一種羊骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學領域，具體設及一種羊骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng)方 法。
【背景技術】
[000引 間充質干細胞（Mesenchymal stem cells, MSC)是干細胞家族的重要成員，來源 于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC具有干細胞的共性，即自我更新、多向分化和歸巢的能 力。在特定的機體外分化環(huán)境下，能夠誘導分化為神經、屯、臟、肝臟、骨、軟骨、肌腫、脂肪、上 皮等多種組織細胞。
[0003] MSC由于具有自我更新和多向分化的潛能，成為近年來研究的熱點。大量研究證 實，MSC可W從骨髓中分離得到，也存在于其他不同組織和臟器中，如脂肪組織、廝帶血、廝 帶、胎盤等。骨髓間充質干細胞炬MSCs)是骨髓基質干細胞，對骨髓中的造血干細胞化SC) 不僅有機械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6, IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來 支持造血。因此，研究BMSCs在體外的高效分離及培養(yǎng)方法意義非常重大。
[0004] 目前針對羊BMSCs的分離及培養(yǎng)方法尚未建立，現有技術中對于人BMSCs的研究 得較多，人BMSCs的常規(guī)分離方法有全骨髓貼壁法跟密度梯度離屯、法。全骨髓貼壁法為將 骨髓培養(yǎng)基重懸后直接接種到培養(yǎng)瓶中，經過多次換液去掉未貼壁的懸浮細胞如紅細胞等 從而獲得BMSCs。該種方法在操作上非常簡單方便，但存在細胞純度低，貼壁效果不好的缺 點。主要原因是骨髓中存在大量的紅細胞及粒細胞等，如果不去除該部分細胞，BMSCs貼壁 的效率會降低，而骨髓中的成纖維細胞也會貼壁從而降低了 BMSCs的純度。
[0005] 另一種常規(guī)的分離方法就是利用淋己細胞分離液進行密度梯度離屯、，該方法可W 去掉絕大部分的紅細胞，提高BMSCs的貼壁率及純度，但該個方法在操作要求上比較高，在 淋己細胞分離液上加骨髓或血液時，需要非常小屯、緩慢地添加，稍有不慎就會擾亂淋己細 胞分離液跟白膜層之間的界面，導致分離失敗且該方法耗時長。
[0006] 另外，現有技術中常見的培養(yǎng)體系就是采用DMEM/F12培養(yǎng)基加上體積比為10% 的胎牛血清（FB巧進行BMSCs的體外培養(yǎng)與擴增，該培養(yǎng)體系培養(yǎng)得到的細胞經過幾次傳 代后會出現部分細胞分化的現象。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是建立一種針對羊BMSCs的原代分離及擴增培養(yǎng)的方法。通過改 進常規(guī)的密度梯度離屯、法，再利用改進的培養(yǎng)體系對分離得到的BMSCs進行了高效擴增， 成功得到了具有自我更新及分化潛能的BMSCs。利用本發(fā)明方法可建立起一種羊BMSCs的 快速穩(wěn)定的分離方法及和高效的擴增體系。本發(fā)明在常規(guī)的密度梯度離屯、法的基礎上，將 普通的離屯、管換成了 SepMate?離屯、管。沁pMate ?離屯、管內加上了一個插件，該個插件可在 淋己細胞分離液和骨髓之間提供一道屏障，加樣時，無需小屯、翼翼地向淋己細胞分離液上 加入血液樣本；離屯、后，通過傾倒即可快速而輕松地收集到分離出的單個核細胞。改用該個 離屯、管后不僅大大降低操作難度，提高了分離的效率，也明顯提高了細胞分離的效果。而在 培養(yǎng)體系上，本發(fā)明在含10%胎牛血清的DMEM/F12的基礎上添加了非必需氨基酸（NEAA) 和低濃度的表皮細胞生長因子巧G巧成分，實現了羊BMSCs的高效擴增。現有技術中也有 報道用EGF和bFGF (堿性成纖維細胞生長因子）聯合使用誘導干細胞的體外分化。
[000引本發(fā)明目的通過W下技術方案來實現。
[0009] 一種羊骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0010] (1)獲取羊骨髓
[0011] (2)將離屯、管中的骨髓用PBS洗漆后，加入等體積的完全培養(yǎng)基重懸細胞，另取一 離屯、管加入等體積的Ficoll分離液，將骨髓細胞懸液緩慢加入到Ficoll分離液上層，離屯、 后吸取單個核細胞層，用PBS清洗，用完全培養(yǎng)基重懸細胞后，接種到完全培養(yǎng)基中貼壁培 養(yǎng)，
[001引 做接種18~2化后，棄去未貼壁的細胞及培養(yǎng)基，用PBS清洗后，加入含5~ 10 y g/L EGF和50~lOOmg/L NEAA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，即可得到羊骨髓間充質干細 胞；
[0013] 完全培養(yǎng)基為含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，百分數為體積百分數。
[0014] 優(yōu)選，所述離屯、管是采用沁pMate?離屯、管，安裝有插件。
[0015] 優(yōu)選，所述羊骨髓的獲取是通過選擇5個月大的健康羊，將其麻醉后用骨髓穿刺 針沿骼骨緣刺入直至髓腔，接上預先置有100U肝素抗凝劑的注射器抽吸骨髓，再轉移到真 空采血管中，置于冰盒中保存。
[0016] 優(yōu)選，步驟（2)所述將離屯、管中的骨髓用PBS洗漆是用等體積的PBS洗漆。
[0017] 優(yōu)選，所述貼壁培養(yǎng)和步驟（3)所述培養(yǎng)是放置于5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 [001引優(yōu)選，步驟似所述離屯、是在700g離屯、20min ;
[0019] 優(yōu)選，步驟做所述用PBS清洗是用PBS清洗2遍。
[0020] 優(yōu)選，步驟（3)所述含EGF和NEAA的培養(yǎng)基要求每3天更換一次。
[0021] 肥AA為Invitrogen公司產品，產品目錄號為11140。
[002引步驟似所述接種的接種密度是1 X lOVmL。
[0023] 本發(fā)明相對于現有技術所具有的優(yōu)點及有益效果：
[0024] (1) W羊骨髓為組織來源，進行了 BMSCs的分離W及培養(yǎng)。
[0025] (2)在常規(guī)培養(yǎng)體系，即含有10% FBS的DMEM/F12的基礎上加入了 NEAA(濃度范 圍50~lOOmg/L) W及低濃度的EGF (濃度范圍5~10 y g/L)成分。本發(fā)明在培養(yǎng)過程中 加入了 NEAA (50~lOOmg/L) W及低濃度的EGF巧~10 y g/L)，不僅沒有誘導該細胞的過早 分化，還大幅提高了細胞增殖速度。NEAA不僅可W為細胞提供更充足的營養(yǎng)，促進蛋白質的 合成，也在細胞信號通路傳導中起著重要的作用。而低濃度的EGF可W促進該細胞的增殖， 抑制細胞的分化。
[0026] 做采用了 SepMate?離屯、管代替普通的離屯、管，提高了分離的速度跟效果，也降 低了操作上的難度。
[0027] 改進后的密度梯度離屯、法結合貼壁法，無論是跟全骨髓貼壁法或者是普通的密度 梯度離屯、后貼壁，在技術操作和分離效果上都有了較大的提高。
[002引利用本發(fā)明方法，可建立起羊BMSCs的快速穩(wěn)定的分離方法及和高效的擴增體 系。而骨髓作為一種最主要的MSC來源，在生命科學及醫(yī)學領域將具有非常廣闊的臨床應 用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實施例1中分離培養(yǎng)得到P3代細胞的生長曲線。
[0030] 圖2為實施例2貼壁培養(yǎng)后獲得的原代細胞的細胞形態(tài)圖。
[0031] 圖3為實施例2獲得的P3代細胞的細胞形態(tài)圖。
[0032] 圖4為實施例2獲得的P3代細胞的流式鑒定結果。
[0033] 圖5為實施例1的獲得的P3代細胞采用表1的添加方式進行培養(yǎng)后的細胞形態(tài) 對比圖。
[0034] 具體實施步驟；
[003引 實施例1羊BMSCs的分離與培養(yǎng)
[0036] 1、羊骨髓采集
[0037] 選擇5個月大的健康羊，將其麻醉后用骨髓穿刺針沿骼骨緣刺入直至髓腔，接上 預先置有100U肝素抗凝劑的注射器抽吸骨髓，再轉移到真空采血管中，置于冰盒中保存。
[0038] 2、羊BMSCs原代分離
[0039] 在超凈工作臺中，將裝有骨髓的采血管用酒精棉球擦拭干凈，再將骨髓移入離屯、 管中，用等體積的PBS洗漆一遍后，加入等體積的完全培養(yǎng)基（含10% FBS的DMEM/F12培 養(yǎng)基）。取另一個離屯、管加入等體積的Ficoll分離液，將骨髓緩慢加到分離液上層，700g 離屯、20min。離屯、后吸取單個核細胞層，用PBS清洗兩次后用完全培養(yǎng)基重懸接種到培養(yǎng)瓶 中，放置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。離屯、管使用S巧Mate?離屯、