專利名稱：一種超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，屬于食品蛋白加工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1956年Harman提出自由基理論，認(rèn)為自由基攻擊生命大分子造成組織細(xì)胞損傷， 是引起機(jī)體衰老、腫瘤和一些其它疾病的根本原因。在食品體系中，過多的自由基存在也會(huì)嚴(yán)重影響體系的穩(wěn)定性，如脂肪氧化使食品在感官特性上不能被人們所接受，另外脂肪氧化產(chǎn)物具有很強(qiáng)生理毒性，危害人體健康。因此，需要抗氧化劑來清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化?；瘜W(xué)合成抗氧化劑如BHA、BHT，雖抗氧化效果良好，但對(duì)人體肝、脾、肺有害，具有蓄積性致癌作用。因此，安全、健康、天然的抗氧化劑受到人們的青睞。蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)長鏈中的肽類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基功效，其抗氧化活性強(qiáng)于蛋白質(zhì)和氨基酸，這類活性肽稱為抗氧化肽。抗氧化肽的制備主要通過酶解法從天然動(dòng)植物蛋白質(zhì)中得到。如Hwang等研究了脫脂和烘烤花生仁水解物的抗氧化活性，證實(shí)花生仁水解物具有良好的抗氧化性能?；ㄉ崛∮椭蟮母碑a(chǎn)品花生餅粕，每年產(chǎn)生300多萬噸，主要用于飼料。而花生餅粕富含蛋白質(zhì)，僅以花生餅粕作為飼料并不能充分利用這種蛋白資源。酶解花生蛋白制備抗氧化肽的研究及其產(chǎn)品開發(fā)不僅可以充分利用花生蛋白資源，而且可以拓展花生精深加工的領(lǐng)域，具有很大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。然而，目前狀況下，傳統(tǒng)的酶解方法存在水解效率低、目標(biāo)產(chǎn)物活性小、水解時(shí)間長以及成本高等問題。因此，急需一種新的酶解方法來替代傳統(tǒng)酶解法。超聲波輔助酶解法是近些年新發(fā)展起來的一種酶解方法。超聲波是一種頻率大于 20kHz的聲波。超聲波在作用過程中，會(huì)產(chǎn)生空化作用、機(jī)械作用、熱效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)。超聲波輔助酶解的作用機(jī)理是超聲波具有空化作用，產(chǎn)生的氣泡經(jīng)擠壓破裂，可以瞬間產(chǎn)生極強(qiáng)的機(jī)械剪切力，使蛋白質(zhì)降解，或者改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，促使其親水基團(tuán)更多地暴露出來， 提高蛋白質(zhì)在水中的溶解度，有利于酶和蛋白質(zhì)底物結(jié)合，最終提高酶解效率。目前，國內(nèi)外采用超聲輔助酶解花生蛋白制備抗氧化肽的研究還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，以本方法所提供的超聲波輔助酶解工藝，可提高酶解過程中肽的釋放量，并使所得花生抗氧化肽的抗氧化活性增強(qiáng)，為花生餅粕蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下步驟
(1)花生餅粕粉中加入石油醚，恒溫浸提除脂，干燥得到脫脂的花生餅粕粉；
(2)脫脂的花生餅粕粉中加入蒸餾水，超聲波溶解得到花生餅粕粉懸浮液；
(3)調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值，加入ViscozymeL (復(fù)合植物水解酶)，超聲波輔助酶解，得到花生餅粕粉Viscozyme L酶解液，滅酶，冷卻到室溫；
(4)調(diào)節(jié)花生餅粕粉Viscozyme L酶解液的pH值，加入蛋白酶，超聲波輔助酶解，滅酶， 冷卻到室溫，得到花生餅粕粉蛋白酶酶解液，離心，冷凍干燥得到花生抗氧化肽。優(yōu)選地，步驟(1)所述的花生餅粕粉與石油醚的質(zhì)量與體積比例為1:10 (g/ml), 恒溫浸提除脂的溫度為50°C，時(shí)間為池，通風(fēng)櫥中干燥，干燥時(shí)間為證；
優(yōu)選地，步驟(2)所述的脫脂的花生餅粕粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比例為1:8 1:15，超聲波功率為300w，超聲波頻率為^kHz、45kHz或100kHz，溫度為45°C，時(shí)間為 IOmin ；
優(yōu)選地，步驟(3)所述的調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值所用的溶液為1. Omol/L的鹽酸溶液，PH值調(diào)節(jié)至4. 2 4. 8，Viscozyme L加入量為8 12FBG/g花生餅粕粉(FBG為 Viscozyme L的酶活單位)，超聲波功率為300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為45°C，時(shí)間為 lOmin，滅酶的水浴溫度為90°C，滅酶時(shí)間為20min ；
優(yōu)選地，步驟(4)所述的調(diào)節(jié)花生餅粕粉Viscozyme L酶解液的pH值所用的溶液為 1. Omol/L的氫氧化鈉，pH值調(diào)節(jié)至8.0 9.0，蛋白酶為Alcalase (堿性蛋白酶)、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的復(fù)合酶，蛋白酶的加入量為 5000U/g花生餅粕粉(U為蛋白酶的酶活單位)，超聲波功率為150 300w，超聲波頻率為 ^kHz,溫度為40 65°C，時(shí)間為10 !35min，滅酶的水浴溫度為100°C，滅酶時(shí)間為15min， 離心條件為20°C，4500r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin。本發(fā)明的有益之處在于利用本發(fā)明方法制備的花生抗氧化肽產(chǎn)品具有較好的體外抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑用于消除機(jī)體內(nèi)多種生理功能障礙，延緩機(jī)體衰老，減少各種老年性疾病發(fā)生；本方法充分利用了花生蛋白資源，為拓展花生精深加工，提高社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益提供了新途徑，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
以1:10 (g/mL)的比例，在花生餅粕粉中加入石油醚，50°C水浴恒溫浸提2h，通風(fēng)櫥中干燥證，得到脫脂的花生餅粕粉；以1:10 (g/mL)的比例，在脫脂的花生餅粕粉中加入蒸餾水，在超聲波功率為300w，超聲波頻率為100kHz，溫度為45°C條件下，超聲波溶解lOmin， 得到花生餅粕粉懸浮液；用濃度為1. 0mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值至 4. 2，加入Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶)10 FBG/g (FBG為Viscozyme L的酶活單位)，在超聲波功率為300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為45°C條件下，超聲波輔助酶解lOmin，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液放入90°C恒溫水浴中，滅酶20min，冷卻到室溫，得到花生餅粕粉 Viscozyme L酶解液；用濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉Viscozyme L酶解液的PH值至8. 5，加入Alcalase (堿性蛋白酶)、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶以3:1:0. 4:0. 6比例混合的復(fù)合酶5000U/g花生餅粕粉(U為蛋白酶的酶活單位)，在超聲波功率為150w，超聲波頻率為^kHz,溫度為60°C條件下，超聲波輔助酶解25min，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液放入100°C恒溫水浴中，滅酶15min，冷卻到室溫，得到花生餅粕粉蛋白酶酶解液，在20°C條件下，以4500r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。該抗氧化肽的抗氧化活性如下清除DPPH自由基的IC5tl值為4. 25mg/mL,清除羥自由基的IC5tl值為1. llmg/mL，清除超氧陰離子自由基的IC5tl值為2. 53mg/mL，鐵還原力的吸光值為0. 5時(shí)所需花生抗氧化肽的濃度為12. 32mg/mL，鉬還原力的吸光值為0. 5時(shí)所需花生抗氧化肽的濃度為9. 91mg/mL，鐵離子螯合力的IC5tl值為3. 68mg/mL，銅離子螯合力的IC50 值為1. 82mg/mL，抑制亞油酸過氧化能力的IC5tl值為2. 79mg/mL抑制脂質(zhì)過氧化能力的IC50 值為 4. 06mg/mL。實(shí)施例2
以1:10 (g/mL)的比例，在花生餅粕粉中加入石油醚，50°C水浴恒溫浸提2h，通風(fēng)櫥中干燥5h，得到脫脂的花生餅粕粉；以1 12. 5 (g/mL)的比例，在脫脂的花生餅粕粉中加入蒸餾水，在超聲波功率為300w，超聲波頻率為45kHz，溫度為45°C條件下，超聲波溶解lOmin， 得到花生餅粕粉懸浮液；用濃度為1. Omol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值至 4. 55，加入Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶)11. 8 FBG/g (FBG為Viscozyme L的酶活單位)， 在超聲波功率為300w，超聲波頻率為28kHz，溫度為45°C條件下，超聲波輔助酶解lOmin，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液放入90°C恒溫水浴中，滅酶20min，冷卻到室溫，得到花生餅粕粉 Viscozyme L酶解液；用濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉Viscozyme L酶解液的PH值至8. 65，加入Alcalase (堿性蛋白酶)、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶以3:1:0. 4:0. 6比例混合的復(fù)合酶5000U/g花生餅粕粉(U為蛋白酶的酶活單位)，在超聲波功率為180w，超聲波頻率為28kHz，溫度為62°C條件下，超聲波輔助酶解27. 5min，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液放入100°C恒溫水浴中，滅酶15min，冷卻到室溫，得到花生餅粕粉蛋白酶酶解液，在20°C條件下，以4500r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。該抗氧化肽的抗氧化活性如下清除DPPH自由基的IC5tl值為3. 76mg/mL，清除羥自由基的IC5tl值為0. 79mg/mL，清除超氧陰離子自由基的IC5tl值為1. 57mg/mL，鐵還原力的吸光值為0. 5時(shí)所需花生抗氧化肽的濃度為8. 84mg/mL，鉬還原力的吸光值為0. 5時(shí)所需花生抗氧化肽的濃度為5. 80mg/mL，鐵離子螯合力的IC5tl值為1. 42mg/mL，銅離子螯合力的 IC5。值為0. 59mg/mL，抑制亞油酸過氧化能力的IC5tl值為1. 88mg/mL抑制脂質(zhì)過氧化能力的 IC50 值為 1. 96mg/mLo實(shí)施例3
以1:10 (g/mL)的比例，在花生餅粕粉中加入石油醚，50°C水浴恒溫浸提2h，通風(fēng)櫥中干燥5h，得到脫脂的花生餅粕粉；以1:14 (g/mL)的比例，在脫脂的花生餅粕粉中加入蒸餾水，在超聲波功率為300w，超聲波頻率為28kHz，溫度為45°C條件下，超聲波溶解lOmin， 得到花生餅粕粉懸浮液；用濃度為1. Omol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值至 4. 35，加入Viscozyme L (復(fù)合植物水解酶)9. 6 FBG/g (FBG為Viscozyme L的酶活單位)， 在超聲波功率為300w，超聲波頻率為28kHz，溫度為45°C條件下，超聲波輔助酶解lOmin，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液放入90°C恒溫水浴中，滅酶20min，冷卻到室溫，得到花生餅粕粉 Viscozyme L酶解液；用濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉Viscozyme L酶解液的PH值至8. 8，加入Alcalase (堿性蛋白酶)、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的復(fù)合酶5000U/g花生餅粕粉(U為蛋白酶的酶活單位)，在超聲波功率為150w，超聲波頻率為28kHz，溫度為58°C條件下，超聲波輔助酶解28min，酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液放入100°C恒溫水浴中，滅酶15min，冷卻到室溫，得到花生餅粕粉蛋白酶酶解液，在20°C條件下，以4500r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。該抗氧化肽的抗氧化活性如下清除DPPH自由基的IC5tl值為2. 96mg/mL,清除羥自由基的IC5tl值為0. 68mg/mL，清除超氧陰離子自由基的IC5tl值為1. 13mg/mL，鐵還原力的吸光值為0. 5時(shí)所需花生抗氧化肽的濃度為5. 6%ig/mL，鉬還原力的吸光值為0. 5時(shí)所需花生抗氧化肽的濃度為2. 77mg/mL，鐵離子螯合力的IC5tl值為0. Mmg/mL，銅離子螯合力的IC50 值為0. 92mg/mL，抑制亞油酸過氧化能力的IC5tl值為1. ^mg/mL抑制脂質(zhì)過氧化能力的IC50 值為 1. 07mg/mL。
權(quán)利要求
1.一種超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于步驟如下(1)花生餅粕粉中加入石油醚，恒溫浸提除脂，干燥得到脫脂的花生餅粕粉；(2)脫脂的花生餅粕粉中加入蒸餾水，超聲波溶解得到花生餅粕粉懸浮液；(3)調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值，加入復(fù)合植物水解酶ViscozymeL，超聲波輔助酶解，得到酶解液，滅酶，冷卻到室溫；(4)調(diào)節(jié)酶解液的pH值，加入蛋白酶，超聲波輔助酶解，滅酶，冷卻到室溫，離心，冷凍干燥得到花生抗氧化肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于步驟(1)所述的花生餅粕粉與石油醚的質(zhì)量與體積比例為1:10 (g/ml)，恒溫浸提除脂的溫度為50°C，時(shí)間為2h，在通風(fēng)櫥中干燥，干燥時(shí)間為5h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于步驟(2)所述的脫脂的花生餅粕粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比例為1:8 1:15，超聲波功率為 300w，超聲波頻率為28kHz、45kHz或IOOkHz，溫度為45°C，時(shí)間為IOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于步驟(3)所述的調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值所用的溶液為1. Omol/L的鹽酸溶液，pH值調(diào)節(jié)至4. 2 4. 8，Viscozyme L加入量為8 12FBG/g花生餅粕粉(FBG為Viscozyme L的酶活單位)，超聲波功率為300w，超聲波頻率為28kHz，溫度為45°C，時(shí)間為lOmin，滅酶的水浴溫度為90°C，滅酶時(shí)間為20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于步驟(4)所述的調(diào)節(jié)花生餅粕粉Viscozyme L酶解液的pH值所用的溶液為1. Omol/L的氫氧化鈉，pH值調(diào)節(jié)至8. O 9.0，蛋白酶為Alcalase (堿性蛋白酶)、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的復(fù)合酶，蛋白酶的加入量為5000U/g花生餅粕粉(U為蛋白酶的酶活單位)，超聲波功率為150 300w，超聲波頻率為28kHz，溫度為40 65°C，時(shí)間為10 35min，滅酶的水浴溫度為100°C，滅酶時(shí)間為15min，離心條件為20°C， 4500r/min 轉(zhuǎn)速離心 lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，包括以下步驟花生餅粕粉中加入石油醚，恒溫浸提除脂，干燥得到脫脂的花生餅粕粉；脫脂的花生餅粕粉中加入蒸餾水，超聲波中溶解，得到花生餅粕粉懸浮液；用鹽酸溶液調(diào)節(jié)花生餅粕粉懸浮液的pH值，加入復(fù)合植物水解酶ViscozymeL，超聲波輔助酶解，得到酶解液，滅酶，冷卻到室溫；用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH值，加入蛋白酶，超聲波輔助酶解，滅酶，冷卻到室溫，離心，冷凍干燥得到花生抗氧化肽。本發(fā)明利用超聲波輔助酶解，可提高酶解過程中肽的釋放量，并使所得花生抗氧化肽的抗氧化活性增強(qiáng)，為花生餅粕蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A23J3/34GK102273543SQ20111023374
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者于麗娜, 孫杰, 張會(huì)翠, 張初署, 朱鳳, 楊慶利, 畢杰 申請(qǐng)人:山東省花生研究所