專利名稱：木霉菌-油菜聯(lián)合吸附農(nóng)田土壤重金屬鎘和鋅的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種金屬吸附技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種拮抗木霉菌-甘藍型油菜聯(lián)合吸附農(nóng)田土壤重金屬鎘和鋅的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)田土壤重金屬超標(biāo)污染是農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的源頭障礙，對人體或動物的健康危害很大。20世紀(jì)90年代初通過對占上海郊區(qū)蔬菜種植面積達50. 5%的農(nóng)田土壤重金屬污染物調(diào)查，分析了近20年來上海蔬菜農(nóng)田土壤中重金屬污染物的累積狀況及其累積原因。結(jié)果表明，Cd、Hg和Si是上海蔬菜農(nóng)田土壤中主要的重金屬累積污染物。為了降低重金屬引起的土壤污染，科學(xué)家們提出了物理的、化學(xué)的方法，如客土換土法、沖洗法、 熱處理、固化、玻璃化、電動修復(fù)法等，由于其技術(shù)要求高或經(jīng)濟成本高昂，需要特殊的儀器和專門的技術(shù)人員；而且還會破壞土壤微生物區(qū)系，造成“二次污染”。近年來生物修復(fù) (phytoremediation)已成為經(jīng)濟有效、不會造成二次污染的新的環(huán)境修復(fù)技術(shù)。生物修復(fù)主要包植物修復(fù)和微生物修復(fù)。植物修復(fù)是通過某些植物超量積累某種或某些化學(xué)元素的特點實現(xiàn)的。微生物修復(fù)是通過某種微生物細胞具有富集環(huán)境中重金屬的特點，減少重金屬對環(huán)境的污染。目前國際上一個重要發(fā)展趨勢是將具有高或超富集作用的植物和微生物相結(jié)合進而提高修復(fù)環(huán)境的效率。油菜(Oilseed rape)是中國主要農(nóng)作物之一，在我國大部分地區(qū)廣泛種植，具有吸附，耐受重金屬的潛力。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，蘇德純和黃煥忠000 從1999 年至2000年期間，曾經(jīng)從安徽、湖北等地挑選了 30多個芥菜型油菜品種分別在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)系和香港浸會大學(xué)生物系做耐鎘毒和吸收鎘潛力的水培和土培試驗，篩選出了兩份具有積累吸收鎘特征，同時具有較高生物量的芥菜型油菜(蘇德純，黃煥忠，2002. 油菜作為超積累植物修復(fù)鎘污染土壤的潛力.中國環(huán)境科學(xué)22，34-38)，但芥菜型油菜主要適合于云貴高原區(qū)和蒙新內(nèi)陸區(qū)種植，主要分布在新疆、云南，僅占全國油菜種植面積的 10%，而甘藍型油菜在我國南北方均有種植，占油菜總種植面積的90%，因此篩選適合我國南、北方廣泛種植的高吸附重金屬的甘藍型油菜對于大面積推廣該類土壤修復(fù)技術(shù)具有重要價值。目前基于吸附土壤重金屬為目標(biāo)的甘藍型油菜篩選工作還沒有相關(guān)報道。木霉菌已經(jīng)證明具有吸附金屬的功能(Anand et al.，2006)。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，通過木霉菌促進芥菜型油菜吸附重金屬僅有個別報導(dǎo)，Lixiang Cao等(2008)研究表明與對照相比，Trichoderma atrovirde F6孢子懸液處理芥菜型油菜(Brassica juncea)種子后，提高幼苗莖富集Ni達%，對Cd的富集也有一定程度提高，根對Cd和Ni的富集提高8%和7% (Lixiang Cao, Min Jiang, Zhirui Zeng,Aixue Du,Hongming Tan,Yuhuan Liu,Trichoderma atroviride F6 improves phytoextraction efficiency of mustard(Brassicajuncea(L. )Coss.var. foliosa Bailey) in Cd, Ni contaminated soils Chemosphere 2008，71 :1769-1773)，但該技術(shù)僅適用于芥菜型油菜，而且沒有表明該菌株具有防治油菜土傳病害和后茬作物土傳病害的功能。因此發(fā)展基于拮抗木霉菌輔助甘藍型油菜吸附土壤超標(biāo)重金屬的技術(shù)非常必要，應(yīng)用前景廣闊。本技術(shù)創(chuàng)新點在于利用對土傳病害有拮抗作用的木霉菌與我國普遍種植的甘藍型油菜組配吸附重金屬的共生體，進而提高油菜吸附重金屬的效率，同時又能有效控制油菜菌核病和后茬作物土傳病害的發(fā)生《王晶董金皋陳捷深綠木霉REMI突變菌株H6對黃瓜枯萎病的生物防治，2008河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文》(中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，萬方數(shù)據(jù)檢索系統(tǒng))，實現(xiàn)對農(nóng)田土壤重金屬污染生物修復(fù)與控制土傳病害的雙重目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種木霉菌-油菜聯(lián)合吸附農(nóng)田土壤重金屬鎘和鋅的構(gòu)建方法，實現(xiàn)對農(nóng)田土壤重金屬污染的生物修復(fù)、兼治土傳病害的雙重目的。本發(fā)明方法修復(fù)效果好、費用低、易于管理與操作、不產(chǎn)生二次污染，因此具有很高的田間普遍使用價值。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種吸附重屬拮抗木霉菌株，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum H6)和康氏木霉(Trichoderma koningii P6)，其特征在于，保藏號分別為 CGMCC No. 4869，CGMCCNo. 4870 ；保藏日期為2011年5月18日；保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心。本發(fā)明涉及一種木霉菌-油菜高效吸附重金屬共生體的制備方法，通過將上述吸附重屬拮抗木霉菌株制備的菌劑接種至含有Cd或和油菜菌核病菌麥粒培養(yǎng)物的土壤上，進一步用于栽培甘藍型油菜并得到木霉菌-油菜高效吸附重金屬共生體。所述的吸附重屬拮抗木霉菌株通過將木霉菌孢子在含Si2+或Cd2+的PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)并篩選出去除靶標(biāo)重金屬效率達到40%以上的木霉菌株，然后再與菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)禾口枯萎病鍵抱菌(Fusarium oxysporium)對峙培養(yǎng)，最后蹄選抑菌率達60%以上的菌株得到。所述的木霉菌孢子是指將木霉菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周，用無菌水洗下PDA平板上的分生孢子，制備IO7孢子/mL。 所述的含Si2+或Cd2+的PD培養(yǎng)基是指馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水IOOOmL且Si2+ 或Cd2+的濃度為100mg/L。所述的培養(yǎng)并篩選是指將0. 5mL木霉菌孢子的懸液接種于50mL含Si2+或Cd2+的 PD培養(yǎng)基中，在130rpm振蕩培養(yǎng)3d,然后取5mL培養(yǎng)液IOOOOrpm離心lOmin，取0. 5mL 上清液，加入顯色劑，無離子水定溶至IOmL ；最后采用分光光度計法，在M9nm處測定溶液中Si2+或Cd2+變化的OD值，篩選得到去除靶標(biāo)重金屬效率達到40%以上的吸附菌株。所述的去除靶標(biāo)重金屬效率是指
權(quán)利要求
1.一種吸附重屬拮抗木霉菌株，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum H6)和康氏木霉(Trichoderma koningii P6)，其特征在于，保藏號分別為CGMCC No. 4869，CGMCC No. 4870 ；保藏日期為2011年5月18日；保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心。
2.—種木霉菌-油菜高效吸附重金屬共生體的制備方法，其特征在于，通過將權(quán)利要求1所述的吸附重屬拮抗木霉菌株制備的菌劑接種至含有Cd或Si和油菜菌核病菌麥粒培養(yǎng)物的土壤上，進一步用于栽培甘藍型油菜并得到木霉菌-油菜高效吸附重金屬共生體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的吸附重屬拮抗木霉菌株通過將木霉菌孢子在含Si2+或Cd2+的PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)并篩選出去除靶標(biāo)重金屬效率達到 40%以上的木霉菌株，然后再與菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和枯萎病鐮孢菌 (Fusarium oxysporium)對峙培養(yǎng)，最后篩選抑菌率達60%以上的菌株得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是，所述的木霉菌孢子是指將木霉菌在 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周，用無菌水洗下PDA平板上的分生孢子，制備IO7孢子/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是，所述的含S12+或Cd2+的PD培養(yǎng)基是指 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水IOOOmL且Si2+或Cd2+的濃度為100mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是，所述的培養(yǎng)并篩選是指將0.5mL木霉菌孢子的懸液接種于50mL含Si2+或Cd2+的PD培養(yǎng)基中，在130rpm振蕩培養(yǎng)3d，然后取5mL培養(yǎng)液IOOOOrpm離心lOmin，取0. 5mL上清液，加入顯色劑，無離子水定溶至IOmL ； 最后采用分光光度計法，在M9nm處測定溶液中Si2+或Cd2+變化的OD值，篩選得到去除靶標(biāo)重金屬效率達到40%以上的吸附菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的制備方法，其特征是，所述的去除靶標(biāo)重金屬效率是指 空白對照Cd濃度-菌株處理后溶液的Cd濃度”㈨空白對照Cd濃度O
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的含有Cd或Si和油菜菌核病菌麥粒培養(yǎng)物的土壤通過以下方式得到通過將含濃度為IM的SiS O4 · 7H20或CdSO4 · SH2O溶液與經(jīng)8mm篩的細土反復(fù)混勻，制備含重金屬鹽IOOmg · kg—1，用無離子水最終將土壤濕度調(diào)至20% wt，在室溫下保持1周；然后與油菜菌核病菌麥粒培養(yǎng)物以病菌培養(yǎng)物接種量為 1 % W/W的比例混合，用無菌水將土壤濕度調(diào)至相對濕度60 %。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的接種是指將吸附重金屬的拮抗木霉菌劑按2-3% (W/W)與含有Cd或Si和油菜菌核病菌麥粒培養(yǎng)物的土壤混合。
10.一種吸附重金屬的拮抗木霉菌劑的制備方法，其特征在于，將木霉菌發(fā)酵液 IOOOmL與硅藻土 600g、精麩300g、稻草粉IOOg混合，在25_27°C下發(fā)酵5_7d。
11.一種吸附農(nóng)田土壤重金屬鎘和鋅的方法，其特征在于，通過上述任一權(quán)利要求所述的吸附重屬拮抗木霉菌株實現(xiàn)。
全文摘要
一種金屬吸附技術(shù)領(lǐng)域的拮抗木霉菌-甘藍型油菜聯(lián)合吸附農(nóng)田土壤重金屬鎘和鋅的構(gòu)建方法，通過將吸附重屬拮抗木霉菌株制備的菌劑接種至含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麥粒培養(yǎng)物的土壤上，進一步用于栽培甘藍型油菜并得到木霉菌-油菜高效吸附重金屬共生體。本發(fā)明實現(xiàn)對農(nóng)田土壤重金屬污染的生物修復(fù)、兼治土傳病害的雙重目的，其修復(fù)效果好、費用低、易于管理與操作、不產(chǎn)生二次污染，因此具有很高的田間普遍使用價值。
文檔編號C12R1/885GK102277302SQ20111016104
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者張婷, 李廣記, 王秉麗, 陳捷, 高永東 申請人:上海交通大學(xué)