTAG 3’
tms5--P2R:5，TTTAATTTGGTTCATCGGTTTC 3’
2) PCR擴增與電泳檢測在0. 2mL薄壁管中依次加入，反應體系為
權利要求
1.一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記SJ001，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。
2.一種如權利要求1所述的一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記的應用，其特征在于，設計如下引物對水稻樣品DNA進行擴增，根據擴增差異，實現水稻溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定，SJ001-F :5，ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3，SJ001-R :5，GGCCAAGTGTTATGATCACT 3，。
3.一種如權利要求2所述的一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記的應用，其特征在于，所述擴增差異，指產物電泳譜帶類型攜有tms5基因的溫敏核不育系會擴增出一條387bp的譜帶；攜有tms5基因的溫敏型兩系雜交水稻會擴增出大小分別為 463bp和387bp的兩條譜帶；不攜有tms5基因的水稻會擴增出一條46;3bp的譜帶。
4.根據權利要求2所述的一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記的應用，其特征在于，所述水稻樣品包括但不限于水稻的種子、幼苗、葉片、根、莖、穗。
5.根據權利要求2所述的一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記的應用，其特征在于，所述的水稻溫敏核兩系不育系包括但不限于安農S-I、廣占63S、1892S、 Y58S、新安S、新華S、03S、新二 S、綠102S、株1S、廣茉S、2301S、綠敏S、63_4S或其同型系及衍生溫敏型核不育系。
6.根據權利要求2所述的一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標記的應用，其特征在于，所述的溫敏型兩系水稻包括水稻溫敏核不育系和以水稻溫敏核不育系為親本選配的雜交組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel(insertion-deletion)標記，可用于水稻溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。本發(fā)明依據水稻溫敏核不育系與恢復系(或具恢復能力的雜交親本)在tms5基因所在區(qū)域的DNA序列差異，開發(fā)了一個用于水稻溫敏核不育系輔助選育及溫敏型兩系水稻純度快速鑒定的InDel標記，即SJ001，利用PCR技術擴增該標記位點，攜有tms5基因的溫敏核不育系僅擴增出一條387bp的譜帶；攜有tms5基因的溫敏型兩系雜交水稻會擴增出大小分別為463bp和387bp的兩條譜帶；不攜有tms5基因的水稻(非溫敏型水稻)僅擴增出一條463bp的譜帶。依據標記SJ001在水稻溫敏核不育系和恢復系(或具恢復能力的雜交親本)中的擴增差異，實現溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102505013SQ201110326770
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權日2011年10月25日
發(fā)明者倪大虎, 倪金龍, 宋豐順, 張小娟, 李莉, 楊亞春, 楊劍波, 汪秀峰, 陸徐忠, 馬卉, 馬琳 申請人:安徽省農業(yè)科學院水稻研究所