專(zhuān)利名稱(chēng)：一種降解玉米赤霉烯酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物脫毒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降解玉米赤霉烯酮的方法，即用黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)降解玉米赤霉烯酮。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮Gearalenone，簡(jiǎn)稱(chēng)^N)，是由鐮刀菌屬(Fusarium)的產(chǎn)毒菌，如禾谷鐮刀菌(F. graminearum)和三線(xiàn)鐮刀菌(F. tricinctum)等代謝生產(chǎn)的有毒物質(zhì)，廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥、燕麥、大麥等谷類(lèi)作物以及奶制品中。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系統(tǒng)，可使家畜、家禽和實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥，妊娠期的動(dòng)物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎等危害。而飼料和食品生產(chǎn)中所用的谷物(如玉米、小麥)是玉米赤霉烯酮產(chǎn)生的最好基質(zhì)。2009年奧特奇對(duì)我國(guó)的谷物原料的調(diào)查報(bào)告顯示，玉米赤霉烯酮的檢出率為88. 7 %，最大值達(dá)到7772. 3ppb， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我國(guó)飼料的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，一方面要預(yù)防玉米赤霉烯酮產(chǎn)毒菌感染谷物，另一方面還要探索如何通過(guò)生物學(xué)方法來(lái)降解去除谷物中已有的玉米赤霉烯酮，使這些谷物還可用于其它的領(lǐng)域，產(chǎn)生一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，已有一些利用酵母菌、粉紅黏帚霉及根霉、毛霉的發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)降解玉米赤霉烯酮的研究報(bào)道(Orsolya Molnar, Systematic and Applied Microbi ology, 2004, 27 (6) 661 ~ 671 ；Jan U,Applied and Environmental Microbiology,2007,73(2) :637 642)。 同時(shí)，關(guān)于酶降解玉米赤霉烯酮的報(bào)道也不少，例如螺旋聚孢屬中的Clonostachysrosea 可將玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)化為另一種毒性較低的化合物，而其中起作用的是一種水解酶(Naoko Takahashi Ando, Biochem J. ,2002, Jul y 365(7) :1_6)。但目前尚未見(jiàn)關(guān)于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物降解玉米赤霉烯酮的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物在降解玉米赤霉烯酮(以下簡(jiǎn)稱(chēng) ZEN)中的應(yīng)用。通過(guò)在體外模擬動(dòng)物胃腸道環(huán)境下測(cè)定黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^NS準(zhǔn)品和發(fā)霉玉米中^N的降解效果，確定黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N的降解條件，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)ZEN 生物解毒劑奠定了基礎(chǔ)。申請(qǐng)人:在本發(fā)明利用黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)降解玉米赤霉烯酮。所述的黑曲霉可選用購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，分類(lèi)命名為黑曲霉 (Aspergillus niger)，保藏號(hào)CGMCC 3.316。所述的黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液干粉。黑曲霉的發(fā)酵液干粉對(duì)發(fā)霉谷物中的玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解。本發(fā)明的降解玉米赤霉烯酮的方法，優(yōu)選的黑曲霉發(fā)酵液干粉添加量的重量百分比為0. 2%，在37°C、pH2. O條件下降解1. 5h ；或是發(fā)酵液干粉添加量的重量百分比為 0. 2%，在371、？朋· 5條件下降解3. Oh。
本發(fā)明應(yīng)用黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解，可以有效地降解發(fā)霉谷物中的玉米赤霉烯酮，從而恢復(fù)發(fā)霉谷物的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)本發(fā)明通過(guò)在體外模擬胃腸道環(huán)境下測(cè)定黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)ZEN的降解效果，摸索出黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N的最佳降解條件，為進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)為生物解毒劑，用于谷物和飼料中ZEN的降解提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所應(yīng)用的試劑可以應(yīng)用任一款市售產(chǎn)品，例如玉米赤霉烯酮αΕΝ)的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于sigma公司，ZEN高靈敏度檢測(cè)試劑盒karalenone Veratox購(gòu)自英國(guó)NEOGEN公司。 所用到的緩沖液的配制方法如下1、ρΗ6· 5 的 PBS :KC1 0. 2g KH2P04 :0. 204g Na2HPO4 · 2H20 :1. 442gNaCl :8. 066g 溶解于1000ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為6. 5 ；2、pH2. 0 的 PBS :KC1 0. 2g KH2PO4 :0. 204g Na2HPO4 · 2H20 :1. 442gNaCl :8. 066g 溶解于1000ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為2. 0 ；3、胃蛋白酶溶液液準(zhǔn)確稱(chēng)取胃蛋白酶(1 10000) 1.333g，溶于IOml pH2. 0的 PBS溶液中，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓?、胰蛋白酶溶液液準(zhǔn)確稱(chēng)取胰蛋白酶(1 250) 1.0g，溶于IOml pH6. 5的PBS溶
液中，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙狻Ｏ旅娼Y(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例1 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的制備1、斜面培養(yǎng)在裝有PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%)的試管中接入黑曲霉菌種 CGMCC 3. 316，30°C靜置培養(yǎng) 3 5d。2、孢子懸液的制備將斜面培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子用無(wú)菌水洗下，并稀釋至約IX IO9個(gè)/ml，制成孢子懸浮液。3、一級(jí)種子液制備在500ml搖瓶中加入IOOmlPDY培養(yǎng)基(馬鈴薯20%，葡萄糖2%，酵母膏)， 按照8%的接種量接入孢子懸浮液，25°C，120 150r/min，培養(yǎng)2d。4、固體發(fā)酵按比例稱(chēng)取稻草粉50%，(NH4) 2S04 8%，麩皮42%，再加入約4. 9倍固體物質(zhì)體積的水，充分混勻，滅菌，即制得固體發(fā)酵培養(yǎng)基。按照10%的接種量接種一級(jí)種子液，混勻后，將物料均勻鋪放在培養(yǎng)盒內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)48h。O-IOh時(shí)，維持發(fā)酵溫度為32-38°C，10-38h時(shí)發(fā)酵溫度為37°C，38_48h時(shí)發(fā)酵溫度為32-35°C，4 !發(fā)酵結(jié)束，自然補(bǔ)給氧氣，環(huán)境濕度控制在約60%以上。5、黑曲霉發(fā)酵液干粉制備發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液充分混勻，檢測(cè)酶活，進(jìn)閃蒸干燥塔干燥，進(jìn)口溫度85°C，出口溫度48-50°C，干燥10s，40目粉碎，即得到黑曲霉發(fā)酵液干粉。實(shí)施例2 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N標(biāo)準(zhǔn)品的降解作用1、黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的添加量對(duì)ZEN標(biāo)準(zhǔn)品降解率的影響
根據(jù)食糜在動(dòng)物胃腸中停留時(shí)間，分別測(cè)定在模擬動(dòng)物胃、腸道環(huán)境下黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物添加量對(duì)ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的降解率，確定最佳添加量。1. 1在模擬胃液中黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物添加量對(duì)ZEN降解率的影響在三角瓶中添加滅菌后的pH2. OPBS緩沖液2細(xì)1，加入胃蛋白酶溶液0. 25ml，濃度為 50ppm 的 ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品 0. 25ml，分別加入 0. 05 %, 0. 10 %, 0. 15 %, 0. 2 %, 0. 3 %, 0. 4 % (質(zhì)量比)黑曲霉發(fā)酵液干粉，每組兩個(gè)重復(fù)，370C，震蕩培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，4500r/min離心，上清用漏斗過(guò)濾后收集，作為上清中ZEN待測(cè)液；沉淀中加入25ml的蒸餾水，劇烈震蕩 5min，過(guò)濾收集濾液，作為沉淀解吸附ZEN的待測(cè)液。樣品測(cè)定前于4°C冰箱保存。利用^N 高靈敏度檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清及沉淀中ZEN含量，并計(jì)算黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N的降解率， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。1. 2在模擬腸液中黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物添加量對(duì)ZEN降解率的影響在三角瓶中添加滅菌后的pH6. 5PBS緩沖液2細(xì)1，加入胰蛋白酶溶液0. 25ml，濃度為 50ppm 的 ZEN標(biāo)準(zhǔn)品 0. 25ml，分別加入 0. 05%, 0. 10%, 0. 15% , 0. 2%, 0. 3%, 0. 4% ( M 量比)黑曲霉發(fā)酵液干粉，每組兩個(gè)重復(fù)，37°C，震蕩培養(yǎng)他，培養(yǎng)結(jié)束后的處理如步驟2. 1 中所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表1體外模擬胃環(huán)境下黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物添加量對(duì)ZEN標(biāo)準(zhǔn)品降解率的影響
干粉添加量％0. 050. 10. 150. 20. 30. 4ZEN降解率％6. 28. 913. 319. 118. 318. 8表2體外模擬腸環(huán)境下黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物添加量對(duì)ZEN標(biāo)準(zhǔn)品降解率的影響
干粉添加量％0. 050. 10. 150. 20. 30. 4ZEN降解率％20. 227. 934. 141. 942. 242. 5由表1，表2可以看出，當(dāng)黑曲霉發(fā)酵液干粉添加量低于0.2%時(shí)，隨著添加量的增加，ZEN降解率不斷提高；當(dāng)添加量高于0. 2%時(shí)，隨著添加量的增加，ZEN降解率趨于穩(wěn)定， 所以黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的最適添加量為0. 2%。2、黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的降解時(shí)間對(duì)^N標(biāo)準(zhǔn)品降解率的影響在模擬動(dòng)物胃、腸道環(huán)境下，分別測(cè)定最適添加量的黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物在不同降解時(shí)間時(shí)對(duì)^N的降解率，以確定黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的最佳降解時(shí)間。2. 1在模擬胃液中黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N降解時(shí)間的確定在三角瓶中添加滅菌后的pH2. OPBS緩沖液2細(xì)1，加入胃蛋白酶溶液0. 25ml，濃度為50ppm的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品0.25ml，加入0.2% (質(zhì)量比)的黑曲霉發(fā)酵液干粉，37°C，震蕩培養(yǎng)，分別在15min，30min，45min，60min，90min，120min時(shí)測(cè)定上清及沉淀中的^N含量，每組兩個(gè)重復(fù)，分別計(jì)算黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N的降解率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。2. 2在模擬腸液中黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)^N降解時(shí)間的確定在三角瓶中添加滅菌后的pH6. 5PBS緩沖液2細(xì)1，加入胰蛋白酶溶液0. 25ml，濃度為50ppm的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品0.25ml，加入0.2% (質(zhì)量比)的黑曲霉發(fā)酵液干粉，37°C，震蕩培養(yǎng)，分別在30min，60min，90min，120min，180min，MOmin時(shí)測(cè)定上清及沉淀中的^N含量，
每組兩個(gè)重復(fù)，其他步驟同2. 1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。表3體外模擬胃環(huán)境下黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物降解時(shí)間對(duì)ZEN標(biāo)準(zhǔn)品降解率的影響
權(quán)利要求
1.一種降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，是用黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)降解玉米赤霉烯酮。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物為黑曲霉發(fā)酵液干粉。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉發(fā)酵液干粉對(duì)發(fā)霉谷物中的玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉發(fā)酵液干粉添加量的重量百分比為0. 2%，在371、？!12· 0條件下降解玉米赤霉烯酮1. 5h0
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉發(fā)酵液干粉添加量的重量百分比0. 2%，在371、？朋· 5條件下降解玉米赤霉烯酮3. Oh。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解玉米赤霉烯酮的方法，是用黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)降解發(fā)霉谷物中的玉米赤霉烯酮，其中所述的黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液干粉。本發(fā)明應(yīng)用黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解，可以有效地降解發(fā)霉谷物中的玉米赤霉烯酮，從而恢復(fù)發(fā)霉谷物的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)本發(fā)明通過(guò)在體外模擬胃腸道環(huán)境下測(cè)定黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)ZEN的降解效果，摸索出黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)ZEN的最佳降解條件，為進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)為生物解毒劑，用于谷物和飼料中ZEN的降解提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A23L1/015GK102406098SQ201110233738
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者徐雪梅, 李佩佩, 李慧芳, 馬向東 申請(qǐng)人:濰坊康地恩生物科技有限公司, 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司