專利名稱：一種四聯(lián)菌片及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種菌片及其制備方法，尤其是一種四聯(lián)菌片及其制備方法。屬于保健食品領域，具體涉及四聯(lián)菌片中長雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌四聯(lián)菌片及其制備方法。
背景技術：
健康有益的益生菌如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌等被越來越多地添加到保健食品中，通過其中活菌的作用可以改善胃功能、調整腸道菌群、抑制病原菌的生長、提高蛋白質和維生素的代謝、防止便秘、緩解乳糖不耐癥、抗腫瘤、增強免疫系統(tǒng)、 降低膽固醇等，從而促進身體健康。為了確保此類益生菌能在體內發(fā)揮正常的生理保健功能，一些世界性的食品組織已經(jīng)提出標準，要求在食品中雙歧桿菌等益生菌的最低值為 IO6 107CFU/g。本品采用粉末直接壓片工藝，解決了在傳統(tǒng)的先制粒后壓片技術中益生菌無法存活的問題，采用本技術生產(chǎn)出的產(chǎn)品具有調節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，調節(jié)腸道功能，增強免疫力和預防便秘、腹瀉的療效。技術方案本發(fā)明的目的在于提供一種四聯(lián)菌片及其制備方法。本發(fā)明的一種四聯(lián)菌片，其中，菌粉占產(chǎn)品重量百分比為干酪乳桿菌菌粉1-3%長雙歧桿菌菌粉2-5%嗜酸乳桿菌菌粉1-3%嗜熱鏈球菌菌粉1-3%其它成份為輔料。上述的輔料為矯味劑、粘合劑和助流劑。上述的矯味劑為甜味劑和/或酸味劑。嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)菌種保藏號為CGMCC No. 4472，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2010年12月14日。干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)菌種保藏號為CGMCC No. 1697，保藏單位為 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2006年04月21日。嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcusthermophilus)菌種保藏號為 CGMCC No. 4471，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2010年12月14 曰。長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)菌種保藏號為CGMCC No. 4470，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2010年12月14日。以四聯(lián)菌片為100份計。上述的輔料(重量份)優(yōu)選為葡萄糖25-30，低聚半乳糖 7-15，麥芽糊精18-25，赤蘚糖醇3-9，微晶纖維素5-10，羥丙基纖維素1-3，檸檬酸0. 3-0.8， 香精0. 1-0. 5，低聚異麥芽糖15-20，硬脂酸鎂0. 3-0. 8。
上述四聯(lián)菌片的制備方法，其中第一步分別將原輔料進行過篩，規(guī)格為16-40目；第二步將步驟1中的原輔料除硬脂酸鎂外在混勻機上混勻10-15分鐘，再加入硬脂酸鎂混勻3-5分鐘；第三部將步驟 2中混合物進行壓片，包裝。上述四聯(lián)菌片的制備方法，其中，本發(fā)明產(chǎn)品的片重為0.85g。;本發(fā)明產(chǎn)品的硬度約為40-100N，優(yōu)選發(fā)明產(chǎn)品的硬度約為80N。每天服用4片。本發(fā)明涉及菌種的分類學特征和其他形態(tài)學特征公開如下長雙歧桿菌(BB20071001)，為分離自內蒙古地區(qū)健康人體腸道，篩選出適合人體之菌株，該長雙歧桿菌已于2010年12月14日在國家知識產(chǎn)權局指定專利微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 4470。樣品的采集與保存內蒙古錫盟西烏珠穆沁旗12名健康兒童，男女各6名，年齡 3 5歲，均無胃腸病史，采樣前兩周內未服用任何抗菌類藥物。用無菌玻璃棒挑取自然排出的新鮮糞便5 10g，置入無菌平皿中，迅速放入?yún)捬豕拗校瑤Щ貙嶒炇疫M行分離。菌株篩選1、菌株的分離純化與保存取厭氧凍存的樣品3g加入有玻璃珠的三角瓶中，加入30mLPBS稀釋液搖床振蕩 (250rpm) 15min，然后吸取ImL便液加入一支裝有9mLPBS稀釋液的試管中，漩渦混勻，作為 ΙΟ"2稀釋液，同樣方法稀釋至10_4。取厭氧罐中充分預厭氧的TPY固體平板，將糞便原液、10_2稀釋液、10_3稀釋液、 10_4稀釋液各取0. lmL，均勻涂布平板，置厭氧罐中37°C厭氧培養(yǎng)Mh。在選擇性TPY培養(yǎng)基上，雙歧桿菌的菌落特征較為典型，易與其它菌落區(qū)分開來。 雙歧桿菌的菌落一般為光滑，凸圓，邊緣完整，顏色呈乳褐色或乳白色，直徑2-5mm，具有這些形態(tài)特征的菌落被認為是雙歧桿菌可疑菌落，進一步分離純化得到雙岐桿菌純菌株。將雙歧桿菌純菌株擴培后用PBS溶液離心洗滌兩遍后，懸于保護劑(12%脫脂乳 +0.1%谷氨酸鈉)中，真空冷凍干燥，-18°c保存。2、雙歧桿菌的人工胃液耐受性篩選試驗結果將供試菌株接入pH2. 0、pH2. 5、pH 3. 0人工胃液中，37°C厭氧培養(yǎng)池對其進行活菌計數(shù)，并計算存活率。結果看出，不同菌株在不同PH的人工胃液中耐受性有顯著差異(ρ < 0. 01)。菌株對人工胃液耐受性隨PH降低而降低，其中長雙歧桿菌對人工胃液耐受性最強，在pH2. 0人工胃液中37°C厭氧保溫池后存活率達到92. 4%，而其它10株菌在此條件下的存活率均小于31. 25%，說明這10株菌對模擬胃液特別敏感，沒有進一步篩選的價值， 所以僅選擇具有良好耐酸特性的長雙歧桿菌作為進一步試驗的對象。3、長雙歧桿菌對pH8. 0人工腸液的耐受結果將具有良好耐酸特性的長雙歧桿菌在pH2. 0的人工胃液中厭氧消化池后，接入 PH8. 0的人工腸液中繼續(xù)37°C厭氧保溫消化，分別在不同時間取樣計數(shù)并計算其存活率， 結果可以看出，長雙歧桿菌在PH8.0的人工腸液中37°C厭氧保溫他后，活菌數(shù)與存活率均無明顯差異(P < 0. 05)，該菌株具有良好的耐受腸液特性。分離至兒童糞便中的雙歧桿菌的鑒定結果
1、形態(tài)及菌落特征G+，菌體長而彎曲，棍棒狀，膨脹或啞鈴形的桿菌可分叉，菌落一般為光滑，凸圓， 邊緣完整，顏色呈乳褐色或乳白色，直徑2-5mm。2、生理生化學特性，見表1。表1雙歧桿菌的生理生化鑒定結果
試驗項目試驗結果試驗項目試驗結果D-核糖+甘露糖-L-阿拉伯糖+果唐+乳糖+半乳糖+纖維二糖-蔗糖+松三糖+麥芽糖+棉子糖+海藻湯-山梨醇-密二糖+淀粉-甘露醇+葡萄糖酸鈉-水楊素-木糖(+)注+表示待測菌株陽性(+)表示待測菌株弱陽性-表示待測菌株陰性根據(jù)上表試驗結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，上述得到的該菌株為長雙歧桿菌。長雙歧桿菌的制備方法(以上為重量百分比)1、種子培養(yǎng)基牛肉膏0.25%、乳糖0.8%、酪蛋白胨1%、大豆蛋白胨0.2%、酵母粉0. 3 %、磷酸氫二鈉0. 20%、磷酸二氫鉀0. 25%、硫酸鎂0. 01%、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0. 025%、吐溫-800. 02%、溶解后用25%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH7. 2-7. 4。(注硫酸鎂單獨溶解后加入)。2、發(fā)酵液培養(yǎng)基牛肉膏0.5%、乳糖1%、酪蛋白胨1%、大豆蛋白胨0.5%、酵母粉0. 5 %、磷酸氫二鈉0. 25 %、磷酸二氫鉀0. 25 %、硫酸鎂0. 01 %、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0. 05%、吐溫-800. 025%、溶解后用25%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH7. 2-7. 4。(注硫酸鎂單獨溶解后加入)。121°C15分鐘滅菌。3、發(fā)酵及真空冷凍干燥一級、二級、三級種子接種量為1-7%，37°C進行發(fā)酵，攪拌速度為60轉/分，發(fā)酵液PH恒定在5. 8，0D_2. 0以上鏡檢長雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。得到的發(fā)酵液進行離心，轉速為10000轉/分，要求上清液清澈，得到菌泥。再按照菌泥與保護劑為1 10 的比例進行混合為上機液。保護劑配方各組份重量百分比為谷氨酸鈉1%、乳糖8%、海藻糖4%、脫脂奶粉10%、甘油0. 1 %，其余為水，115°C滅菌15分鐘后冷卻至10°C。上機液真空冷凍干燥工藝為干燥條件-60--40°C預凍1- 后進行真空冷凍干燥，冷凍干燥溫度為_60°C，真空度為l_8pa，真空冷凍干燥1018h，再進行粉碎、混合粉碎粒度為0.4mm，均可通過40目篩，混合均勻后包裝。嗜熱鏈球菌(QH10-4-1)，一種傳統(tǒng)酸奶中分離得到嗜熱鏈球菌，該嗜熱鏈球菌已于2010年12月14日，在國家知識產(chǎn)權局指定專利微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCCNo.4471。菌株的分離純化1.樣品的采集2005年8月12日于內蒙古錫林郭勒盟正藍旗賽音胡都嘎蘇木采集了 3份酸奶樣品，樣品均來自3個不同家庭。采集樣品時將做好的一桶酸奶，攪拌均勻， 用無菌移液器吸取5mL于滅菌離心管中，并封口，每個樣品取三份。將收集到的樣品立即放入冰盒內，間隔一定時間更換冰袋，保持在較低的溫度下將樣品放入4°C冰箱保存，以進行菌株的篩選。2.嗜熱鏈球菌的篩選將酸奶樣品進行稀釋(10_4，ΙΟ"5,10_6)，在Elliker瓊脂培養(yǎng)基上進行涂布，37°C培養(yǎng)M-4 !。對于在Elliker瓊脂培養(yǎng)基上生長的不同菌落進行革蘭氏染色，鏡檢結果革蘭氏陽性菌并且細胞為球形的菌落。3.菌種分離純化用無菌接種針挑取單個菌落接種于Elliker液體培養(yǎng)基中，放入相應的恒溫箱中37°C培養(yǎng)1 Mh。連續(xù)培養(yǎng)三代后，將菌液振蕩混勻，離心洗滌菌體 lOmin，棄上清液，在沉淀中加入5mL滅菌生理鹽水，振蕩混勻，如此重復兩次后即將菌液制成供試菌液。將供試菌液振蕩混勻，涂片，固定，革蘭氏染色，在顯微鏡下仔細觀察并記錄細胞形態(tài)和細菌排列方式。菌落形態(tài)一樣、革蘭氏陽性、球菌分離株進行保存。4.乳酸菌分離株的保存分離純化得到的5株菌在Elliker液體培養(yǎng)基中，37°C、 24h培養(yǎng)2代。4000rpm，離心10mir^4°C )，棄上清液，菌體中加入等量的滅菌生理鹽水，振蕩混勻，4000rpm離心10mir^4°C )離心洗滌菌體，反復3次，棄上清液，加菌體保護液(含 8%乳糖、1 % L-谷氨酰胺鈉、10%脫脂乳、1 % L-半胱氨酸)約2mL，充分混勻，分裝于凍存管中，封口 -40°C冷凍保存。5.耐酸耐膽鹽菌株的篩選向Elliker培養(yǎng)基中加入質量分數(shù)為0. 3%的膽鹽，并調PH值至3.0，將活化好的菌種按5%接種量接于加膽鹽的培養(yǎng)基中；同時，用不加膽鹽、不調PH值的Elliker培養(yǎng)基作對照，培養(yǎng)24h后，涂于Elliker固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，挑出單個菌落接于斜面上備用。表2耐酸耐膽鹽菌株的篩選結果
權利要求
1.一種四聯(lián)菌片，其特征在于菌粉占產(chǎn)品重量百分比為 干酪乳桿菌菌粉 1_3%， 長雙歧桿菌菌粉 2-5%， 嗜酸乳桿菌菌粉 1_3%， 嗜熱鏈球菌菌粉 1_3%， 其它成份為輔料。
2.如權利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 干酪乳桿菌菌種保藏號為CGMCC No. 1697，保藏單位為會普通微生物中心，保藏時間為2006年04月21日。
3.如權利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 長雙歧桿菌菌種保藏號為CGMCC No. 4470，保藏單位為會普通微生物中心，保藏時間為2010年12月14日。
4.如權利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 嗜酸乳桿菌菌種保藏號為CGMCC No. 4472，保藏單位為會普通微生物中心，保藏時間為2010年12月14日。
5.如權利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 嗜熱鏈球菌菌菌種保藏號為CGMCC No. 4471，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2010年12月14日。
6.如權利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于所述的輔料為矯味劑、粘合劑和助流劑，其中，優(yōu)選矯味劑為甜味劑和/或酸味劑。
7.如權利要求6所述的四聯(lián)菌片，其特征在于在100重量份的四聯(lián)菌片中，所述輔料的重量份為葡萄糖25-30，低聚半乳糖 7-15， 麥芽糊精 18-25， 赤蘚糖醇 3-9， 微晶纖維素 5-10， 羥丙基纖維素1-3， 檸檬酸0. 3-0. 8，香精0. 1-0. 5，低聚異麥芽糖15-20， 硬脂酸鎂 0.3-0.8。
8.如權利要求1-7中任意一項所述四聯(lián)菌片的制備方法，其特征在于第一步，分別將原輔料進行過篩，規(guī)格為16-40目；第二步，將步驟1中的原輔料除硬脂酸鎂外在混勻機上混合10-15分鐘，再加入硬脂酸鎂混合3-5分鐘；第三步，將步驟2中混合物進行壓片，包裝。
9.如權利要求8所述四聯(lián)菌片的制備方法，其特征在于所述的四聯(lián)菌片的單位片重為 0. 85g。
10.如權利要求8所述四聯(lián)菌片的制備方法，其特征在于所述的四聯(lián)菌片的硬度約為中國微生物菌種保藏管理委員 中國微生物菌種保藏管理委員 中國微生物菌種保藏管理委員40-100N，優(yōu)選硬度約為80N。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種四聯(lián)菌片及其制備方法，屬于保健食品領域，具體涉及四聯(lián)菌片中長雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌四聯(lián)菌片及其制備方法；該四聯(lián)菌片中，干酪乳桿菌菌粉1-3％、長雙歧桿菌菌粉2-5％、嗜酸乳桿菌菌粉1-3％、嗜熱鏈球菌菌粉1-3％、其它成份為輔料；由于雙歧桿菌和乳酸菌被認為對人體有很多有益的影響，所以通過添加低聚半乳糖和低聚異麥芽糖等益生元物質促進益生菌在人體內的增殖。
文檔編號A23L1/29GK102204679SQ20111016135
公開日2011年10月5日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者劉偉學, 孫潔宇, 李巖巖, 梁春梅, 王瀟瀟, 王秋實, 高杰, 高鵬飛 申請人:高杰