一種基于水凝膠微孔板的細(xì)胞球原位制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞球的制備方法，具體涉及一種基于水凝膠微孔板的細(xì)胞球原位制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞球是一種多細(xì)胞聚集體，與二維細(xì)胞培養(yǎng)體系相比，細(xì)胞球培養(yǎng)能夠更好地模擬在體微環(huán)境，獲得與在體更為相近的響應(yīng)結(jié)果，因此，在病理機(jī)理、藥物篩選以及組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。構(gòu)建細(xì)胞球有多種方法，如基于細(xì)胞非粘附表面的微孔板法、基于重力的懸掛液滴法、基于磁力的磁懸浮法以及基于離心力的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法等。其中，微孔板法因其操作簡單、可控性好、實(shí)現(xiàn)起來較為容易，得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003]微孔板法的基本原理是利用微孔結(jié)構(gòu)的空間約束和微孔板材料的細(xì)胞非粘附特性，促進(jìn)細(xì)胞在生長過程中通過細(xì)胞之間的粘附力聚集成球。制備微孔板常用的材料是聚二甲基娃氧燒(polydimethylsiloxane, PDMS)，PDMS是目前微流控芯片領(lǐng)域用的最多的材料，成本低、惰性好、具有疏水性、無毒。制備PDMS微孔板常用的是模具法。模具材料通常采用硅或金屬材料。但是硅和金屬模具加工過程較為復(fù)雜，成本也較高，并且每次使用后清洗困難，重復(fù)使用效果差。
[0004]水凝膠是一種含有大量水的高分子聚合物網(wǎng)絡(luò)，因其生物相容性、可降解性以及與細(xì)胞外基質(zhì)相似等特性，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。近些年來，基于瓊脂糖、海藻酸鹽以及聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)水凝膠的微孔板在細(xì)胞球培養(yǎng)方面也得到了發(fā)展。目前水凝膠微孔板中微孔結(jié)構(gòu)多半是圓柱狀，底面是平的，形成的細(xì)胞球的尺寸和形狀差異較大。最近研宄表明，凹狀微孔(如球面微孔)能夠更好地促進(jìn)細(xì)胞聚集生長后形成尺寸均一、形狀規(guī)則的細(xì)胞球。但是，目前缺少一種有效的在水凝膠表面構(gòu)建球面微孔的方法；并且，目前研宄都是在構(gòu)建微孔板后再人為種植細(xì)胞，存在效率低、種植細(xì)胞密度不均勻以及培養(yǎng)成球過程中細(xì)胞容易流失等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于水凝膠微孔板的細(xì)胞球原位制備方法，該方法操作簡單、成本低、適用范圍廣、成形效果好。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]一種基于水凝膠微孔板的細(xì)胞球原位制備方法，包括以下步驟:
[0008]I)將基片進(jìn)彳丁疏水處理，制得疏水基片；
[0009]2)將培養(yǎng)的細(xì)胞消化，然后與第一水凝膠溶膠混合，制成第一水凝膠溶膠細(xì)胞混合液；
[0010]其中，第一水凝膠溶膠為質(zhì)量濃度3%?20%的明膠或甲基丙烯酸?；髂z；
[0011]3)將第一水凝膠溶膠細(xì)胞混合液以0.05?2 yL每液滴的形式沉積至步驟I)制得的疏水基片表面，形成半球狀液滴，在O?20°C下靜置至半球狀液滴交聯(lián)固化，制得載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板；
[0012]4)在載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板上方覆蓋第二水凝膠溶膠，然后通過低溫處理或紫外照射使第二水凝膠溶膠交聯(lián)，形成第二水凝膠微孔板和載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板復(fù)合結(jié)構(gòu)；
[0013]其中，第二水凝膠溶膠為質(zhì)量濃度I %?5 %的瓊脂糖，或者為質(zhì)量濃度5 %?20%的聚乙二醇水凝膠及聚乙二醇水凝膠衍生物；
[0014]5)將第二水凝膠微孔板和載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板復(fù)合結(jié)構(gòu)置于培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)液后進(jìn)行培養(yǎng)，直至第一水凝膠融化為溶膠，在此培養(yǎng)過程中，細(xì)胞在第二水凝膠微孔板的微孔中生長，形成細(xì)胞球。
[0015]步驟I)所述疏水處理具體為:
[0016]將基片浸泡在疏水劑中處理后，烘干；所述疏水劑為子西萊自清潔劑；
[0017]或者，將基片進(jìn)彳丁娃燒化處理；
[0018]或者，將聚四氟乙烯薄膜貼在基片上，制得疏水表面。
[0019]所述基片為玻璃基片或聚甲基丙烯酸甲酯基片。
[0020]步驟3)是采用移液槍、注射器或細(xì)胞打印平臺(tái)將步驟2)得到的第一水凝膠溶膠細(xì)胞混合液沉積到步驟I)制備的疏水基片表面形成半球狀液滴。
[0021]步驟3)所述的靜置時(shí)間為10?60min。
[0022]步驟4)所述的低溫處理是在O?20°C下靜置5?30min。
[0023]步驟4)所述的紫外照射處理時(shí)間為10?120s。
[0024]步驟5)所述的培養(yǎng)是將加入培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于37°C、二氧化碳濃度為5 %的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)I?14d。
[0025]步驟2)所述的培養(yǎng)的細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞MCF - 7、造骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞。
[0026]步驟2)所述的第一水凝膠溶膠細(xì)胞混合液中細(xì)胞濃度為0.01 X 17?5 X 10 7個(gè)/mL。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0028]本發(fā)明基于水凝膠微孔板構(gòu)建的細(xì)胞球原位制備方法，首先制備第一水凝膠溶膠細(xì)胞混合液，將第一水凝膠溶膠細(xì)胞混合液沉積在疏水基片上制得載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板，再在載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板上方覆蓋第二水凝膠溶膠，使第二水凝膠溶膠交聯(lián)后，形成第二水凝膠微孔板和載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板復(fù)合結(jié)構(gòu)，最后將第二水凝膠微孔板和載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板復(fù)合結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞球的培養(yǎng)，第一水凝膠融化為溶膠，在此培養(yǎng)過程中，細(xì)胞在第二水凝膠微孔板的孔中生長，形成細(xì)胞球。本發(fā)明創(chuàng)新性地使用載細(xì)胞的微尺度水凝膠作為模板構(gòu)建帶有球面微孔的第二水凝膠微孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)溫度下，第一水凝膠轉(zhuǎn)化為溶膠態(tài)，預(yù)先混合的細(xì)胞在第二水凝膠微孔板的微孔中原位生長增殖形成細(xì)胞球，無需后續(xù)人為進(jìn)行細(xì)胞接種，孔內(nèi)初始細(xì)胞密度可控。本發(fā)明方法易于構(gòu)建大小可控、形狀規(guī)則的細(xì)胞球，且成本低、操作簡單、可重復(fù)性好、適用范圍廣，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)以及藥物篩選等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明基于水凝膠微孔板的細(xì)胞球原位制備方法的實(shí)驗(yàn)操作流程圖；
[0030]圖2a為微尺度水凝膠模板照片；
[0031]圖2b為利用微尺度水凝膠模板倒模形成的PEG-DMA水凝膠微孔陣列照片；
[0032]圖2c為不同體積液滴的俯視圖；
[0033]圖2d為為不同尺寸微孔俯視圖；
[0034]圖2e為微尺度水凝膠模板中0.48 μ L和0.23 μ L液滴的側(cè)面圖；
[0035]圖2f為體積為0.48 μ L和0.23 μ L的水凝膠模板倒模形成的水凝膠微孔剖面圖；
[0036]圖3a為MCF-7在細(xì)胞密度I X 16個(gè)/mL和0.48 μ L微尺度水凝膠模板倒模形成的水凝膠微孔中分別培養(yǎng)I小時(shí)、3天、5天和7天的相差照片；
[0037]圖3b為圖3a培養(yǎng)7天后的熒光染色照片；
[0038]圖3c為MCF-7在細(xì)胞密度I X 16個(gè)/mL和0.23 μ L微尺度水凝膠模板倒模形成的水凝膠微孔中分別培養(yǎng)I小時(shí)、3天、5天和7天的相差照片；
[0039]圖3d為圖3c培養(yǎng)7天后的熒光染色照片；
[0040]圖3e為MCF-7在細(xì)胞密度5 X 15個(gè)/mL和0.48 μ L微尺度水凝膠模板倒模形成的水凝膠微孔中培養(yǎng)7天后的相差圖片；
[0041]圖3f為圖3e的熒光染色照片；
[0042]圖3g為MCF-7在細(xì)胞密度5 X 15個(gè)/mL和0.23 μ L微尺度水凝膠模板倒模形成的水凝膠微孔中培養(yǎng)7天后的相差圖片；
[0043]圖3h為圖3g的熒光染色照片；
[0044]圖4為細(xì)胞在培養(yǎng)和成球過程中存活率柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0046]本發(fā)明公開的一種基于水凝膠微孔板的細(xì)胞球原位制備方法，采取的技術(shù)方案如圖1流程所示:
[0047]第一步，準(zhǔn)備疏水基片:將載玻片或聚甲基丙烯酸甲酯[poly (methylmethacrylate)，PMMA]片材進(jìn)行娃燒化處理或浸泡在疏水劑中，進(jìn)行疏水處理后，烘干備用，疏水劑為子西萊自清潔劑；或?qū)⒕鬯姆蚁?PTFE)薄膜貼在基底(載玻片、聚甲基丙烯酸甲酯或培養(yǎng)皿蓋內(nèi)表面等)上，制造疏水表面。
[0048]第二步，制備第一水凝膠溶膠和細(xì)胞懸液的混合液:消化事先培養(yǎng)的細(xì)胞，并與第一水凝膠溶膠混合制備細(xì)胞濃度為0.01?5 X 17個(gè)/mL的第一水凝膠溶膠和細(xì)胞懸液的混合液。細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞MCF - 7、造骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，第一水凝膠溶膠材料為濃度3?20% (w/v)的明膠或3?20% (w/v)的甲基丙稀酸酰化明膠。
[0049]第三步，制備載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板:用移液槍、注射器或細(xì)胞打印平臺(tái)將第一水凝膠溶膠和細(xì)胞懸液的混合液以0.05?2 μ L每液滴的形式沉積到第一步制備的疏水基片表面形成半球狀液滴，O?20°C低溫放置10?60分鐘使液滴交聯(lián)固化形成載細(xì)胞的微尺度水凝膠陣列作為模板。
[0050]第四步，在載細(xì)胞微尺度水凝膠模板上覆蓋第二水凝膠:通過模板制備水凝膠微孔板:將第二水凝膠溶膠覆蓋在第三步制備的載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板上方。第二水凝膠溶膠材料為濃度為5%?30% (w/v)聚乙二醇水凝膠及其衍生物，或1%?5% (w/v)的瓊脂糖。
[0051]第五步，交聯(lián)第二水凝膠:將上一步覆蓋均勻的第二水凝膠在O?20°C低溫放置處理5?30min，或紫外照射10?120s使之交聯(lián)。
[0052]第六步，融化第一水凝膠形成孔并培養(yǎng)細(xì)胞:第五步制作的水凝膠微孔板和載細(xì)胞的微尺度水凝膠模板復(fù)合結(jié)構(gòu)置于培養(yǎng)皿中，用移液槍緊靠培養(yǎng)皿壁滴加培養(yǎng)液，最后放置于溫度為37°C、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中