專利名稱：一種三維細(xì)胞培養(yǎng)支架及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用于三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明以納米磷酸三鈣為初始原料，通過聚甲基丙烯酸甲酯模板合成多孔磷酸鈣支架。將磷酸鈣支架浸入酸性海藻酸鈉溶液中形成磷酸三鈣/海藻酸鈉薄膜的復(fù)合物，最終制備了三維細(xì)胞培養(yǎng)支架。
背景技術(shù)：
二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)是一種制備、觀察細(xì)胞、并于體外研究細(xì)胞與藥物、生物因子和生物材料相互作用的技術(shù)。但是，它與細(xì)胞在體內(nèi)的生長方式并不相仿。在動物體內(nèi)，細(xì)胞是三維(3D)生長并構(gòu)建形成活組織或器官。因此，細(xì)胞三維培養(yǎng)與二維培養(yǎng)相比，更加相似于動物體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境。有報道指出，通過體外的三維細(xì)胞培養(yǎng)，我們可以了解組織在正常和病理的組織條件下的結(jié)構(gòu)-功能。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)支架具有很高的應(yīng)用價值。傳統(tǒng)的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架制備中采用的是有機聚合支架，如明膠-戊二醛，但其受制備工藝限制往往采用特定有機成分，成形機器復(fù)雜或強度低，不便作為產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于克服上述制備工藝的不足，提供一種新型的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架。本發(fā)明的另一個目的是提供所述三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，該制備過程簡便易行。并提供上述三維細(xì)胞培養(yǎng)支架在制備細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的應(yīng)用。用于實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下—方面，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架，其包含多孔磷酸鈣支架和包被于多孔磷酸鈣支架上的海藻酸鈉層，所述多孔磷酸鈣支架設(shè)有均勻分布的微孔。另一方面，本發(fā)明提供上述三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，該制備方法包括以下步驟步驟I :固相磷酸鈣含量為50 55% (重量體積比)的料漿的配制；步驟2 :聚甲基丙烯酸甲酯微球的制備；步驟3 :多孔磷酸鈣支架的制備；步驟4 :將步驟3制備的多孔磷酸鈣支架放入質(zhì)量百分含量為4 7%的海藻酸鈉鹽酸溶液中，真空浸泡l_2h，用超純水反復(fù)洗滌三次，即得。優(yōu)選地，在步驟I中，所述磷酸鈣為納米磷酸鈣。優(yōu)選地，在步驟I中，所述料漿的配制包括以下步驟步驟I. I :納米磷酸三鈣粉末的配制；步驟I. 2 :將納米磷酸三鈣粉末、分散劑及超純水球磨O. 5_2h，即得。優(yōu)選地，所述納米磷酸三鈣粉末的配制包括以下步驟
步驟I. I. I :將硝酸鈣、磷酸氫二胺和尿素溶于超純水中，優(yōu)選地，所述超純水溶液中各原料的濃度為硝酸鈣O. 5-0. 6摩爾/L、磷酸氫二胺O. 4-0. 5摩爾/L和尿素O. 56-0. 6 摩爾 /L ；步驟I. I. 2 :將步驟I. I. I制得的溶液放置于烘箱中，于70_80°C干燥3_7h ；步驟I. I. 3 :將干燥后的物質(zhì)放于馬弗爐中，于700-800°C溫度，煅燒l_2h，得到白色的納米磷酸三鈣粉末。優(yōu)選地，在步驟2中，所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的制備包括以下步驟步驟2. I :用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-6%氫氧化鈉溶液緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次，再用 無水氯化鈣干燥洗滌后的甲基丙烯酸甲酯12-24h，優(yōu)選地，用25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5_6%氫氧化鈉溶液緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次；步驟2. 2 :將堿式碳酸鎂溶于質(zhì)量百分含量為O. 3%的聚乙烯醇溶液中，再加入甲基丙烯酸甲酯溶液、引發(fā)劑、二甲基丙烯酸乙二醇酯，在N2保護下，將反應(yīng)體系至于66-70°C下攪拌5-6h，攪拌速度為240-440r/min，優(yōu)選地，所述堿式碳酸鎂溶液的濃度為O. 0142-0. 015摩爾/L ;優(yōu)選地，所述甲基丙烯酸甲酯溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為I 12.5-1 13，更為優(yōu)選地，所述甲基丙烯酸甲酯溶液的密度為O. 9410g/mL;優(yōu)選地，所述引發(fā)劑為過氧化苯甲酰，所述過氧化苯甲酰的質(zhì)量濃度為0.3% ;優(yōu)選地，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯與聚乙烯醇溶液的體積比為I : 625-1 667，更為優(yōu)選地，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯的密度為I. 0151g/mL。步驟2. 3 :反應(yīng)結(jié)束后，用濾紙過濾粗產(chǎn)物除去殘留溶液，并用超純超純水洗滌5次；步驟2.4 :在60_65°C烘箱中，真空干燥得到直徑為200 300 μ m的聚甲基丙烯酸甲酯微球。優(yōu)選地，在步驟3中，所述多孔磷酸鈣支架的制備包括以下步驟步驟3. I :將亞硫酸鋁、尿素、聚乙烯醇吡咯烷酮溶液超純水中，配制得到納米氧化鋁懸濁液，優(yōu)選地，所述各原料溶于超純水中的濃度分別為亞硫酸鋁O. 05-0. 06摩爾/L、尿素O. 56-0. 6摩爾/L、聚乙烯醇吡咯烷酮6. 5xl0_6摩爾/L ；步驟3. 2 :將聚甲基星稀酸甲酯微球放置于燒杯中，于干燥箱中，于180-200°C下，干燥l-2h ；步驟3. 3 :室溫下，將納米氧化鋁懸濁液緩慢鋪滿聚甲基丙烯酸甲酯微球，于真空干燥箱中干燥，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球支架。步驟3. 4 :將步驟3. 3制得的聚甲基丙烯酸甲酯/支架進行真空處理，注入步驟I中所制備的磷酸三鈣料漿，混合均勻得到料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物。步驟3. 5 :將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中燒結(jié)形成多孔磷酸鈣支架。優(yōu)選地，所述燒結(jié)步驟為依次置于室溫到200°C均勻升溫并燒結(jié)50分鐘，200-400°C均勻升溫并燒結(jié)600分鐘，400-1300°C均勻升溫并燒結(jié)400分鐘，最后1250°C燒結(jié)120分鐘。又一方面，本發(fā)明提供了上述三維細(xì)胞培養(yǎng)支架在制備細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新型的細(xì)胞三維培養(yǎng)支架，其包含多孔磷酸鈣支架和包被于所述多孔磷酸鈣支架上的海藻酸鈉，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的三維培養(yǎng)支架強度高，便于操作和運輸；并且制備工藝簡單，成本低，無需特殊設(shè)備。本發(fā)明制備的海藻酸鈉支架是一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的生長模版，它能夠引導(dǎo)組織的再生，同時控制組織的形狀。本發(fā)明的支架是由聚甲基丙烯酸甲酯作為主體的，具有制作簡單、抗壓能力強的優(yōu)點；并且聚甲基丙烯酸甲酯具有無毒，無免疫原性的優(yōu)點，在血液儲存等生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。具有合適通道尺寸的三維細(xì)胞培養(yǎng)架更有利于血管和組織的形成。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中
圖I為向聚甲基丙烯酸甲酯微球模板中注入料漿燒結(jié)前的掃描電鏡照片；
圖2為本發(fā)明的用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的顯微鏡照片。
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
實施例I
I)固相磷酸三鈣為50%的料漿配制步驟如下
(a)固相磷酸三鈣粉末制備將硝酸鈣9. 8412g、磷酸氫二胺5. 2836g、尿素 3. 3665g溶于IOOmL超純水中。
(b)將上述水溶液放置于70°C烘箱中干燥3h。
(c)干燥后，將固體放于馬弗爐中。在700°C溫度下，煅燒lh，得到白色的納米磷酸二 f丐粉末。
(d)將納米磷酸三鈣粉末3. 0106g和分散劑聚丙烯酸銨I. 2mL溶于3mL超純水中， 用行星式球磨機球磨2h，制備得到固相三鈣的料漿。
2)聚甲基丙烯酸甲酯微球制備步驟如下
(a)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉水溶液。
(b)首先，取上述氫氧化鈉溶液25mL緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次。然后，用上述氫氧化鈉溶液25mL清洗甲基丙烯酸甲酯兩次。最后，用無水氯化鈣干燥洗滌后的甲基丙烯酸甲酯12h。
(c)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 3%的聚乙烯醇水溶液。
(d)在直三角燒瓶中，將堿式碳酸鎂O. 5182g溶解于IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 3 %的聚乙烯醇溶液。然后，加入8mL甲基丙烯酸甲酯溶液(密度P =0.9410g/mL)、引發(fā)劑過氧化苯甲酰O. 0282g、0. 16mL 二甲基丙烯酸乙二醇酯(密度P = I. 051g/mL)。在N2保護下，將反應(yīng)體系至于66°C下攪拌5h,攪拌速度為240r/min。
(d)反應(yīng)結(jié)束后，用濾紙過濾粗產(chǎn)物除去殘留溶液，并用超純水洗滌5次。
(e)在60°C烘箱中，真空干燥得到直徑為200 300 μ m的聚甲基丙烯酸甲酯微球。
3)聚甲基丙烯酸甲酯/支架的制備步驟如下
(a)將亞硫酸鋁3. 6752g、尿素8. 4084g、聚乙烯醇吡咯烷酮O. 0462g溶解于250mL 超純水中，配制得到納米氧化鋁懸濁液。
(b)將聚甲基星稀酸甲酯微球放置于燒杯中，于干燥箱中。在180°C下，干燥lh。
(c)室溫下，將納米氧化鋁懸濁液慢慢的鋪滿聚甲基丙烯酸甲酯微球，于真空干燥箱中干燥，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球支架。
4)將3)步驟中制得的聚甲基丙烯酸甲酯/支架進行真空處理，注入第I)步中所制備的磷酸三鈣料漿，混合均勻得到料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物。
5)將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中，室溫到200°C均勻升溫并燒結(jié)50分鐘，200-400°C均勻升溫并燒結(jié)600分鐘，400-1300°C均勻升溫并燒結(jié)400分鐘，最后1250°C燒結(jié)120分鐘，得到孔磷酸鈣支架。
6)用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架即海藻酸鈉支架的制備步驟如下
(a)配制質(zhì)量濃度為4%的海藻酸鈉凝膠；
(b)將第5)步中制備的多孔磷酸鈣支架置于4%海藻酸鈉鹽酸溶液中真空浸泡 lh，用超純水沖洗3次，制備得到海藻酸鈉支架。
實施例2
I)固相磷酸三鈣為55%的料漿配制步驟如下
(a)固相磷酸三鈣粉末制備將硝酸鈣12.0222g、磷酸氫二胺6.8940g、尿素 3. 7730g溶于IOOmL超純水中。
(b)將上述水溶液放置于80°C烘箱中干燥7h。
(c)干燥后，將固體放于馬弗爐中。在800°C溫度下，煅燒2h，得到白色的納米磷酸二 f丐粉末。
(d)將納米磷酸三鈣粉末3. 0259g和分散劑聚丙烯酸銨I. 2mL溶于3mL超純水中， 用行星式球磨機球磨O. 5h,制備得到固相三韓的料楽。
2)聚甲基丙烯酸甲酯微球制備步驟如下
(a)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的氫氧化鈉水溶液。
(b)首先，取上述氫氧化鈉溶液40mL緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次。最后，用無水氯化鈣干燥洗滌后的甲基丙烯酸甲酯24h。
(c)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 4 %的聚乙烯醇水溶液。
(d)在直三角燒瓶中，將堿式碳酸鎂O. 5482g溶解于IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 4%的聚乙烯醇溶液。然后，加入7. 7mL甲基丙烯酸甲酯溶液(密度P =0.9410g/mL)、引發(fā)劑過氧化苯甲酰O. 0282g、0. 15mL 二甲基丙烯酸乙二醇酯(密度P = I. 051g/mL)。在N2保護下， 將反應(yīng)體系至于70°C下攪拌6h，攪拌速度為440r/min。
(d)反應(yīng)結(jié)束后，用濾紙過濾粗產(chǎn)物除去殘留溶液，并用超純水洗滌5次。
(e)在65°C烘箱中，真空干燥得到直徑為200 300 μ m的聚甲基丙烯酸甲酯微球。
3)聚甲基丙烯酸甲酯/支架的制備步驟如下
(a)將亞硫酸鋁4. 4109g、尿素9. OOlOg、聚乙烯醇吡咯烷酮O. 0475g溶解于250mL 超純水中，配制得到納米氧化鋁懸濁液。
(b)將聚甲基星稀酸甲酯微球放置于燒杯中，于干燥箱中。在200°C下，干燥2h。
(C)室溫下，將納米氧化鋁懸濁液慢慢的鋪滿聚甲基丙烯酸甲酯微球，于真空干燥箱中干燥，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球支架。
4)將第3)步制得的聚甲基丙烯酸甲酯/支架進行真空處理，注入第I)步中所制備的磷酸三鈣料漿，混合均勻得到料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物。
5)將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中，室溫到200°C均勻升溫并燒結(jié)50分鐘，200-400°C均勻升溫并燒結(jié)600分鐘，400-1300°C均勻升溫并燒結(jié)400分鐘，最后1250°C燒結(jié)120分鐘，得到孔磷酸鈣支架。
6)用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架即海藻酸鈉支架的制備步驟如下
(a)配制質(zhì)量濃度為7 %的海藻酸鈉凝膠；
(b)將第5)步中制備的多孔磷酸鈣支架置于7 %海藻酸鈉鹽酸溶液中浸泡lh，用超純水沖洗3次，制備得到海藻酸鈉支架。
實施例3
I)固相磷酸三鈣為52%的料漿配制步驟如下
(a)固相磷酸三鈣粉末制備將硝酸鈣10. 6191g、磷酸氫二胺6. 0986g、尿素 3.6099g溶于IOOmL超純水中。
(b)將上述水溶液放置于75°C烘箱中干燥5h。
(c)干燥后，將固體放于馬弗爐中。在780°C溫度下，煅燒I. 5h，得到白色的納米磷酸三鈣粉末。
(d)將納米磷酸三鈣粉末3. 0119g和分散劑聚丙烯酸銨I. 2mL溶于3mL超純水中， 用行星式球磨機球磨O. 5h,制備得到固相三韓的料楽。
2)聚甲基丙烯酸甲酯微球制備步驟如下
(a)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5. 5%的氫氧化鈉水溶液。
(b)首先，取上述氫氧化鈉溶液40mL緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次。最后，用無水氯化鈣干燥洗滌后的甲基丙烯酸甲酯20h。
(c)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 36%的聚乙烯醇水溶液。
(d)在直三角燒瓶中，將堿式碳酸鎂O. 5295g溶解于IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 3 %的聚乙烯醇溶液。然后，加入8mL甲基丙烯酸甲酯溶液(密度P =0.9410g/mL)、引發(fā)劑過氧化苯甲酰O. 0282g、0. 16mL 二甲基丙烯酸乙二醇酯(密度P = I. 051g/mL)。在N2保護下，將反應(yīng)體系至于68°C下攪拌5. 5h，攪拌速度為300r/min。
(d)反應(yīng)結(jié)束后，用濾紙過濾粗產(chǎn)物除去殘留溶液，并用超純水洗滌5次。
(e)在65°C烘箱中，真空干燥得到直徑為200 300 μ m的聚甲基丙烯酸甲酯微球。
3)聚甲基丙烯酸甲酯/支架的制備步驟如下
(a)將亞硫酸鋁4. 1452g、尿素8. 8762g、聚乙烯醇吡咯烷酮O. 0456g溶解于250mL 超純水中，配制得到納米氧化鋁懸濁液。
(b)將聚甲基星稀酸甲酯微球放置于燒杯中，于干燥箱中。在190°C下，干燥I. 5h。
(c)室溫下，將納米氧化鋁懸濁液慢慢的鋪滿聚甲基丙烯酸甲酯微球，于真空干燥箱中干燥，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球支架。
4)將第3)步制得的聚甲基丙烯酸甲酯/支架進行真空處理，注入第I)步中所制備的磷酸三鈣料漿，混合均勻得到料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物。
5)將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中，室溫到200°C均勻升溫并燒結(jié)50分鐘，200-400°C均勻升溫并燒結(jié)600分鐘，400-1300°C均勻升溫并燒結(jié)400分鐘，最后1250°C燒結(jié)120分鐘，得到孔磷酸鈣支架。
6)用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架即海藻酸鈉支架的制備步驟如下
(a)配制質(zhì)量濃度為5 %的海藻酸鈉凝膠；
(b)將第5)步中制備的多孔磷酸鈣支架置于5%海藻酸鈉鹽酸溶液中浸泡lh，用超純水沖洗3次，制備得到海藻酸鈉支架。
實施例4
I)固相磷酸三鈣為54%的料漿配制步驟同實施例I
2)聚甲基丙烯酸甲酯微球制備步驟同實施例I :
3)聚甲基丙烯酸甲酯/支架的制備步驟同實施例I :
4)料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物制備步驟同實施例I。
5)將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中，室溫到200°C均勻升溫并燒結(jié)50分鐘，200-400°C均勻升溫并燒結(jié)600分鐘，400-1300°C均勻升溫并燒結(jié)400分鐘，最后1250°C燒結(jié)120分鐘，得到孔磷酸鈣支架。
6)用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架即海藻酸鈉支架的制備步驟同實施例I。
實施例5
I)固相磷酸三鈣為55 %的料漿配制步驟同實施例I
2)聚甲基丙烯酸甲酯微球制備步驟同實施例I :
3)聚甲基丙烯酸甲酯/支架的制備步驟同實施例I :
4)料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物制備步驟同實施例I。
5)將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中，在1250°C下燒結(jié)120 分鐘，得到多孔磷酸鈣支架。
6)用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架即海藻酸鈉支架的制備步驟同實施例I。
用于細(xì)胞培養(yǎng)三維細(xì)胞培養(yǎng)支架的應(yīng)用本發(fā)明制備的用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)即海藻酸鈉支架是一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的生長模版，它能夠引導(dǎo)組織的再生，同時控制組織的形狀。本發(fā)明的支架是由聚甲基丙烯酸甲酯作為主體的，具有制作簡單、抗壓能力強的優(yōu)點；并且聚甲基丙烯酸甲酯具有無毒，無免疫原性的優(yōu)點，在血液儲存等生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。具有合適通道尺寸的三維細(xì)胞培養(yǎng)架更有利于血管和組織的形成。
實驗表明本發(fā)明自制的聚甲基丙烯酸甲酯具有很好的三維取向。該聚合物在燒結(jié)前的結(jié)構(gòu)通過掃描電子顯微鏡(附圖I)表征，該三維支架的結(jié)構(gòu)通過顯微鏡(附圖2) 觀察。從圖中可以看出，三維細(xì)胞支架顯示出多孔性和三維取向。
權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架，其特征在于，所述三維培養(yǎng)支架包含多孔磷酸鈣支架和包被于所述多孔磷酸鈣支架上的海藻酸鈉層；所述多孔磷酸鈣支架設(shè)有均勻分布的微孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三維培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括 步驟I :固相磷酸I丐含量為50 55% (重量體積比)的料楽的配制； 步驟2 :聚甲基丙烯酸甲酯微球的制備； 步驟3 :多孔磷酸鈣支架的制備； 步驟4 :將步驟3制備的多孔磷酸鈣支架放入質(zhì)量百分含量為4 7%的海藻酸鈉鹽酸溶液中，真空浸泡l_2h，用超純水反復(fù)洗滌三次，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟I中，所述磷酸鈣為納米磷酸鈣。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，在步驟I中，所述料漿的配制包括以下步驟 步驟I. I :納米磷酸三鈣粉末的配制； 步驟I. 2 :將納米磷酸三鈣粉末、分散劑及超純水球磨O. 5-2h，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述納米磷酸三鈣粉末的配制包括以下步驟 步驟I. I. I :將硝酸鈣、磷酸氫二胺和尿素溶于超純水中，優(yōu)選地，所述超純水溶液中各原料的濃度為硝酸鈣O. 5-0. 6摩爾/L、磷酸氫二胺O. 4-0. 5摩爾/L和尿素O. 56-0. 6摩爾/L ； 步驟I. I. 2 :將步驟I. I. I制得的溶液放置于烘箱中，于70-80°C干燥3_7h ； 步驟I. I. 3 :將干燥后的物質(zhì)放于馬弗爐中，于700-800°C溫度，煅燒l_2h，得到白色的納米磷酸三鈣粉末。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟2中，所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的制備包括以下步驟 步驟2. I :用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-6%氫氧化鈉溶液緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次，再用無水氯化鈣干燥洗滌后的甲基丙烯酸甲酯12-24h，優(yōu)選地，用25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5_6%氫氧化鈉溶液緩慢清洗甲基丙烯酸甲酯兩次； 步驟2. 2 :將堿式碳酸鎂溶于質(zhì)量百分含量為O. 3%的聚乙烯醇溶液中，再加入甲基丙烯酸甲酯溶液、引發(fā)劑、二甲基丙烯酸乙二醇酯，在N2保護下，將反應(yīng)體系至于66-70°C下攪拌6h，攪拌速度為240-440r/min，優(yōu)選地，所述堿式碳酸鎂溶液的濃度為O. 0142-0. 015摩爾/L ;優(yōu)選地，所述甲基丙烯酸甲酯溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為I : 12.5-1 13，更為優(yōu)選地，所述甲基丙烯酸甲酯溶液的密度為O. 9410g/mL;優(yōu)選地，所述引發(fā)劑為過氧化苯甲酰，所述過氧化苯甲酰的質(zhì)量濃度為O. 3% ;優(yōu)選地，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯與聚乙烯醇溶液的體積比為I : 625-1 667，更為優(yōu)選地，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯的密度為 I. 0151g/mL ； 步驟2. 3 :反應(yīng)結(jié)束后，用濾紙過濾粗產(chǎn)物除去殘留溶液，并用超純水洗滌5次； 步驟2. 4 :在60-65°C烘箱中，真空干燥得到直徑為200 300 μ m的聚甲基丙烯酸甲酯微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟3中，所述多孔磷酸鈣支架的制備包括以下步驟 步驟3. I :將亞硫酸鋁、尿素、聚乙烯醇吡咯烷酮超純水中，配制得到納米氧化鋁懸濁液，優(yōu)選地，所述各原料溶于超純水中的濃度分別為亞硫酸鋁O. 05-0. 06摩爾/L、尿素O. 56-0. 6摩爾/L、聚乙烯醇吡咯烷酮6. 5x10-6摩爾/L ； 步驟3.2 :將聚甲基丙稀酸甲酯微球放置于燒杯中，于干燥箱中，于180-200°C下，干燥l-2h ； 步驟3. 3 :室溫下，將納米氧化鋁懸濁液緩慢鋪滿聚甲基丙烯酸甲酯微球，于真空干燥箱中干燥，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球支架。
步驟3. 4 :將步驟3. 3制得的聚甲基丙烯酸甲酯/支架進行真空處理，注入步驟I中所制備的磷酸三鈣料漿，混合均勻得到料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物。
步驟3. 5 :將料漿/聚甲基丙烯酸甲酯/支架復(fù)合物放于馬弗爐中燒結(jié)形成多孔磷酸鈣支架。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述燒結(jié)步驟為依次置于室溫到200°C均勻升溫并燒結(jié)50分鐘，200-400°C均勻升溫并燒結(jié)600分鐘，400-1300°C均勻升溫并燒結(jié)400分鐘，最后1250°C燒結(jié)120分鐘。
9.權(quán)利要求I所述的三維培養(yǎng)支架在制備細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)支架，所述三維培養(yǎng)支架包含多孔磷酸鈣支架和包被于所述多孔磷酸鈣支架上的海藻酸鈉。該支架具有制備簡單，便于操作和運輸?shù)葍?yōu)點。本發(fā)明還提供該三維培養(yǎng)支架的制備方法和應(yīng)用。
文檔編號C12N5/071GK102935246SQ20111023321
公開日2013年2月20日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者宮建茹, 崔金磊 申請人:國家納米科學(xué)中心