專利名稱：一種用于麥芽糖生產(chǎn)的固定化催化劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種淀粉加工為麥芽糖的專用固定化催化劑及其制備方法，屬于酶工程和農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
麥芽糖具有較高的營養(yǎng)價值，其甜度只有蔗糖的1/3，比蔗糖更為適口。在食品工業(yè)上主要有以下應(yīng)用特點1)麥芽糖不參加胰島素代謝，有利于糖尿病的防治；2)結(jié)晶性低，有防止淀粉凝聚的作用；3)熱穩(wěn)定性高，耐酸穩(wěn)定性高，焦化性低，受熱不易產(chǎn)生有色物質(zhì)；4)具有較小的吸水性，一般吸收69Γ12%的水分后，就不再吸水也不再釋放水分，有助于抑制糖果的脫水，使糖果保持柔軟而延長糖果的貨架期；5)適合于連續(xù)真空薄膜熬糖和澆模成型，尤其對制造硬糖效果明顯，并可降低糖果的粘度，提高糖果的風味。在醫(yī)藥上，由于麥芽糖在人體代謝中不需胰島素就能被吸收，因此是糖尿病患者的營養(yǎng)劑和輔助冶療劑， 用純麥芽糖輸液滴注靜脈。此外，麥芽糖還是多種重大產(chǎn)品(如海藻糖、異麥芽糖)的原料。麥芽糖的生產(chǎn)是通過水解淀粉制得，通常以麥芽糖漿形式作為產(chǎn)品形式，也有高純度結(jié)晶麥芽糖產(chǎn)品形式。麥芽糖漿是以淀粉為原料，經(jīng)酶法水解而制成的一種以麥芽糖為主的糖漿，按制法與麥芽糖含量不同可分為飴糖、高麥芽糖漿和超高麥芽糖漿等(表1)。表1各類麥芽糖漿的主要糖組成成分
權(quán)利要求
1.一種重組酵母，命名為釀酒酵母Qsaccharomyces cerevisiae) HH20110602,所表達的β-淀粉酶經(jīng)過酵母α凝集素在釀酒酵母W303-1A細胞表面錨定而得到固定，獲得重組酵母，已保藏于中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2011220。
2.一種用權(quán)利要求1所述重組酵母制備的用于高麥芽糖漿生產(chǎn)的固定化催化劑，其特征在于本質(zhì)為β -淀粉酶，通過將β -淀粉酶分子在釀酒酵母W303-1A細胞表面錨定實現(xiàn)其固定化的；所述固定化催化劑即為固定化淀粉酶；所表達的β-淀粉酶經(jīng)過酵母α凝集素在釀酒酵母W303-1A細胞表面錨定而得到固定，獲得重組酵母CCTCC NO =M 2011220，進一步大規(guī)模培養(yǎng)此重組酵母細胞，離心收獲細胞，用戊二醛溶液懸浮和紫外線下照射此重組酵母，獲得固定化β -淀粉酶；酶活為50 250 DPVg ；PH為3. 0 10. 5，溫度為55 75°C，固定化催化劑穩(wěn)定。
3.權(quán)利要求2所述的固定化催化劑的制備方法，其特征在于步驟為1)制備β-淀粉酶基因以紅薯為原料，用十六烷基三甲基溴化銨法提取紅薯 RNA，用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得其cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計引物擴增β -淀粉酶基因β，PCR 擴增條件是是95°C預變性5 min;以94°C 1 min,54°C 1 min、72°C 2 min進行循環(huán)30 輪；最后72°C延伸10 min ；所述PCR所用引物為BB-F5’ -ATGGCTCCAATCCCCGGT-3’，BB-R:5' -ATAAAAGAGCTTTTGGCGCTAATCAAACGGGTTTGAGCCAT-3，；2)制備α凝集素編碼基因eig-Sc以釀酒酵母W303-1A基因組DNA為原料，用多聚酶鏈反應(yīng)PCR技術(shù)擴增來源于釀酒酵母染色體W303-1A的α凝集素編碼基因<^-5b，反應(yīng)條件是95°C 預變性 5 min;以 94°C 30 s、56°C 1 min, 72 °C 2 min 進行循環(huán) 30 輪；最后 72°C 延伸10 min ；所述PCR擴增f-5b，所用引物為AF:5' -TGGCTCAAACCCGTTTGATTAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’，AR:5，- TTTGATTATGTTCTTTCTAT-3，；所述釀酒酵母W303-1A來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；3)制備融合基因amy-β ~agSc 利用重疊PCR的方法，將上述β -淀粉酶基因amy- β 和α凝集素編碼基因ag-Sc在讀框內(nèi)進行融合，獲得融合基因amy- β ~agSc ；所述重疊PCR，所用引物為上游引物 BB-F:5’ -ATGGCTCCAA TCCCCGGT- 3，，下游引物 AR: 5’ -TTTGATTATGTTCTTTCTAT- 3'；PCR 程序如下95°C 預變性 5 min;以 94°C 30 s、55°C 1 min、72°C 3 min 進行 30 個循環(huán)；72°C延伸 10 min ；4)制備重組酵母CCTCCNO =M 2011220 將質(zhì)粒pMGK經(jīng)酶切純化、pfu聚合酶補平純化后與上述融合基因β -ag-Sc連接，獲得重組質(zhì)粒pBA-AG，將該重組質(zhì)粒pBA_AG 經(jīng)fecll線性化，電轉(zhuǎn)化入釀酒酵母W303-1A中，轉(zhuǎn)化液涂布于G418濃度為300 μg /mL的 YPD平板，30°C培養(yǎng)3 5d，挑取轉(zhuǎn)化子點種于YPGS平板(YNB 0. 34%，硫酸銨1%，淀粉1%，葡萄糖0.5%)30°C培養(yǎng)2 d后用碘液染色，篩選轉(zhuǎn)化子，由此獲得了淀粉酶錨定于其表面的重組酵母 CCTCC NO :Μ 2011220 ；5)發(fā)酵收獲細胞在15 1000L發(fā)酵罐中分別加入70%體積的培養(yǎng)基，其質(zhì)量濃度為1% 3%葡萄糖、0. 5% 2. 5%酵母膏、0. 5% 3. 0% NaCl、其余為超純水、pH 3. 5 5. 5的培養(yǎng)基；將重組酵母CCTCC NO =M 2011220以體積比為0.5% 10%接入培養(yǎng)基中，控制溫度為 300C 士2°C、溶氧不低于20%、ρΗ4. 0 5. 0下培養(yǎng)48 72 h，收獲細胞；6)用0.廣1倍該細胞體積的0.19Γ1. 5%戊二醛溶液懸浮細胞，再在1(T30 cm紫外線下照射3(T120 min，4(TC以下低溫烘干至水分小于5%，獲得產(chǎn)品固定化β-淀粉酶，即固定化催化劑。
4.權(quán)利要求2所述的固定化催化劑的應(yīng)用，其特征在于此固定化催化劑用于高麥芽糖漿生產(chǎn)，分批或連續(xù)使用；反復使用10次以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于麥芽糖生產(chǎn)的固定化催化劑及其制備方法，屬于酶工程和農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以紅薯為原料，用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)提取其β-淀粉酶基因，再與來源于釀酒酵母的α凝集素編碼基因在讀框內(nèi)進行融合，融合基因轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1A，獲得了β-淀粉酶在酵母表面錨定的釀酒酵母，進一步大規(guī)模培養(yǎng)此重組酵母細胞，收獲細胞，用化學、物理方法穩(wěn)定和交聯(lián)此重組酵母，獲得固定化β-淀粉酶，該酶活為50~250DPo/g。運用該固定化β-淀粉酶可從液化淀粉直接生產(chǎn)出55%~65%的高麥芽糖漿；此固定化β-淀粉酶反復使用10次，酶活丟失率小于20%。
文檔編號C12P19/22GK102277308SQ20111021577
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者左志銳, 沈微, 王正祥, 石貴陽 申請人:江南大學