一種檢測(cè)水體重金屬鎘的微生物學(xué)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水體重金屬鎘的微生物學(xué)方法，具體涉及利用基因工程技術(shù) 改造的大腸埃希氏菌的構(gòu)建方法，及建立其在檢測(cè)水體環(huán)境中重金屬鎘的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬鎘（Cadmium，Cd)是被國(guó)際癌癥研宄署（IARC)歸類(lèi)為第一類(lèi)的人類(lèi)致癌 物；美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃（NTP)也把鎘確認(rèn)為人類(lèi)致癌物。水體重金屬鎘污染已經(jīng)在我國(guó) 局部地區(qū)表現(xiàn)為公害病，如廣東鎘大米事件、廣西龍江鎘污染事件等，引起了人們的高度重 視。鎘在環(huán)境中非常穩(wěn)定，不易被生物降解，在水體和土壤中的含量逐年增加，繼而在一些 植物或動(dòng)物體內(nèi)積累，如鎘污染區(qū)的大米、貝殼類(lèi)海鮮、動(dòng)物肝腎臟等，并通過(guò)食物鏈在人 體內(nèi)蓄積，為目前已知的最易在體內(nèi)蓄積的毒物之一。鎘對(duì)人體毒性很大，對(duì)腎、肺、肝、睪 丸、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性，主要積蓄在腎臟，引起泌尿系統(tǒng)的功能變化，一旦進(jìn) 入人體將很難排除。鎘能夠干擾骨中鈣，如果長(zhǎng)期攝入微量鎘，使骨骼嚴(yán)重軟化，骨頭寸斷， 弓丨起骨痛病，其還會(huì)引起胃臟功能失調(diào)，并干擾人體和生物體內(nèi)鋅的酶系統(tǒng)，導(dǎo)致高血壓癥 上升。隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，鎘及其化合物被廣泛應(yīng)用于電鍍等行業(yè)。鎘對(duì)環(huán)境的污染，主 要是由工業(yè)廢水排放引起（我國(guó)《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》GB8978-1996規(guī)定工業(yè)廢水中鎘 的最高排放濃度為〇. Img · Γ1)。因此，對(duì)環(huán)境水體中重金屬鎘的檢測(cè)顯得尤為必要。
[0003] 目前監(jiān)測(cè)和檢測(cè)重金屬污染物主要有兩種方法：（1)物理化學(xué)分析法，如電感耦 合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS)等，其優(yōu)點(diǎn)是具備 高檢測(cè)靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，最 重要的一點(diǎn)是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是對(duì)環(huán)境重金屬總量進(jìn)行測(cè)定，不能檢測(cè)重金屬 的生物可利用度；（2)基于生物有機(jī)體的微生物法，其一般分為基于質(zhì)粒和基于基因組整 合型兩種。質(zhì)粒整合型具有成本低、特異性強(qiáng)、快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但是基于質(zhì)粒載體的工 程菌株存在細(xì)菌傳代后質(zhì)?？截悢?shù)不均一，數(shù)量過(guò)高或丟失而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)不穩(wěn)定、熒光 本底值高和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不好等缺陷。
[0004] 生物檢測(cè)技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)機(jī)理。對(duì) 于生物檢測(cè)技術(shù)而言需要三種必需的元件：針對(duì)特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的感應(yīng) 器；由感應(yīng)器控制的啟動(dòng)子；受此啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因。在設(shè)計(jì)生物檢測(cè)技術(shù)時(shí)，由于細(xì) 菌具有在環(huán)境中大量存在、生長(zhǎng)快速、低成本及易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn)而受到研宄人員普遍親睞。在 過(guò)去的研宄中利用生物檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大的關(guān)注，至今已 經(jīng)研發(fā)了一系列針對(duì)特定有機(jī)物和無(wú)機(jī)化合物的工程菌株及其產(chǎn)品，如：重金屬、甲苯及其 衍生物等。
[0005] 目前對(duì)鎘離子測(cè)定的生物檢測(cè)技術(shù)也有所研發(fā)，但是目前大腸埃希氏菌對(duì)鎘的具 體耐受機(jī)制仍未清晰，大腸埃希氏菌具有精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)使得細(xì)胞內(nèi)鎘離子保持在較低的 水平，但我們已發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌中負(fù)責(zé)編碼將鎘離子泵出的P-Type ATPase基因 zntA 及其調(diào)節(jié)蛋白基因 zntR。由于zntA基因的啟動(dòng)子對(duì)鎘并非完全特異，它還能被鋅、鉛等 離子非特異性啟動(dòng)，所以不能直接利用zntA基因的啟動(dòng)子來(lái)介導(dǎo)特異反應(yīng)。另?yè)?jù)Kaisa M. Hakkila 等在文獻(xiàn) Cd-specific mutants of mercury-sensing regulatory protein MerR，generated by directed evolution, Appl Environ Microbiol. 2011Sep ；77 (17)： 6215-24.報(bào)道，經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變后的革蘭陰性菌中汞離子調(diào)節(jié)蛋白MerR突變體，能與鎘離 子特異結(jié)合從而特異啟動(dòng)子啟動(dòng)下游基因表達(dá)，其對(duì)鎘離子的特異性已得到證實(shí)。因此我 們將在大腸埃希氏菌工程菌中引入定點(diǎn)突變后的MerR突變體基因 MerR(M)作為鎘離子 特異反應(yīng)蛋白的編碼基因。我們嘗試將異源的調(diào)節(jié)蛋白基因 MerR(M)、啟動(dòng)子pmerR和報(bào) 告基因 gfpmut2融合在一起組成含有雙啟動(dòng)子的檢測(cè)元件，整合到大腸埃希氏菌基因組 中。熒光蛋白基因是常用的報(bào)告基因，此發(fā)明我們將gfpmut2熒光蛋白作為報(bào)告基因用來(lái) 替換啟動(dòng)子下游基因，所以當(dāng)環(huán)境中的鎘離子與調(diào)芐基因結(jié)合后，啟動(dòng)子啟動(dòng)下游熒光蛋 白基因的表達(dá)，從而通過(guò)熒光蛋白熒光強(qiáng)度反應(yīng)鎘離子濃度。這個(gè)機(jī)理提供了一個(gè)很好的 檢測(cè)模式，但鎘是一種常見(jiàn)的劇毒性環(huán)境污染重金屬，大部分細(xì)菌對(duì)鎘具有耐受性以及抗 性，故其敏感性不高。且這些研宄是基于質(zhì)粒作為表達(dá)載體，然而基于質(zhì)粒載體的生物檢 測(cè)元件存在本底值高，細(xì)菌傳代后質(zhì)?？截悢?shù)不均一，數(shù)量過(guò)高或丟失，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)不穩(wěn) 定等缺陷。其作為檢測(cè)鎘的宿主菌會(huì)造成檢測(cè)的不穩(wěn)定和最低檢測(cè)限偏高，這些非常不 利于污染物的檢測(cè)，必須采用新的方法提高生物學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)鎘離子的敏感性，以有效 解決當(dāng)前環(huán)境監(jiān)測(cè)工作中遇到的瓶頸問(wèn)題。Riether K等在文獻(xiàn)Assessment of heavy metal bioavailability using Escherichia coli zntAp ： ：lux and copAp ： ：lux-based biosensors. Applied Microbiology and Biotechnology，2002 ;57 (5-6) :712-6.中構(gòu)建的 基于質(zhì)粒的pZNT-lux的大腸埃希氏菌生物傳感器，其構(gòu)建策略是將大腸埃希氏菌zntA啟 動(dòng)子與luxCDABE基因進(jìn)行基因融合，再連接到pU⑶615質(zhì)粒載體上。其同時(shí)能被鎘、鉛、 汞、鋅誘導(dǎo)發(fā)光，因此，缺乏特異性，且是在野生大腸埃希氏菌基礎(chǔ)上構(gòu)建檢測(cè)鎘離子的模 式生物，存在上述缺陷。在專(zhuān)利《一種檢測(cè)鎘生物可利用度的微生物細(xì)胞傳感器》CN公開(kāi) 號(hào)：102911906A中，大腸埃希氏菌E. coli作為宿主細(xì)胞承載重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒為含有 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu pl258質(zhì)粒鎘抗性操縱子cad的啟動(dòng)子序列、鎘 抗性系統(tǒng)調(diào)控基因 cadC、熒光素酶基因 Iuc和T7終止子串聯(lián)序列的pUC18質(zhì)粒，同樣是基 于質(zhì)粒的微生物傳感器，存在上述基于質(zhì)粒作為表達(dá)載體的多種缺陷，且金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureu p 1258質(zhì)粒鎘抗性操縱子cad，可同時(shí)被鉛、鎘、鋅誘導(dǎo)，缺乏特異性 檢測(cè)鎘的特性。
[0006] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌工程菌株可以克服這些不足，構(gòu)建一種特異、敏感和快 速檢測(cè)鎘的大腸埃希氏菌菌株，為檢測(cè)水體中鎘奠定基礎(chǔ)。經(jīng)檢索本研宄構(gòu)建的工程菌株 在國(guó)內(nèi)外均無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)基因敲除和基因敲入技術(shù)構(gòu)建一種檢測(cè)元件整合到基因組 上的大腸埃希氏菌工程菌株，從而建立一種特異、穩(wěn)定和快速檢測(cè)水體中重金屬鎘的微生 物學(xué)方法，本發(fā)明具體構(gòu)建及熒光檢測(cè)示意圖如附圖1所示。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】
之一：提供一種檢測(cè)水體中重金屬鎘的大腸埃希氏菌工程菌株，本發(fā)明 的大腸埃希氏菌（Escherichia coli)WMC_009,已于2014年9月29日在中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC No. 9747(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)WMC-009,保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9747。
[0009] L 本發(fā)明 E. coli WMC-009CGMCC No. 9747 的構(gòu)建方法如下：
[0010] I. 1基因敲除野生型大腸埃希氏菌基因組中ZntA和ZntR基因
[0011] 采用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸埃希氏菌基因組中兩個(gè)鎘離子"外排泵"基 因：zntA，序列如SEQ ID NO. 1所示和zntR，序列如SEQ ID NO. 2所示，構(gòu)建大腸埃希氏菌 雙基因敲除菌株AzntAAzntR;
[0012] 1. 2構(gòu)建金屬鎘檢測(cè)元件pmerR-MerR(M) -pmerR-gfpmut2融合基因
[0013] 將異源鎘離子調(diào)芐基因 MerR(M)，序列如SEQ ID NO. 5所示，啟動(dòng)子pmerR， 序列如SEQ ID NO. 4所示以及熒光報(bào)告基因 gfpmut2,序列如SEQ ID NO. 3所 示，通過(guò)交叉PCR技術(shù)，構(gòu)建含有雙啟動(dòng)子的重金屬鎘離子特異反應(yīng)的檢測(cè)元件： pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2 融合基因；
[0014] 1. 3采用基因敲入技術(shù)構(gòu)建檢測(cè)重金屬鎘的大腸埃希氏菌工程菌株
[0015] 采用基因敲入技術(shù)將含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因檢測(cè)元件 pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2置換到AzntAAzntR菌株基因組中zntR基因編碼框位 置。具體方法為：通過(guò)交叉PCR技術(shù)，形成含有融合基因 pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2和 zntR 基因兩側(cè)同源臂，的融合片段 zntRj^i-pmerR-MerlUi/D-pmerR-gfpmutZ-zntRcK。，該 DNA融合片段大小約為2. 3kb，zntR基因 N端同源臂基因 zntR-N，序列如SEQ ID NO. 26所 示以及zntR基因 C端同源臂基因 zntR-C，序列如SEQ ID NO. 27所示，然后連接到pKOV條 件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建 pK0V-zntRN()_Ni-pmerR-MerR(M) -pmerR-gfpmutZ-zntRGi-。。打祀載體，并將 該打靶載體轉(zhuǎn)化到△ zntA △ zntR菌株中，通過(guò)溫度及蔗糖的選擇，挑選成功發(fā)生兩次同源 重組的菌株，并進(jìn)一步通過(guò)菌落PCR及測(cè)序鑒定篩選目的菌株。
[0016] 2.本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株可以定量檢測(cè)水體中重金屬鎘的原理如下：
[0017] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株定量檢測(cè)水體中鎘離子是采用pmerR啟動(dòng)子直接 啟動(dòng)gfpmut2基因表達(dá)模式。在此構(gòu)建中，當(dāng)未添加外源性鎘離子時(shí)，E. coli WMC-009基因 組中MerR(M)基因編碼產(chǎn)生的MerR(M)蛋白結(jié)合于pmerR啟動(dòng)子序列區(qū)，阻止GFPmut2表 達(dá)；當(dāng)外源性鎘離子進(jìn)入大腸埃希氏菌胞內(nèi)后，Cd 2+與MerR(M)蛋白結(jié)合，使MerR(M)蛋白 從啟動(dòng)子上脫落，激活E. coli WMC-009基因組中pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2融合基因 的表達(dá)，從而產(chǎn)生GFPmut2蛋白，并且產(chǎn)生的GFPmut2蛋白的量或其熒光強(qiáng)度與鎘離子濃度 呈劑量依賴關(guān)系，所以通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度可以達(dá)到定量檢測(cè)鎘離子濃度的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0018] 之二：建立一種本發(fā)明所構(gòu)建的大腸埃希氏菌菌株檢測(cè)水體中鎘的微生 物學(xué)方法。
[0019] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株檢測(cè)水體中重金屬鎘的應(yīng)用實(shí)施方案如下：
[0020] 1.環(huán)境水體樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
[0021] 取10-50ml待測(cè)環(huán)境水體樣品，12, OOOg離心5min，取上清，用0. 5M稀鹽酸或氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)上清樣品的pH值為6-8,再用0. 22 μ m的無(wú)菌針頭濾器過(guò)濾，過(guò)濾后樣品用于 后續(xù)的測(cè)定。
[0022] 2. LB培養(yǎng)基的配制：
[0023] LB 培養(yǎng)基組份濃度為 I % (W/V) Tryptone、0· 5 % (W/V) Yeast Extract、I % (W/V) 似〇1、80%(￥/￥)去離子水，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫，加入10%(￥八）體積？!17.2的 400mmol/L的無(wú)菌MOPS緩沖液后均勾混合。
[0024] 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：
[0025] 把鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌MilliQ級(jí)的純水稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取?br>[0026] 3.1從保存的甘油菌E.coliWMC-009菌株中取5-10μl接入新鮮5mlLB培養(yǎng)基， 37°C，250rpm過(guò)夜培養(yǎng)；
[0027] 3. 2取5-10μ 1步驟3. 1的E. coli WMC-009過(guò)夜菌加入到LB培養(yǎng)基中，37°C， 250rpm，恒溫震蕩培養(yǎng)至OD6J直在0· 02-0. 6, OD 6(J直0· 3時(shí)為最佳值，取90-900 μ 1菌液 分裝至96孔透明底黑色微孔板或15 X 150_規(guī)格的檢測(cè)管內(nèi)，同時(shí)在每個(gè)檢測(cè)孔或檢測(cè)管 內(nèi)加入10-100 μ 1鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)品，另加等體積無(wú)菌MilliQ級(jí)純水作為陰性對(duì)照，每種水 體樣品或標(biāo)準(zhǔn)品各做3個(gè)平行孔或3個(gè)平行管，37°C、250rpm振蕩孵育2-6h，最佳孵育時(shí)間 為5h ;
[0028] 3. 3將步驟3. 2經(jīng)誘導(dǎo)后的菌液，4, OOOrpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌 體重懸于Iml DB緩沖液中，制成菌懸液，其中DB緩沖液含有500mMNaCl、20mM Tris-HCl、 20 μ g/ml氯霉素并調(diào)節(jié)pH至8· 0 ;
[0029] 3. 4將步驟3. 3的菌懸液稀釋0-20倍，使E. coI i WMC-009全細(xì)胞懸浮液的 0D_< 0. 3,混勻，分別測(cè)量其稀釋液OD 6(J直與熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為481nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 510nm ；
[0030] 3. 5數(shù)據(jù)處理：
[0031] 相對(duì)焚光值（Relative fluorescence unit，RFU) :RFUM= F M/0D6_，F(xiàn)m為與鎘單 元素標(biāo)準(zhǔn)品孵育E. coli WMC-009菌懸液的熒光值，0D_M為與鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)品孵育E. coli WMC-009菌懸液的吸光度；RFUw= F W/0D6QQW，F(xiàn)w為與MilliQ級(jí)純水孵育E. coli WMC-009菌 懸液的背景熒光值，OD6tltiw為與Mi