專利名稱：用于禽流感病毒檢測(cè)的rt-lamp引物組、檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感病毒的檢測(cè)引物，尤其涉及基于RT-LAMP設(shè)計(jì)的檢測(cè)禽流感病毒的引物組，及其檢測(cè)方法和應(yīng)用，屬于禽流感病毒的檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感病毒(influenza virus)屬于正粘病毒科流感病毒屬。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(Ml)中抗原性不同，流感病毒被分成A、B、C三種。A型流感病毒已經(jīng)從多種動(dòng)物中分離到，包括人、豬、馬、海洋哺乳動(dòng)物、鳥類等。所有的禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)屬于A型，為單股負(fù)鏈RNA病毒，由8個(gè)獨(dú)立的RNA節(jié)段組成，顯著的生物學(xué)特征之一是亞型眾多，變異頻繁。迄今為止從禽類體內(nèi)已經(jīng)分離到上千種毒力各異的毒株，根據(jù)其病毒粒子表面的囊膜糖蛋白-血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異， 目前已鑒定出16種HA亞型和9種NA亞型。不同亞型毒株對(duì)宿主的致病力差異顯著，高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza，HPAI)可引起雞群100%死亡，被國(guó)際獸疫局確定為A類傳染病。自1959年以來，全世界共爆發(fā)了 20次HPAI，其中14次是在雞群中暴發(fā)的，每次HPAI的爆發(fā)都造成了嚴(yán)重的損失。近年來HPAI的爆發(fā)日益呈現(xiàn)復(fù)雜多樣、愈演愈烈的流行態(tài)勢(shì)1983 1984年，美國(guó)爆發(fā)H5N2亞型HPAI，共淘汰了 1700萬羽家禽，耗資8500萬元，而消費(fèi)者更是支出了 3. 49億美元用于補(bǔ)貼生產(chǎn)者的損失；1985 年澳大利亞的維多利亞州發(fā)生H7N7亞型的HPAI ； 1994年12月，巴基斯坦和澳大利亞的昆士蘭州爆發(fā)了 H7N3亞型AIV。近年來尤其倍受關(guān)注的是H5m，自1997年有人類感染 AIV并致死的報(bào)道以來，世界衛(wèi)生組織最近再次確認(rèn)全球已確診153例人感染AIV 83人死亡，大多數(shù)是由于H5W感染導(dǎo)致，造成世界對(duì)H5W的一片恐慌。因此，對(duì)AIV進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)疑似病例做出快速準(zhǔn)確的診斷，進(jìn)而掌控禽流感的遺傳變異規(guī)律，對(duì)保護(hù)人類的生命安全具有重要意義。已報(bào)道的對(duì)禽流感病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的方法有免疫熒光試驗(yàn) (immunofluorescence Assay, I FA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase Chain Inaction，PCR)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量 RT-PCR(Real-time RT_PCR，RRT_PCR)、多元PCR(mw ltiplex PCR)、核酸序列擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)禾口基因芯片(Gene chip或DNA Microarray) 等，其中RT-PCR技術(shù)是研究的熱點(diǎn)之一。快速診斷和及時(shí)監(jiān)測(cè)是禽流感防控的首要步驟和重要一環(huán)。目前，有關(guān)禽流感的檢測(cè)方法較多，經(jīng)典的流感病毒病原學(xué)診斷方法中病毒分離及其生物學(xué)特性的研究是最為可行和最能說明問題的，但病毒的分離鑒定需要將病料接種雞胚或組織培養(yǎng)，需要較長(zhǎng)的時(shí)間(幾天到一周)，不能夠滿足急性烈性傳染病緊急疫情防治工作的需要，同時(shí)由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳動(dòng)物的潛在危險(xiǎn)，病毒的操作需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，一般檢疫部門不具備這種試驗(yàn)條件?？焖佟㈧`敏、特異的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)， 如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已經(jīng)在禽流感病毒檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用(Shan, 2003 ；Collins, 2002 ；Wang，2005 ；Spackman，2003 ；Poddar, 2002)。但都需要復(fù)雜的檢測(cè)儀器(如PCR儀，熒光定量PCR儀等)，在一些基層的實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)技術(shù)是一種新的體外擴(kuò)增特異性DNA片段的分子生物學(xué)方法(Notomi，2000)。該方法不需要額外的反轉(zhuǎn)錄步驟，只需要簡(jiǎn)單的水浴鍋，在30-90min內(nèi)即可擴(kuò)增大量的核酸，不需要通過核酸電泳的方法來檢測(cè)結(jié)果，只需通過其副產(chǎn)物-白色的焦磷酸鎂沉淀來觀察結(jié)果(如果加入熒光染料后會(huì)更易觀察)。LAMP所具有的簡(jiǎn)單、快速、高效、實(shí)用的特點(diǎn)，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速診斷。該方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于H5和H9亞型AIV的檢測(cè)。建立一種能夠靈敏、特異的AIV的RT-LAMP檢測(cè)方法的前提是需要針對(duì)H5HA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)得到特異性引物。Imai等建立的H5亞型禽流感的LAMP方法可檢測(cè)到0. 01PFU的病毒含量，對(duì)不同病毒檢測(cè)結(jié)果表明相同濃度的高致病力和低致病力的H5病毒在相同條件下反應(yīng)的起始時(shí)間和靈敏度存在差異(Masaki Imai et al,2006 ；Masaki Imai et al，2007)。禽流感病毒的潛伏期從數(shù)小時(shí)到數(shù)天，最長(zhǎng)可達(dá)21天。禽流感暴發(fā)流行初期，最先做的應(yīng)該是禁止家禽在市場(chǎng)上的流通，實(shí)行區(qū)域封鎖，并尋找病毒的來源。因此對(duì)活禽和野禽的監(jiān)測(cè)顯得尤為重要(Sakar et al，2010)，AIV帶有囊膜，對(duì)消毒劑比較敏感，但在生產(chǎn)實(shí)際中，AIV常從感染禽的鼻腔分泌物中及糞便物中排出，使病毒處于有機(jī)物的保護(hù)之下，可通過空氣、接觸和糞便傳播。據(jù)報(bào)道，試驗(yàn)雞攻毒1 后即可從泄殖腔及喉頭拭子中分離到病毒，持續(xù)到攻毒后第7d左右；攻毒后3 才可以從腦、肝、脾、腎、胰腺的混合樣品中分離到病毒，可持續(xù)到攻毒后第IOd左右(LIA0，et al，2004)，這表明建立一種可在未出現(xiàn)癥狀時(shí)的早期即可檢測(cè)到AIV感染的方法成為一種迫切的需要，從而可真正做到早發(fā)現(xiàn)早防控。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明通過分析流感數(shù)據(jù)庫(kù)中1963年以來分布于世界各地的家雞與野鳥的流感病毒M基因序列，找出M基因保守區(qū)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了通用RT-LAMP特異性引物，表1所示。這些基因序列涵蓋了多種家禽及野鳥的M基因，具有普遍性和代表性。 利用該引物建立的RT-LAMP檢測(cè)對(duì)Hl H16亞型禽流感病毒以及雞新城疫病毒等其他7 種禽病病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該引物組僅能特異性擴(kuò)增禽流感病毒核酸，而不能擴(kuò)增其他病毒核酸，具有很好的特異性。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之一是提供了一種用于禽流感病毒檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP引物由一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成；所述外引物對(duì)序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對(duì)序列為SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對(duì)序列為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示；將SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5SEQ ID No. 6所對(duì)應(yīng)的引物序列分別命名為M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP、M-LB、M-LF ；本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之二是提供了用于禽流感病毒檢測(cè)的方法，其特征在于使用以上所述的引物組進(jìn)行對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增；所述的擴(kuò)增反應(yīng)為62. 5°C反應(yīng)Ih后，80°C作用lOmin，結(jié)束反應(yīng)。
具體的，按照可按照以下方法進(jìn)行1、將下述組分加入到反應(yīng)管中
Reaction Mix12.5 pL
100 ρ mol SEQ ID No. 1 ( M-FIP )0.4 pL
100 ρ mol SEQ ID No.2 ( M-BIP )0.4 μL
10 ρ mol SEQ ID No.3 ( M-F3 )0.5 μL
IOpmol SEQ ID No.4 ( M-B3 )0.5 pL
100 ρ mol SEQ ID No.5 ( M7-LF )0.2 μL
100 ρ mol SEQ ID No.6 ( M-LB )0.2 μ .
Enzyme Mix1 \xL
Fluorescent Detection Reagent1 μ
待檢測(cè)的樣品RNA5 .Ομ
補(bǔ)充 Distilled Water 至25 μL2、將反應(yīng)管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應(yīng)Ih，80°C作用 IOmin結(jié)束反應(yīng)；3、檢測(cè)(1)直觀檢測(cè)反應(yīng)物中加入 1. 0μ L Fluorescent Detection Reagent 染料，即可直接顯示結(jié)果陽性反應(yīng)發(fā)出綠色熒光，陰性反應(yīng)保持原黃色不變；(2)瓊脂糖凝膠電泳用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析陽性反應(yīng)呈現(xiàn)特有的梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無條帶出現(xiàn)。本發(fā)明通過鼻腔接種模仿自然感染，對(duì)感染后不同時(shí)間采取的棉拭子用病毒分離、RT-PCR和本發(fā)明RT-LAMP檢測(cè)方法(以下簡(jiǎn)稱為M-RT-LAMP)進(jìn)行平行檢測(cè)。其中，病毒分離和M-RT-LAMP方法在感染后第1天即可檢測(cè)到病毒，第3天三種方法均可檢測(cè)到病毒。但檢測(cè)所需時(shí)間卻不同，應(yīng)用M-RT-LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)病原僅需要30-60min ；病毒分離方法至少需要2-3d ；RT-PCR方法需要6-^1，用時(shí)雖短但敏感性低于本發(fā)明的M-RT-LAMP 方法。本發(fā)明針對(duì)家禽中流行較為廣泛、危害較大的禽流感病毒的血凝素基因建立了 RT-LAMP檢測(cè)引物組，該引物組對(duì)M AIV RNA的最小檢測(cè)限為0. 1PFU，其敏感性較常規(guī)的 RT-PCR高10倍，可同時(shí)用于高致病力和低致病力AIV的檢測(cè)。通過對(duì)16個(gè)AIV亞型病毒和其他禽病毒病病原RNA的檢測(cè)，表明該方法只能特異性擴(kuò)增AIV，具有良好的特異性。本發(fā)明檢測(cè)引物組特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，為禽流感的防控預(yù)警機(jī)制提供了簡(jiǎn)捷、有效的早期快速診斷途徑。


圖1為M-RT-LAMP的敏感性實(shí)驗(yàn)濁度圖㈧和電泳圖⑶；
1-8 對(duì)應(yīng)的 H5AIV RNA 濃度分別為 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、 0.1PFU、0. 01PFU、0. OOlPFU ；圖2為M-RT-LAMP擴(kuò)增H1-H16特異性試驗(yàn)圖直觀圖㈧和電泳圖⑶；l.MD/HLJ/390/06(HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06(H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06(H3N2)；4. MD/HLJ/499/06(H4N6) ；5. DK/AH/1/06(H5N1) ；6. MD/HLJ/87/06(H6N1)；7. CK/HeB/l/02(H7N2) ；8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1)；9. CK/HuN/33/08(H9N2) ； 10. MD/HLJ/108/06(H10N2) ； 11. MD/HLJ/80/06(H11N2)； 12.A/Duck/Alberta/60/76(H12N5) ； 13.A/gy 1l/Maryland/704/77(H13N6)；14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5) ；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；16. A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02 (H16N3) ；17.陰性對(duì)照?qǐng)D3為M-RT-LAMP擴(kuò)增H1-H16特異性試驗(yàn)濁度圖；l.MD/HLJ/390/06(HlNl) ； 2. MD/HLJ/135/06(H2N2) ； 3. MD/HLJ/90/06(H3N2)；4. MD/HLJ/499/06(H4N6) ；5. DK/AH/1/06(H5N1) ；6. MD/HLJ/87/06(H6N1)；7. CK/HeB/l/02(H7N2) ；8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1)；9. CK/HuN/33/08(H9N2) ； 10. MD/HLJ/108/06(H10N2) ； 11. MD/HLJ/80/06(H11N2)； 12. A/Duck/Alberta/60/76(H12N5) ； 13. A/gy 1l/Maryland/704/77(H13N6)；14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5) ；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；16. A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；圖4為M-RT-LAMP擴(kuò)增其他病原特異性試驗(yàn)直觀圖(A)和電泳圖(B)；M :DL2000 DNA Marker ；1 :H5N1 ；2 雞新城疫病毒(NDV) ；3 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV) ；4 雞傳染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 雞馬立克氏病病毒(MDV) ；6 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) ；7 雞傳染性貧血病毒(CIAV) ；8 雞白血病病毒(ALV)；圖5為M-RT-LAMP擴(kuò)增其他病原特異性試驗(yàn)濁度圖。M :DL2000 DNA Marker ；1 :H5N1 ；2 雞新城疫病毒(NDV) ；3 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV) ；4 雞傳染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 雞馬立克氏病病毒(MDV) ；6 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) ；7 雞傳染性貧血病毒(CIAV) ；8 雞白血病病毒(ALV)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1試驗(yàn)材料和方法1. 1毒株和試劑本試驗(yàn)所用禽流感病毒Hl H16亞型標(biāo)準(zhǔn)參考毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；A/Duck/shanghai/35/2002及其雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒 (ILTV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
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RNA Amplification Kit (RT—LAMP)禾口Fluorescent Detection Reagent購(gòu)自日本榮研公司；RNA gents Total RNA Isolation 系統(tǒng)和 Access RT-PCR 系統(tǒng)均購(gòu)自 Promega 公司。10日齡SPF雞胚、6周齡SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有SPF雞都在負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。1. 2LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成分析了流感數(shù)據(jù)庫(kù)中Hl—H16所有M基因序列的同源性，找出M基因保守區(qū)，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)了 6個(gè)引物，分別是外引物(M-F3(SEQ ID No. 1)和M_B3 (SEQ ID No. 2)), 內(nèi)引物(M-FIP(SEQ D No. 3) ^P M-BIP(SEQ ID No. 4))和環(huán)引物(M-LF(SEQ ID No. 5)和 M-LB(SEQ ID No. 6))(表 1)。表IRT-LAMP引物序列
引物名稱類型長(zhǎng)度(S)序列(5’ to 3，)M-F3正向外引物19- merTGAGTCTTCTAACCGAGGTM-B3反向外引物19--merTACGCTGCAGTCCTCGCTCM-FIP正向內(nèi)引物35.-merTCAAGTCTCTGCGCGATCTACGTACGTTCTCTCTAM-BIP反向內(nèi)引物42.-merGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTGGGCACGGTGAGCGM-LB正向環(huán)引物22-■merACTAAGGGGATTTTAGGATTTGM-LF反向環(huán)引物22·-merCGGCTTTGAGGGGGCCTGACGG1.3RNA 提取RNA的提取采用Trizol LS試劑盒(invitrogen公司)。病毒尿囊液或口咽泄殖腔拭子按常規(guī)處理后，取樣品250μ1，加750μ1 Trizol LS裂解液，混合震蕩5分鐘(盡量保證裂解后的液體透明)，加200 μ 1氯仿，12000轉(zhuǎn)，4°C離心15分鐘，取上清，加500 μ 1異丙醇，室溫沉淀10-15分鐘，12000轉(zhuǎn)，4°C離心15分鐘，棄上清，緩慢加入75%乙醇洗沉淀一次，倒置濾紙吸干管壁余液，真空抽干或37°C烘干，加入無RNA酶的水20 μ 1，_70°C保存1. 4M-RT-LAMP 和 M-RT-PCR 的反應(yīng)體系M-RT-LAMP 反應(yīng)總體積為 25 μ L,組成成分如下Reaction Mix 12. 5 μ L、IOOp mol M-FIP 0. 4 μ LUOOp moI-M BIP 0. 4 μ LUOp mol M-F3 0. 5 μ LUOp mol Μ-Β3 0. 5 μ L, IOOp mol M-LF 0. 2 μ L, IOOp mol M-LB 0. 2 μ L, Enzyme mix 1 μ L,力口入 5. 0 μ L 抽提獲得的RNA到體系中，加Distilled Water至25μ L。置于濁度儀、PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應(yīng)lh，80°C作用IOmin結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)物中加入l.OyL Fluorescent Detection Reagent，艮口可直接 示結(jié)果陽性反應(yīng)發(fā)出綠色熒光，陰性反應(yīng)保持原黃色不變；或用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析陽性反應(yīng)呈現(xiàn)特有的梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無條帶出現(xiàn)。M-RT-PCR的弓丨物序列為M Up :5’ TTC TAA CCG AGG TCG AAA C 3’ ；
M Low 5' AAG CGT CTA CGC TGC AGT CC 3，；擴(kuò)增片段大小為229bp。反應(yīng)總體積為25 μ L，組成成分如下5. 0 μ L 5Χ反應(yīng)緩沖液、0.5yL 10 M d NTPU. 0μ L 15Μ 硫酸鎂、0· 25 μ L 20p mol M Up,0. 25 μ L 20ρ mol M Low.O. 5μ L A MV反轉(zhuǎn)錄酶、0. 5yL Taq DNA聚合酶、14 μ LDEPC處理的滅菌雙蒸水。加入2. 5 μ L RNA到體系，置于PCR儀反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為45°C逆轉(zhuǎn)錄45min，94°C預(yù)變性2min， 94°C 30s,52°C 45s、68°C 45s，；35 個(gè)循環(huán)，最后 68°C延伸 &iiin。PCR 產(chǎn)物用 1. 0% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(Hongmei，et al，2006)。1. 5敏感性試驗(yàn)對(duì)測(cè)定病毒含量的H5亞型標(biāo)準(zhǔn)參考毒株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)(Garten et al,1985)的尿囊液提取核酸，將抽提所得的H5AIV總RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋(分別為 10000PFU、1000PFU、100PFU, 10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU)。對(duì)上述各濃度 RNA 用M-RT-LAMP和M-RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。1. 6特異性試驗(yàn)用該M-RT-LAMP方法分別檢測(cè)Hl H16亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)參考毒株，檢測(cè)不同亞型病毒之間是否存在非特異性擴(kuò)增。檢測(cè)雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)等其他7種禽病病原，檢測(cè) M-RT-LAMP方法的特異性。H5AIV毒株作為陽性對(duì)照。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 1敏感性試驗(yàn)結(jié)果為了檢測(cè)M-RT-LAMP的引物的敏感性，將抽提所得的H5AIV總RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋(分別為 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU)。對(duì)上述各濃度RNA用M-RT-LAMP和M-RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，M-RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果顯示如圖1 所示，1-8 對(duì)應(yīng) RNA 濃度分別為 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、 0. 001PFU,圖I-A為M-RT-LAMP的敏感性實(shí)驗(yàn)濁度圖，圖1_B為M-RT-LAMP的擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。2. 2M-RT-LAMP的特異性結(jié)果為了檢測(cè)M-RT-LAMP的引物的特異性，用RT-LAMP檢測(cè)Hl H16亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考毒株，同時(shí)對(duì)雞新城疫等其他7種禽病也進(jìn)行了檢測(cè)，其染色結(jié)果直觀圖與電泳圖如圖2所示，M-RT-LAMP擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖顯示所有禽流感病毒均有擴(kuò)增曲線，圖3所示，而其他禽病核酸沒有擴(kuò)增出特征性階梯狀條帶和顯示出綠色熒光，圖4所示，實(shí)時(shí)監(jiān)控圖顯示如圖5所示，表明本發(fā)明M-RT-LAMP檢測(cè)方法能特異性擴(kuò)增禽流感病毒，而不與其它亞型的AIV和其它禽病病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，通過對(duì)加入環(huán)引物的前后進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，環(huán)引物的加入可以大大縮短反應(yīng)時(shí)間，由原來的60min可縮短為30min。
權(quán)利要求
1.一種用于禽流感病毒檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP引物由一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成；所述外引物對(duì)序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對(duì)序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對(duì)序列為 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 所示。
2.一種用于禽流感病毒檢測(cè)的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的引物組對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的擴(kuò)增反應(yīng)為62.5°C反應(yīng)Ih后，80°C 作用lOmin，結(jié)束反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1所述的禽流感病毒RT-LAMP引物組在制備檢測(cè)或診斷禽流感病毒的生物試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組用于禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)的引物組，檢測(cè)方法及應(yīng)用。所述的RT-LAMP引物由一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成；所述外引物對(duì)序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，內(nèi)引物對(duì)序列為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，環(huán)引物對(duì)序列為SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。使用所述的引物組即可進(jìn)行對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。使用本發(fā)明的引物組進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，本發(fā)明的引物組可應(yīng)用于制備檢測(cè)或診斷禽流感病毒的生物試劑中，從而為禽流感的防控預(yù)警機(jī)制提供了簡(jiǎn)捷、有效的早期快速診斷途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102230028SQ20111016165
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者包紅梅, 李雁冰, 王秀榮, 田國(guó)彬, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所