專利名稱：雙標記核酸恒溫擴增方法及檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增方法及試紙條，特別是涉及一種雙標記核酸擴增方法及其快速檢測試紙條。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代分子生物學和分子技術(shù)的發(fā)展，研究開發(fā)了許多核酸擴增技術(shù)。其中核酸環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，由于其具有特異性強、靈敏度高、反應速度快等特點，在核酸特異性擴增和檢測領(lǐng)域具有取代PCR的趨勢，成為生命科學領(lǐng)域研究的熱點之一。核酸環(huán)介導擴增的主要原理是基于對靶序列的6 個區(qū)域設(shè)計2對特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在65°C左右的恒溫條件下保溫約60分鐘，完成核酸擴增反應，在存在環(huán)引物的情況下，擴增時間可進一步縮短為40分鐘。用于LAMP擴增的3對引物對應于靶基因的8個區(qū)段，因而具有比 PCR更高的特異性，同時具備不需要熱循環(huán)、擴增效率更高、不需要特殊儀器等優(yōu)點。目前LAMP產(chǎn)物的檢測經(jīng)常采用電泳法和濁度法，需要用高致癌性的熒光染料溴化乙錠，不僅危害操作人員的健康，而且無法排除假陽性的問題，限制了 LAMP技術(shù)的推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種特異性強、靈敏度高、 速度快的雙標記核酸恒溫擴增方法；
還提供了一種用雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物得到的簡易檢測試紙條，該試紙條可廣泛用于各種致病性微生物或病原體中特異性基因的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種雙標記核酸恒溫擴增方法，根據(jù)檢測目標設(shè)計LAMP引物，進行內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物的合成；用生物素和熒光素分別標記兩種內(nèi)引物，或分別標記兩種環(huán)引物，或分別標記一種內(nèi)引物和一種環(huán)引物，將標記引物加入LAMP反應體系中恒溫擴增，得到雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物。所述標記是標記內(nèi)引物各引物的5’端；所述熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。所述恒溫擴增是在59-65°C溫度下、恒溫擴增5-20min。一種含有雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物的檢測試紙條，含有支撐層、吸附層，支撐層為不吸水薄片條，吸附層粘貼于支撐層上，所述吸附層從測試端依次為測試端纖維層、纖維素膜層和手柄端吸水材料層，所述纖維素膜層含有權(quán)利要求1所述的雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物，用生物素親和蛋白及熒光素抗體分別在纖維素膜層上印制檢測印跡和對照印跡，或用生物素親和蛋白及熒光素金標抗體分別在纖維素膜層上印制檢測印跡和對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行排列為“Il ”。
所述不吸水薄片條為硬質(zhì)塑料片條或不吸水硬紙片條，所述纖維素膜層是用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，所述手柄端吸水材料層是用吸水紙制成，所述測試端纖維層是用玻璃棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。所述熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。

所述測試端吸附纖維層、吸水材料層上均覆蓋有保護膜，在測試端纖維層的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線距離測試端0. 5cm。所述的檢測試紙條在檢測各種致病性微生物或病原體的特異性基因中的應用。本發(fā)明的積極有益效果
1 ·本發(fā)明的雙標記核酸恒溫擴增方法具有下列優(yōu)點
(1)特異性強，用于LAMP擴增的3對或2對引物分別對應于靶基因的8個或6個區(qū)段， 理論上可以檢測出一個堿基差異的序列，因而具有比PCR更高的特異性；
(2)靈敏度高，LAMP能在模板DNA純度很低的情況下進行擴增，很少受培養(yǎng)介質(zhì)和生物學物質(zhì)的影響，純化步驟可以忽略；
(3)速度快，LAMP是恒溫擴增反應，沒有PCR反應中溫度變化的耗時，在30 60min內(nèi)即可完成反應過程，10 min內(nèi)即可完成擴增反應，結(jié)合本發(fā)明中試紙條檢測手段，試紙檢測可在5min內(nèi)完成，加上前處理過程，可在1小時左右完成對樣品的檢測；
(4)易推廣，LAMP反應是一個恒溫擴增過程，不用控制溫度變化，只需簡單的恒溫器，也不需要昂貴的PCR儀，對操作人員的分子生物學技術(shù)要求不高。2 .本發(fā)明的檢測試紙條可廣泛用于各種致病性微生物或病原體中特異性基因的檢測，具體包括
可用于人致病性病原體的檢測，包括牙齦卟啉單胞菌(/^r/^j^roMwas gingival is, Tannerella forsythia, Tf) > ^IjJ W JiE Φ (Treponema den ticola, Td )、糞腸球 i、Enterococcus faecal is),伴放線放線桿 iUctinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)、變形鏈球 Iif {.Streptococcus mutans、、遠緣鏈球菌 {Streptococcus sobrinus)^ i^tX^tX^tf 1MiAggregatibacter ( Actinobacillus) ac tinomyce temcomi tans )、直腸彎曲菌(Campylobac ter rec tus )、卩齒 t蟲艾肯菌(.Eikenella corrodens),具核梭桿 Iif iFusobacterium nucleatum)、角軍月干素普氏 Iif {Prevotella intermedia、禾口嗜沫嗜血桿鬼(Aggregatibacter ac tinomyce temcomi tans) > /[叚結(jié)核耳口爾森氏 lif (Yersinia pseudotuberculosis、、由結(jié)核分枝桿嵐(Mycobacteria tuberculosis )> 牛分枝桿鬼(Mycobacterium bovis、、^ 汐分枝桿據(jù)(Mycobacterium africanum )和田鼠分枝桿菌Qfycobac terium micro ti )組成的結(jié)核分枝桿菌復合群 (Mycobacterium tuberculosis complex)、鳥結(jié)核分枝桿菌辦aci6 ria aFia )、胞內(nèi) 木干 lif iMycobac teriumin tracel IulareiMycobac teriumkansasii )、
戈登分支桿 lif iMycobacteriumgastri )> 軍團菌 M (.Legionella species)、志賀氏菌(^Shigella)、侵襲生大腸桿菌(enteroinvasive Escherichia coli )> 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)禾口大腸桿菌普通株(common strains of Escherichia co/i )、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、父艮難梭菌 {Clostridium difficile, C. d)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、銅綠假單胞菌 QPseudomonas aeruginosa ) > 幽 Π 螺旋桿菌(Jielicobacter pylori, H. pylori 或Hp) (Minami et al, 2006)、流感嗜血桿菌(泡讀似i/ /7此瀏e)和副流感嗜血桿菌 {Haemophilus parainfIuenzae)、產(chǎn) vero 毒素大腸桿菌(toxin-producing Escherichia coH )λ 甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)禾口產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌(enterotoxigenic Staphylococcus aureus )、 產(chǎn)毒素霍舌L 弧菌(cholera toxin-producing Vibrio choIerae)^ 豚鼠氣單胞菌 {Aeromonas ⑵Kiaa)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌pseudomallei),^M^ ft V^iCampylobacter j^/^/ i)、結(jié)腸彎曲桿菌(C^^j^^acter coli)和胎兒彎曲桿菌 ^Campylobacter /fetos)、沙門氏菌09)、布魯氏菌⑶Ba spp)、創(chuàng)傷弧菌ra7/ i/i^As)、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)、人類皰疹病毒 6 型(human herpesvirus)、急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus)^7jC|t _(varicella-zoster virus, VZV)、i^g_
毒 A 型(human influenza A viruses)禾口流感病毒 B 型(human influenza B viruses)、 聴腺炎病毒(mumps virus)、登革熱病毒(dengue virus)、麻疫病毒(measles virus)、 人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)、流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、細胞巨化病毒(cytomegalovirus)、諾如病毒 (norovirus, NV)、風疫病毒(rubella virus)、基孑L肯雅病毒(Chikungunya virus)、腺病毒(adenovirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型肝炎病毒(!fepatitis A Virus, HAV)^ 乙型肝炎病毒(itepatitis B Virus, HBV)、人細小病毒 B19 型(human parvovirus B19)、 愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)、猴痘病毒(Monkeypox Virus)、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeciency virus type 1，HIV-1 )、獸棚病毒(flock house virus, FHV)和導致腎移植患者發(fā)生多瘤病的病毒(BK virus)、非洲錐體蟲U/rim/ trypanosomes )、布氏閃 t 匕亞錐蟲(Trypanosoma brucei gambiense )、布氏羅得西亞錐 (Trypanosoma brucei rhodesiense )^ 惡性癥原蟲{Plasmodium falciparum ) Λ 月市抱子蟲{Pneumocystis pneumonia)、恙蟲東方體tsutsugamushi)Λ 岡Ij地弓形蟲 (Toxoplasma gondii )等 0 可用于魚貝類致病性病原體的檢測，包括對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、矛兆拉綜合征病毒(Taura syndrome virus)禾口斑節(jié)對蟲下的黃頭病毒(Yellow head virus)、魚虹彩病毒(fish iridovirus)、新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGVO、太養(yǎng)贊 iScophthalmus maximus)紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRBIV)、傳染性造血器官壞死癥病毒 (infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)、錦鯉皰疫病毒(Koi herpesvirus, KHV)、皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)λ 羅氏沼蟲下諾達病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirusj MrNV)、 小病毒顆粒(extravsmall virus, XSV)、錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)、鯉春血癥病毒(spring viraemia of carp virus, SVCV)、諾如病毒(norovirus)、遲純愛德華氏廣QEdwardsiel la te fe)、叉尾鮰愛德華菌(^/^ feidh icteA/ri)、柱狀黃桿胃(Fla vobac terium co Iumnare )、 若 + 氏胃{Nocardia seriolae )、· & 氏耳口氏 M (Yersinia ruckeri ) Λ 鮭魚腎桿菌{Renibac terium salmoninarum ) Λ 漂美人弧菌 (Vibrio nigripulchri tudo )、微抱子蟲(Microsporidia )、粘抱子蟲(Tfe tracapsuloidesbryosalmonae )禾口腦豐占體蟲(i^o 辦 cerebral is )等?？捎糜谵r(nóng)牧養(yǎng)殖業(yè)中病原體的檢測，包括豬水泡病病毒(Swine Vesicular Disease Virus, SVDV)、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus type 2， PCV2)、豬瘟(classical swine fever virus, CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)> 豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)> If#(Newcastle disease virus, NDV)> H5N1 # ^ 毒(H5N1 avian influenza virus)、H9 禽流感病毒(H9 avian influenza virus)、 ￥-1 iS # (duck plagues virus, DPV) ^ ^ # (Canine Distemper Virus)、* 細小病毒(canine parvovirus)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus, BLV)羊傳染性膿皰病毒(orf virus)、錐體蟲(trypanosomes)、犬吉氏巴貝斯蟲〔Babesia gibsoni )、馬 泰勒蟲(Theileria equi )、駑巴貝斯蟲、Babesia cabalIi )、環(huán)形泰勒焦蟲(Theileria annul a ia )、呂氏泰勒蟲(Theileria Iuwenshuni，UTRlu8 )、尤氏泰勒蟲 (Theileria uilenbergi, UTRu6)、牛 EL貝西蟲屬寄生蟲(bovine Babesia parasites)、 隱孢子 ^^Cryptosporidium)、絳蟲(Taenia)、畐Ij 結(jié)核分枝桿 MQfycobacterium para tuberculosis )、^im^MMW (.Lep tospira )等?？捎糜谥参锊≡次⑸锏臋z測，包括番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)、病毒馬鈴薯病毒Y型(Potato virus Y, PVY)、李樹和桃樹的李痘病毒(Plum pox virus, PPV)、柑橘青果病細菌(Citrus Greening Organism)、柑橘黃龍病病原類細菌(Liberibacter Species Associated with Citrus Huanglongbing)、^H禾斗雷爾氏菌solanacearum)> ^tM ^Ral s tonia so lanacearum)iPhytophthora ramorum)等?？捎糜谑称分胁≡次⑸锏臋z測，包括沙門氏菌(Salmone 1 Ia)、副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus ) > 賭狀芽抱桿 {Bacillus cereus ) > 倉ij 傷弧 lif ( Vibrio vulnificus、、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(/ersiflia enterocolitica),彎曲桿菌屬 ^Campylobacter spp.)金黃色葡萄球菌{Staphylococcus aureus ) > 單 ±曾李其jf 特菌 {.Listeria monocytogenes)>ΕξIif (Shigella. Spp)禾口大腸桿菌 0157:H7 {Escherichia coli O157:H7)等。3.本發(fā)明的試紙條使用時檢測結(jié)果形象、直觀、準確，試紙條同時顯示綠色熒光檢測印跡“丨”和對照印跡“丨”，或顯示紅色檢測印跡“I ”和對照印跡“I ”，則檢測結(jié)果為陽性， 表示樣品中含有待檢物質(zhì)；若只顯示綠色熒光或紅色對照印跡“丨”，則檢測結(jié)果為陰性，表示樣品中不含待檢物質(zhì)。即在纖維素膜上檢測線位置顯示一條綠色或紅色檢測印跡“I”，表示待檢樣品中含有特異性核酸片段。結(jié)果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性的誤判。4.本發(fā)明的檢測試紙條，既能直觀檢測LAMP擴增產(chǎn)物，又能克服膠體金檢測試紙?zhí)禺愋韵鄬^低的缺點，廣泛適用于專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、基層衛(wèi)生醫(yī)療部門、食品質(zhì)量監(jiān)督部門和食品企業(yè)等各層次的需求，具有較好的市場前景和經(jīng)濟效益。


圖1 本發(fā)明的雙標記核酸恒溫擴增檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 本發(fā)明的雙標記核酸恒溫擴增檢測試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為支撐 層，2為測試端纖維層，3為纖維素膜層，4為手柄端吸水材料層，5為檢測印跡，6為對照印跡，7為測試端纖維層的保護膜，8為手柄端吸水材料層的保護膜，9為樣品標記線。
具體實施例方式本發(fā)明的雙標記核酸恒溫擴增及簡易檢測試紙條可廣泛用于各種致病性微生物或病原體中特異性基因的檢測，下面舉例說明。實施例1 食品中志賀氏菌(Migella )特異性基因的擴增方法及檢測試紙條 1.食品中志賀氏菌特異性基因i/^//的擴增方法
(1)引物設(shè)計及標記
通過查閱文獻和用BLAST軟件分析篩選出志賀氏菌特異性基因ipaH的232 — 437位核酸序列，針對該片段的八個位點(這八個位點分別是233 - 254bp、256 — 273 bp,275 一 294 bp,302 一 323bp、341 — 362bp、363 — 382bp、386 — 405bp 和 420 — 438bp)設(shè)計出 LAMP弓丨物并合成，引物設(shè)計通過LAMP專用引物設(shè)計軟件完成，得到如下引物 正向外引物 F3-ipaH 5，-CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3， 反向外引物 B3-ipaH 5，-GAGGCGGAACATTTCCCTG-3， 正向內(nèi)引物
FIP-ipaH 5' -TCCTCACAGCTCTCAGTGGCATTTTTCTGCGGAGCTTCGACAG-3’ 反向內(nèi)引物
BIP-ipaH 5' -ATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTTTTTAGCGCCGGTATCATTATCGA-3' 正向環(huán)引物 LF-ipaH 5，-AGCAGCAACAGCGAAAGACT-3， 反向環(huán)引物 LB-ipaH 5，-CCATCAGGCATCAGAAGGCC-3，。將生物素和異硫氰酸熒光素分別標記正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP的5’端。(2)反應體系(反應總體積為25μ1)見下表。__
權(quán)利要求
1.一種雙標記核酸恒溫擴增方法，其特征在于根據(jù)檢測目標設(shè)計LAMP引物，進行內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物的合成；用生物素和熒光素分別標記兩種內(nèi)引物，或分別標記兩種環(huán)引物，或分別標記一種內(nèi)引物和一種環(huán)引物，將標記引物加入LAMP反應體系中恒溫擴增， 得到雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，其特征在于所述標記是標記內(nèi)引物各引物的5’端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，其特征在于所述熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的擴增方法，其特征在于所述恒溫擴增是在59-65°C 溫度下、恒溫擴增5-20min。
5.一種含有雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物的檢測試紙條，含有支撐層、吸附層，支撐層為不吸水薄片條，吸附層粘貼于支撐層上，所述吸附層從測試端依次為測試端纖維層、纖維素膜層和手柄端吸水材料層，其特征在于所述纖維素膜層含有權(quán)利要求1所述的雙標記核酸恒溫擴增產(chǎn)物，用生物素親和蛋白及熒光素抗體分別在纖維素膜層上印制檢測印跡和對照印跡，或用生物素親和蛋白及熒光素金標抗體分別在纖維素膜層上印制檢測印跡和對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行排列為“ 丨丨”。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試紙條，其特征在于所述不吸水薄片條為硬質(zhì)塑料片條或不吸水硬紙片條，所述纖維素膜層是用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，所述手柄端吸水材料層是用吸水紙制成，所述測試端纖維層是用玻璃棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試紙條，其特征在于所述熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的檢測試紙條，其特征在于所述測試端吸附纖維層、 吸水材料層上均覆蓋有保護膜，在測試端纖維層的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線距離測試端0. 5cm。
9.權(quán)利要求5所述的檢測試紙條在檢測各種致病性微生物或病原體的特異性基因中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種雙標記核酸恒溫擴增方法及試紙條，該方法通過先合成內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，用生物素和熒光素標記內(nèi)引物或/和環(huán)引物，將標記引物加入LAMP反應體系中恒溫擴增，得到雙標記的核酸恒溫擴增產(chǎn)物。試紙條包括支撐層、核酸擴增產(chǎn)物吸附層，核酸擴增產(chǎn)物吸附層粘貼于支撐層上，以生物素親和蛋白及異硫氰酸熒光素抗體分別在纖維素層上印制檢測印跡和對照印跡。本發(fā)明的試紙條檢測特異性強、靈敏度高、速度快，既能直觀檢測LAMP擴增產(chǎn)物，又能克服膠體金檢測試紙?zhí)禺愋韵鄬^低的缺點，可廣泛用于各種致病性微生物或病原體中特異性基因的檢測。
文檔編號C12Q1/70GK102329790SQ20111029331
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者張改平, 李學伍, 王德國, 趙東, 鄧瑞廣, 邢廣旭, 郭軍慶 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學院