專利名稱：建立ca16病毒感染動(dòng)物模型的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的病毒株、方法以及試劑盒等。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)屬于小核糖核酸(RibonucleicAcid, RNA)病毒科(Picornaviridae)，腸道病毒屬(Enterovirus)，是多種人類疾病的致病病原，致病譜廣，可引起呼吸道感染、結(jié)膜炎、發(fā)熱性皮疹、皰疹性咽峽炎、心肌炎、心肌病及無菌性腦膜炎、腦炎和急性弛緩性麻痹等疾病，CV不同于其他腸道病毒，自1948年Dalldorf首次在紐約成功分離時(shí)，即發(fā)現(xiàn)該病毒對(duì)新生小鼠具有很高的敏感性，根據(jù)病毒對(duì)乳鼠的致病力將其劃分成A、B兩組，共30個(gè)血清型。CA16是人類最早發(fā)現(xiàn)的柯薩奇病毒A組病毒成員之一，為20面立體對(duì)稱球形顆粒，直徑約23 30nm，無包膜和突起，由衣殼和核酸組成。核酸為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約7410 個(gè)核苷酸，包含1個(gè)開放讀碼框架(Open Reading Frame, 0RF)，可分為PI、P2、P3三個(gè)區(qū)， 其中P2、P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；Pl區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPl VP4，該4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成一個(gè)亞單位，60個(gè)亞單位組成病毒衣殼。CA16可引起5歲以下嬰幼兒手足口部皰疹，是除腸道病毒71型(EV71)以外的另一個(gè)導(dǎo)致手足口病(Hand，F(xiàn)oot and Mouth Diszease,HFMD)的主要病原體。與EV71相比， CA16引起的HFMD多數(shù)癥狀較輕，不需特殊干預(yù)可自行痊愈，但在各地的流行中也不斷出現(xiàn)少數(shù)CA16引發(fā)重癥腦炎甚至引發(fā)死亡的報(bào)道。近幾年亞洲地區(qū)HFMD發(fā)病和死亡人數(shù)的快速增長(zhǎng)，經(jīng)流行病調(diào)查顯示多數(shù)流行呈EV71和CA16共同流行或交替流行的態(tài)勢(shì)。由于EV71 是引起重癥HFMD的主要病原體，EV71疫苗和治療藥物的研究在國(guó)家多方面的重點(diǎn)支持下得到了快速的發(fā)展，而CA16疫苗和治療藥物的研究相對(duì)滯后，急需更多關(guān)注，以配合EV71 防治工作共同構(gòu)筑有效的HFMD防控體系。理想的病毒性疾病動(dòng)物模型是研究病毒在體內(nèi)的入侵、復(fù)制、傳導(dǎo)、致病、轉(zhuǎn)歸等機(jī)理以及評(píng)價(jià)疫苗預(yù)防效果和藥物療效等的重要工具，雖然50年代就已明確CA16可引起新生乳鼠出現(xiàn)全身性肌炎而導(dǎo)致死亡，但至今尚無CA16動(dòng)物模型成功建立和應(yīng)用的報(bào)道， 成功的動(dòng)物模型已成為直接影響疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)和藥物篩選的主要瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明成功篩選了適于建立CA16動(dòng)物感染模型的病毒株，建立了穩(wěn)定、有效的 CA16感染乳鼠動(dòng)物模型，為CA16防治疫苗和藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。具體地，本發(fā)明以21例2008年北京地區(qū)HFMD患兒的臨床樣本為研究對(duì)象，經(jīng) vero細(xì)胞連續(xù)傳代獲得可穩(wěn)定復(fù)制的病毒株一株，命名為VR18。對(duì)VR18采用終末稀釋法進(jìn)行2次噬斑純化獲得純化病毒VR18-8ac。經(jīng)WHO分發(fā)的腸道病毒組合血清檢測(cè)，該病毒只能被CA16血清中和證實(shí)為CA16病毒，經(jīng)全基因序列檢測(cè)，VR18的基因全長(zhǎng)為7410nt，構(gòu)建VPl區(qū)進(jìn)化樹顯示VR18為CA16病毒Cl亞型，VR18-8ac的基因全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果如序列表中SEQ ID N0:1所示。經(jīng)挑選50個(gè)克隆，分別進(jìn)行VPl區(qū)PCR擴(kuò)增后基因序列檢測(cè)，證實(shí)全部克隆均為VR18病毒。經(jīng)外源因子檢測(cè)，證實(shí)該病毒株無其他外源因子污染。經(jīng)生物學(xué)特性分析，該病毒株病毒滴度為6. 1751gCCID50/ml，在VERO細(xì)胞上可形成明顯噬斑，噬斑滴度為 5. 9841gPFU/ml。本發(fā)明從臨床樣本中成功分離純化了用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的CA16C1 亞型病毒株VR18。其中經(jīng)vero細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的病毒株VR18，第四代VR18，經(jīng)連續(xù)2 代噬斑純化的VR18和經(jīng)1代鼠腦純化的VR18均于保藏日期在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京)進(jìn)行了生物保藏，分別為柯薩奇病毒A組16型 (Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18，保藏號(hào)CGMCC No. 4851 ；柯薩奇病毒A組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_4，保藏號(hào)CGMCC No. 4852 ；柯薩奇病毒 A 組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_8ac，保藏號(hào)CGMCC No. 4853 ；柯薩奇病毒A組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18-J，保藏號(hào)CGMCC No. 4854。 并且申請(qǐng)人已經(jīng)提供了上述生物材料的保藏證明和存活證明。除了上述進(jìn)行生物保藏的VR18病毒株，由VR18病毒株連續(xù)傳代，同時(shí)能夠用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的病毒株，也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。一般來說，本發(fā)明涉及能夠用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型，并且基因序列與SEQ ID NO 1具有90%以上，95%以上， 98%以上和99%以上同源性的CA16病毒株。本發(fā)明也涉及基因序列為由SEQ ID N0:1進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代，并能用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的CA16病毒株。本發(fā)明成功建立了一種CA16病毒感染動(dòng)物模型的制備方法，其步驟包括使用上述CA16病毒株感染乳鼠。本發(fā)明還涉及上述CA16病毒株在建立CA16病毒感染動(dòng)物模型中的用途。另外，本發(fā)明也涉及一種用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的試劑盒，所述試劑盒含有上述CA16病毒株。在CA16動(dòng)物模型的建立中，分別使用了不同代次和不同純化方法的V18病毒株，包括 VR18 (CGMCC No. 4851)，V18-4 (CGMCC No. 4852)，經(jīng)連續(xù) 2 代噬斑純化的 VR18-8ac (CGMCC No. 4853)和經(jīng)1代鼠腦純化的VR18-J (CGMCC No. 4854)。結(jié)果顯示不同代次的VR18和不同純化方式獲得的VR18 (細(xì)胞培養(yǎng)噬斑純化、鼠腦分離純化)均可使模型動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的發(fā)病及死亡。根據(jù)病毒毒力和病毒純度，優(yōu)選VRlS-Sac病毒株建立CA16 動(dòng)物感染模型。本發(fā)明分別采用顱內(nèi)、腹腔、口服方式感染1日齡以內(nèi)新生ICR乳鼠。結(jié)果顯示3 種感染方式均不同程度使模型動(dòng)物發(fā)病和死亡，其中顱內(nèi)和腹腔方式均可在感染后短期內(nèi)導(dǎo)致100%的死亡率。由于對(duì)于1日齡乳鼠顱內(nèi)接種較腹腔接種更易操作，因此優(yōu)選顱內(nèi)接種方式構(gòu)建CA16感染模型。本發(fā)明使用病毒株分別接種新生1、3、5、7、14日齡的ICR小鼠。結(jié)果表明新生1_5 日齡的ICR小鼠全部出現(xiàn)發(fā)病和死亡，發(fā)病和死亡時(shí)間隨小鼠日齡的增長(zhǎng)而延長(zhǎng)；而對(duì)7日齡小鼠隨可使其100%發(fā)病，但部分小鼠發(fā)病后逐漸恢復(fù)，病死率為67% ；14-21日齡小鼠則不出現(xiàn)發(fā)病和死亡。因此感染乳鼠的日齡可以是1-7日，優(yōu)選為1日齡。本發(fā)明分別對(duì)VR18-8ac從1 :16_1 :524288進(jìn)行8倍系列稀釋后進(jìn)行毒力研究，結(jié)果表明該模型臨床癥狀鮮明、重現(xiàn)性良好，同時(shí)表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性、動(dòng)物日齡依賴性。本發(fā)明建立的CA16動(dòng)物模型，所用攻擊病毒背景清晰、無外源因子污染、攻毒后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀清晰、典型，重復(fù)性好、同時(shí)具有良好的劑量依賴性。通過應(yīng)用研究顯示， 主動(dòng)免疫CA16滅活病毒和被動(dòng)免疫高效價(jià)CA16中和抗體均可保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免受致死量病毒攻擊，可用于今后CA16疫苗或藥物的免疫保護(hù)或療效研究。


圖1不同代次、不同純化方式CA16的乳鼠敏感性比較圖2IOOOLD5tl劑量CA16病毒感染乳鼠的發(fā)病和死亡情況圖3100LD5(1劑量CA16病毒感染乳鼠的發(fā)病及死亡情況圖4CA16中和抗體保護(hù)試驗(yàn)圖5CA16滅活病毒免疫保護(hù)試驗(yàn)生物材料保藏菌種名稱柯薩奇病毒A 組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18， 保藏號(hào)CGMCC No. 4851 ；保藏日期2011年5月11日，保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))；菌種名稱柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_4， 保藏號(hào)CGMCC No. 4852 ；保藏日期2011年5月11日，保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))；菌種名稱柯薩奇病毒A 組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株 VR18-8ac，保藏號(hào)CGMCC No. 4853 ；保藏日期2011年5月11日，保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))；菌種名稱柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_J， 保藏號(hào)CGMCC No. 4854，保藏日期2011年5月11日，保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))；。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1CA16病毒的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CA病毒通過顱內(nèi)感染方式可使1日齡以內(nèi)的新生乳鼠出現(xiàn)全身性肌炎而死亡，因此本研究選用1日齡ICR乳鼠作為模型動(dòng)物，分別對(duì)相同劑量的不同代次的VR18(VR18、VR18-4)、經(jīng)連續(xù)2代噬斑純化VR18 (VR18_8ac)和經(jīng)1代鼠腦純化 VR18 (VR18-J)進(jìn)行顱內(nèi)感染研究，結(jié)果VR18-4、VR18-8ac、VR18-J均使模型動(dòng)物在感染后 4d出現(xiàn)后肢麻痹，感染后5d全部死亡。而VRl8感染動(dòng)物癥狀相對(duì)較輕，在感染后4d陸續(xù)開始出現(xiàn)后肢麻痹，至感染后14d除2只動(dòng)物發(fā)病后逐漸恢復(fù)外其余6只全部死亡，死亡率為75% (見圖1)。結(jié)果顯示不同代次VR18和不同純化方式獲得的VR18(細(xì)胞培養(yǎng)噬斑純化、鼠腦分離純化)均可使模型動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的發(fā)病及死亡。根據(jù)病毒毒力和病毒純度，優(yōu)選VRlS-Sac采用顱內(nèi)方式感染1日齡以內(nèi)新生ICR乳鼠建立CA16動(dòng)物模型。實(shí)施例2感染方式的選擇
用相同劑量VRlS-Sac病毒株分別采用顱內(nèi)、腹腔、口服方式感染1日齡以內(nèi)新生 ICR乳鼠。結(jié)果三種感染方式的動(dòng)物死亡率分別為100^^100^^67% ；開始發(fā)病時(shí)間分別為4d、4d和5d ；全部死亡時(shí)間分別為5d、4d、12d (見表1)。顯示3種感染方式均不同程度可使模型動(dòng)物發(fā)病和死亡，其中顱內(nèi)和腹腔方式均可在感染后短期內(nèi)導(dǎo)致100%的死亡率。 由于對(duì)于1日齡乳鼠顱內(nèi)接種較腹腔接種更易操作，因此優(yōu)選顱內(nèi)接種構(gòu)建CA16感染模型。表1不同感染方式的比較
權(quán)利要求
1.一種可以穩(wěn)定復(fù)制和傳代的CA16病毒株VR18。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒株VR18，其特征在于其基因序列如SEQIDNO :1所示，或者其基因序列與SEQ ID NO :1具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性，又或者其基因序列是由SEQ IDNO 1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒株VR18，其特征在于其選自生物材料保藏編號(hào)分別為 CGMCC No. 4851，CGMCC No. 4852，CGMCC No. 4853 和 CGMCC No. 4854 的病毒株的組。
4.一種CA16病毒感染動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述制備方法的步驟包括使用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的CA16病毒株感染乳鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其特征在于所述的乳鼠是ICR乳鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于乳鼠的日齡是1-7日。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述感染的方式是顱內(nèi)、腹腔或口服方式感染，感染的劑量是1 OOLD5tl-IOOOLD5tl。
8.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的病毒株在制備CA16病毒感染動(dòng)物模型中的用途。
9.一種用于建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的CA16病毒株。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的CA16病毒株在制備建立CA16病毒感染動(dòng)物模型的試劑盒中的用途
11.使用權(quán)利要求4-所述的方法制備的動(dòng)物模型在CA16病毒感染疫苗開發(fā)中的用途
全文摘要
本發(fā)明成功篩選了適于建立CA16動(dòng)物感染模型的病毒株VR18，并利用VR18病毒株感染乳鼠建立了CA16病毒感染的動(dòng)物模型，同時(shí)本發(fā)明也涉及建立CA16動(dòng)物感染模型的方法，所用的試劑盒，以及病毒株VR18在建立CA16動(dòng)物感染模型中的用途等。本發(fā)明為CA16疫苗的研發(fā)提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)資料。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102286432SQ20111016203
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者李鳳翔, 梁爭(zhēng)論, 毛群穎, 王一平, 王軍志, 貌盼勇 申請(qǐng)人:中國(guó)食品藥品檢定研究院