專利名稱：一種檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒，具體涉及一種利用基因測序技術(shù)檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒，屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是世界范圍內(nèi)最嚴重的健康問題之一，全球有約20億人感染乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)，其中3. 5億人呈慢性感染狀態(tài)，中國約有1. 2億HBV感染者，乙型肝炎感染是導(dǎo)致肝纖維化、肝衰竭和肝癌的主要原因。病毒產(chǎn)生耐藥性是長期困擾乙型肝炎治療的一大難題，HBV耐藥會導(dǎo)致嚴重的臨床后果，臨床治療時需要對HBV耐藥性進行密切監(jiān)測。目前，我國SFDA批準的一線抗乙肝藥物(核苷類似物)，如拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)都存在不同程度的耐藥情況。HBV發(fā)生耐藥突變后，一方面使療效降低甚至無效；另一方面會增加患者不必要的經(jīng)濟負擔、造成醫(yī)療資源的浪費和流行病學危害。因此，通過基因變異檢測來快速判斷患者耐藥與否及對哪種藥物耐藥，是指導(dǎo)醫(yī)生用藥，實現(xiàn)個體化醫(yī)療的前提和依據(jù)。國內(nèi)外均有大量文獻報道了 HBV核苷類似物的耐藥變異LAM長期治療慢性乙肝患者的研究結(jié)果顯示，YMDD耐藥突變的患者的Child-Pugh評分顯著高于未發(fā)生YMDD突變的患者，肝病進展程度加劇。HBV逆轉(zhuǎn)錄酶YMDD區(qū)域的rtM204V (YVDD)或rtM204I (YIDD) 變異可直接導(dǎo)致對LAM強耐藥。出現(xiàn)拉米夫定耐藥時需改變治療方案，選用ADV繼續(xù)治療。 與ADV相關(guān)的兩個主要耐藥突變?yōu)閞tA181V和rtN236T，它們與LAM的YMDD突變位點沒有重疊，無交叉耐藥性。HBV對LdT的耐藥發(fā)生率雖然低于LAM，但在長期治療中也不容忽視，并且在HBeiVg陽性的患者中發(fā)生率更高。在YMDD變異的基礎(chǔ)上，rtI169T、rtT184A/G/ I/S、rtS202G/I及rtM250V等進一步變異可形成HBV對ETV的耐藥性。以上4種核苷類似物抗病毒藥物的耐藥位點均在大量臨床實踐中得以證實，檢測這些耐藥變異能幫助醫(yī)生了解患者已發(fā)生對哪種藥物的耐藥，及時換藥或聯(lián)合用藥，提高治療效果。目前可用于HBV耐藥突變檢測的方法有探針雜交法、基因芯片法、質(zhì)譜法、基因測序法等。探針雜交法假陽性率較高；基因芯片法成本高、制備方法繁瑣；質(zhì)譜法難以在普通醫(yī)療機構(gòu)開展；而基因測序法敏感性和特異性均高，操作相對簡便，可高通量完成臨床樣品檢測。目前尚無文獻報道利用基因測序技術(shù)進行HBV全基因序列分析耐藥突變檢測的試齊U盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒。本發(fā)明利用基因測序技術(shù)，先設(shè)計了 HBV DNA Pol基因RT區(qū)擴增引物HBV DNA Pol 基因上游引物序列為5，-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3， HBV DNA Pol 基因下游引物序列為5，-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3， 本發(fā)明提供的利用基因測序技術(shù)檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒，包括HBV DNA Pol基因區(qū)域擴增引物、HBV DNA提取試劑、陰性對照和陽性對照、PCR反應(yīng)液和PCR測序試劑，其中，
HBV DNA Pol基因上游引物序列為 5，-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3，(SEQ ID No. 1) HBV DNA Pol基因下游引物序列為 5’-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3，(SEQ ID No. 2)
其中 HBV DNA提取試劑為pH 8. O 的 10mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA、0. 5%(g/ml) 十二燒基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 150μ g/ml 蛋白酶 K。其中陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有已知型別的HBV樣品為陽性對照。其中的PCR反應(yīng)液包括10XPCR混合液、0. 25 pmol/μ L的引物、2. 5-4. O mM的 MgCl2,2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP，取 Γ2 μ 1 的模板。其中PCR測序反應(yīng)液包括4 μ L測序緩沖液，1 μ L DNA模板，1 μ L測序引物。用本發(fā)明的試劑盒檢測臨床待檢者核苷類似物耐藥突變基因，檢測方法如下首先使用DNA提取試劑得到乙型肝炎病毒DNA，利用合成的PCR引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物直接采用凝膠回收試劑盒進行快速凝膠回收，取回收DNA做測序反應(yīng)，結(jié)束后采用醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物，電泳前測序PCR產(chǎn)物在PCR儀上進行熱變性，冰中驟冷，即可上基因測序儀測序。將HBV DNA測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行序列比對，查找逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的202、204、173、180、181、169、236、184、202、250位點基因變異情況。同時，本試劑盒還可以發(fā)現(xiàn)未知的突變，為臨床探討新的突變位點與藥物耐藥之間關(guān)系的研究提供有效工具。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點和有益效果如下
(1)敏感基因測序技術(shù)是綜合了 PCR技術(shù)、熒光標記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測靈敏度很高。(2)特異使用特異性標記的熒光素對定量分子進行識別，具有很高的準確性，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。(4)快速速度快、高通量，可在12 14小時完成。


圖1標準HBV DNA核酸序列分析結(jié)果-M為標準HBV DNA測序結(jié)果，B為標準HBV DNA序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中標準HBV DNA核酸序列比對結(jié)果，Ref代表標準HBV DNA編碼氨基酸，Pat為提交序列核苷酸及編碼氨基酸。圖2患者HBV DNA核酸序列分析結(jié)果A為患者HBV DNA測序結(jié)果，紅色箭頭所示為突變的堿基，B為患者HBV DNA序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中標準HBV DNA核酸序列比對結(jié)果，紅色方框表示與標準序列比較發(fā)生突變的氨基酸形式，Ref代表標準HBV DNA編碼氨
4基酸，Pat為提交序列核苷酸及編碼氨基酸。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。實施例1本發(fā)明試劑盒的制備本發(fā)明試劑盒組成如下
(1)HBVDNA 提取試齊[J:10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 5mmol/L EDTA, 0. 5%SDS, 150μ g/ml蛋白酶K
(2)引物
HBV DNA Pol 基因上游引物序列為5，-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3， HBV DNA Pol 基因下游引物序列為5，-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3， 上述引物序列由上海Life Technology公司合成。(3)陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有HBV DNA樣品為陽性對照。(4) PCR 反應(yīng)液10 XPCR Premix(混合液)、0· 25 pmol/μ L 的引物、2. 5-4. 0 mM 的 MgCl2,2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP、通常取 1 2 μ L 的模板。(5斤0 擴增程序的設(shè)定在4819700儀器上通常是先951 5 min，然后95°C 30 s，58°C 60 s，72°C 1 min，循環(huán) 40 次，最后 72°C 10 min。(6)2% (g/ml)瓊脂糖凝膠電泳后切取PCR產(chǎn)物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA片段。(7)測序反應(yīng)液4 μ L測序Buffer，1 μ L DNA模板，1 μ L測序引物測序反應(yīng)程序的設(shè)定在ΑΒΙ9700儀器上通常先98°C變性2 min，然后進行PCR循環(huán)，
PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10 s,50°C 5 s,60°C 4 min，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4°C保溫； 采用醋酸鈉/乙醇法純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，上ABI3130測序儀進行測序。實施例2用實施例1制備的試劑盒檢測HBV核苷類似物耐藥基因變異以檢測20例乙型肝炎患者外周血樣品中HBV核苷類似物耐藥基因變異。檢測流程
首先根據(jù)HBV核酸數(shù)據(jù)庫提供的HBV RT區(qū)基因序列設(shè)計特異性引物。獲取臨床乙型肝炎患者外周血樣品，快速提取HBV DNA ；配置PCR反應(yīng)液進行PCR擴增，然后回收PCR擴增產(chǎn)物，進行測序反應(yīng)，將測序反應(yīng)產(chǎn)物純化后進行測序，最后在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行核酸序列比對，查找逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的202,204,173、180、181、169、236、184、202、250的基因變
已具體步驟如下
(1)血清HBV DNA的抽提按DNA抽提純化的方法抽提乙型肝炎患者和含有標準HBV菌株的人外周血中HBV DNA。(2) PCR擴增:卩0 反應(yīng)體系為20口 1 含 2X premix 10.0 μ L，引物濃度0.2 mmol/ L，超純水補齊。在ABI9700PCR儀上反應(yīng)擴增條件95°C 5 min，然后95°C 30 s，58°C 60 s，72°C 1 min，循環(huán) 40 次，最后 72°C 10 min。
(3)2% (g/ml)瓊脂糖凝膠電泳后切取PCR產(chǎn)物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA片段。(4)測序反應(yīng)液4 μ L測序Buffer，1 μ L DNA模板，1 μ L測序引物，在ΑΒΙ9700 儀器上先98°C變性2 min，然后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10 s,50°C 5 s，60°C 4 min，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4°C保溫。(5)采用醋酸鈉/乙醇法純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，按照ABI3130測序儀操作說明進行測序。(6)數(shù)據(jù)收集處理和分析將所測得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中HBV DNA標準序列進行比對分析，查找逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的202,204,173、180、181、169、236、184、202、250位基因變異(圖1、圖2)
(7)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒，其特征在于，包括HBV DNA Pol基因區(qū)域擴增引物、HBV DNA提取試劑、陰性對照和陽性對照、PCR反應(yīng)液和PCR測序試劑，其中HBV DNA Pol基因上游引物序列為SEQ ID No. 1所示，HBV DNA Pol基因下游引物序列為SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中HBVDNA提取試劑為pH8. O的 IOmmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA、0. 5% (g/ml)十二烷基磺酸鈉和 150 μ g/ml 蛋白酶 K。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有已知型別的HBV樣品為陽性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中的PCR反應(yīng)液包括10XPCR 混合液、0.25 pmol/μ L 的引物、2. 5 4. O mM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4 mM 的 dNTPs、 0. 3 0. 6 mM dUTPo
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中PCR測序反應(yīng)液包括4μ L 測序緩沖液，1 PL DNA模板，1 μ L測序引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測乙型肝炎病毒耐藥突變的試劑盒，包括HBVDNAPol基因區(qū)域擴增引物、HBVDNA提取試劑、陰性對照和陽性對照、PCR反應(yīng)液和PCR測序試劑，其中HBVDNAPol基因上游引物序列為SEQIDNo.1所示，HBVDNAPol基因下游引物序列為SEQIDNo.2所示。本發(fā)明的試劑盒檢測靈敏度很高，特異性好，速度快，可在12~14小時完成。
文檔編號C12Q1/68GK102286643SQ20111024830
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者李艷, 童永清, 鄭紅云, 顧劍 申請人:李艷, 童永清, 鄭紅云, 顧劍