專利名稱：抑制血管生成相關(guān)基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域，是關(guān)于抑制血管生成活性相關(guān)的基因序列。
背景技術(shù)：
正常成年人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖處于靜止?fàn)顟B(tài)，沒有新的血管生成。但是，在某些病理情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖處于靜止的狀態(tài)被打破則血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新的血管生成。至今尚沒有有效的抑制血管新生的化學(xué)藥物。血管生成抑制因子是一類特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的藥物，不產(chǎn)生抗藥性和毒性。研究血管生成抑制因子治療血管新生是當(dāng)前的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制血管生成的新的基因序列。是通過DNA序列合成方法合成一段DNA序列，將這段DNA序列重組于畢赤酵母中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物活性分析證明具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制新的血管生成的活性。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)措施實現(xiàn)1. DNA序列的合成。設(shè)計如下DNA序列，并用套疊PCR方法進(jìn)行其序列合成。將其序列命名為scl。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC CAAGAAGGT TCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACA TCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACA CACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT CATCATCATCATCATTAG2. DNA序列編碼蛋白功能的證明(I)DNA序列重組于酵母中表達(dá)通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K的多克隆位點，將其表達(dá)載體命名為pPIC9K-scl (附圖1)。用電轉(zhuǎn)法將pPIC9K-scl轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得工程菌GS115(pPIC9K-scl)。用BMGY-BMMY發(fā)酵 GS115(pPICP9K-scl)誘導(dǎo)表達(dá) Scl 蛋白。(2)表達(dá)產(chǎn)物活性分析發(fā)酵液上清過Ni-Agar0se His標(biāo)簽蛋白純化柱進(jìn)行純化(附圖2)，收獲的含目標(biāo)蛋白的液體經(jīng)過抽濾除鹽后，進(jìn)行抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗。結(jié)果是Scl蛋白誘發(fā)人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(附圖3)，抑制雞胚絨毛尿囊新生血管生成，其對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用強(qiáng)于Angiostatin(附圖4)。這些結(jié)果表明scl基因編碼的蛋白具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制新生血管生成的活性， scl是抑制血管生成相關(guān)基因序列。
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本發(fā)明的優(yōu)點血管生成抑制因子在治療血管增生性疾病中有著重要的用途。雖然已發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子有多種，但是本發(fā)明的血管生成抑制因子基因序列小，分子量小的藥物有利于在機(jī)體內(nèi)的傳輸，并且蛋白抑制血管生成的作用較強(qiáng)。


附圖1.構(gòu)建含scl基因的畢赤酵母表達(dá)載體附圖2.純化重組蛋白M.蛋白Marker ；2.純化的重組Scl蛋白。附圖3. Scl蛋白誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡試驗a. PBS b. Scl附圖4. Scl蛋白抑制雞胚絨毛尿囊膜新血管生成試驗a. PBS ；b. Scl ；c. Angiostatin
具體實施例方式1. DNA序列的合成。(1)設(shè)計如下DNA序列。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC CAAGAAGGT TCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACA TCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACA CACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT CATCATCATCATCATTAG(2)合成如下引物pi.5’ ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC3，ρ2·5 ’ TTCTTGCCCTTGTAGTTGAAGATGACATGAACCTTCTTGGTGCCAGGGCCACAGATGTC3，ρ3·5’ TTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGA3，ρ4·5’ TGGTTGTCTGGCCGCACAATCAGTGTAAGGTGTGTAAACTCATCATCCTTGCAACGGAΤ3，p5. CTAATGATGATGATGATGATGGTTGTCTGGCCGCACAA3，(3)用如下套疊PCR法進(jìn)行以上序列的合成，其步驟是①應(yīng)用Pl和ρ2引物進(jìn)行PCR，獲得產(chǎn)物1。②用Ρ3和ρ4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物2。③以上獲得的產(chǎn)物1和產(chǎn)物2的混合物為底物，用引物Pl和ρ5進(jìn)行擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物3
(4)將以上PCR產(chǎn)物3連接于T載體，進(jìn)行DNA序列分析證明所獲的DNA序列與設(shè)計的一致ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC CAAGAAGGT TCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACA TCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACA CACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT CATCATCATCATCATTAG2.序列編碼蛋白功能的證明(I)DNA序列重組于酵母中表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化通過DNA內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K的多克隆位點，將其表達(dá)載體命名為pPPIC9K-scl (附圖1)。用電轉(zhuǎn)法將 pPIC9K-scl轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，獲得工程菌GSl 15 (pPIC9K_scl)。用BMGY-BMMY培養(yǎng)基發(fā)酵GS115(pIPIC9K-scl)誘導(dǎo)表達(dá)Scl蛋白。將發(fā)酵液上清過Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱，獲得符合標(biāo)準(zhǔn)分子量的目標(biāo)蛋白(附圖2)。(2)表達(dá)產(chǎn)物活性分析將以上收獲的含目標(biāo)蛋白的液體經(jīng)過抽濾除鹽后，抑制人臍帶靜脈細(xì)胞增殖試驗和抑制雞胚絨毛血管生成試驗。結(jié)果表達(dá)Sc 1蛋白誘發(fā)人血管內(nèi)皮凋亡(附圖幻，抑制雞胚絨毛尿囊新生血管生成，其對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用強(qiáng)于Angiostatin(附圖4)。這些結(jié)果表明scl基因編碼的蛋白具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制新生血管生成的活性，scl是抑制血管生成相關(guān)基因序列。
權(quán)利要求
1.一種抑制血管生成相關(guān)蛋白的基因序列，其特征在于具有如下核苷酸序列 ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC CAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACA TCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACC TTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT CATCATCATCATCATTAG
2.一種抑制血管生成相關(guān)蛋白的基因序列，其特征在于其基因序列所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn lie Met Phe Gly Pro Asp lie Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His Val lie Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu lie Asn Lys Asp lie Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Thr Leu lie Val Arg Pro Asp Asn His His His His His His
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制血管生成相關(guān)蛋白的基因序列和權(quán)利要求2所述的抑制血管生成相關(guān)蛋白的基因序列所編碼的氨基酸序列，其特征在于利用所述的基因編碼的蛋白質(zhì)制備治療血管增生的醫(yī)藥制品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制血管生成活性相關(guān)蛋白的基因序列。是通過套疊PCR方法人工合成的DNA序列。本發(fā)明可以通過將這一基因進(jìn)行重組表達(dá)生產(chǎn)蛋白，將純化的蛋白作為治療血管異常增生的藥物。
文檔編號C12N15/12GK102409056SQ20111027064
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者張澤華, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 沈錦城, 羅進(jìn)賢 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 海南金寶正誠礦業(yè)有限公司