專利名稱：小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療領(lǐng)域，具體涉及到小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重威脅到人類的身體健康，已經(jīng)是人類致死的一大原因，除了手術(shù)、化放療外還沒有發(fā)現(xiàn)有效的治療方法，探索新的治療方法顯得極為重要?；蛑委熓墙陙砼d起的一種新手段，在惡性腫瘤治療中成為最有希望的方案之一?；蛑委煼譃椴《据d體和非病毒載體，其中病毒載體的應(yīng)用最廣泛，最引人注目的病毒載體是條件復(fù)制型腺病毒載體(Conditionally Replicating oncolytic Adenoviral Vector, CRAd)。這類載體可以選擇性地在腫瘤組織中擴增，大量擴增的病毒最終可將腫瘤殺死，因此具有明顯的抗腫瘤活性。CRAd5載體大致可分為三種類型一類是利用腫瘤特異性啟動子控制病毒復(fù)制所必需的基因。例如Ad5-hTERT-ElA，是用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT)啟動子取代腺病毒 ElA(Early Transcription Units)基因自身的啟動子構(gòu)建而成，該腺病毒可特異地在腫瘤細胞中擴增，并殺死腫瘤細胞。一類是刪除一些特定基因，這些特定基因是病毒在正常細胞中復(fù)制所必需、而在腫瘤細胞中復(fù)制非必需的。 另外是ElB-55kD缺失的溶瘤腺病毒CRAd5-ElBA55KD，可以選擇性地在p53功能異常的腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制并破壞腫瘤細胞，卻不能在正常細胞內(nèi)復(fù)制。這是因為CRAd5-ElBA55KD喪失了 ElB-55kD的活性而不能結(jié)合并失活宿主細胞的p53功能，因而在p53功能正常的細胞(如正常細胞)內(nèi)不能復(fù)制，而在P53功能異常細胞(如腫瘤細胞)內(nèi)則可以大量復(fù)制。 另一類是將負責(zé)編碼Ad5ElA區(qū)的120 127位氨基酸的M個堿基對序列(919_94;3bp)去除，構(gòu)建的一種新型溶瘤腺病毒CRAd5-DM。腺病毒的ElA能夠結(jié)合成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein, Rb，一種重要的抑癌基因)并使之失活，釋放E2F(細胞從 Gl期進入S期的一種轉(zhuǎn)錄因子)，使細胞從Gl期進入S期，腺病毒因而可以復(fù)制并將宿主細胞溶解。CRAd5-DM不能結(jié)合Rb使其失活，導(dǎo)致宿主細胞不能進入細胞分裂周期，因此 CRAd5-D24僅能在Rb異常的腫瘤細胞中復(fù)制產(chǎn)生殺傷作用。但由于這類病毒載體自身的一些不足，例如對腫瘤組織感染效率低及表達治療基因的數(shù)目有限等，從而導(dǎo)致治療效果并不十分明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于克服上述條件復(fù)制型腺病毒載體的缺點，提供一種對腫瘤組織感染效率高、能增加載體外源基因表達數(shù)目的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于提供一種方法簡單、操作簡便的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所要解決的還有一個技術(shù)問題在于為小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體提供一種新用途。解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是在人腺病毒5型基因組2245bp_3327b之間有1083bp堿基的缺失，在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達第一外源基因的表達元件，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處，插入編碼含有一個小肽序列，在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達第二外源基因與eGFP的表達元件；上述的小肽序列為RGD、SIKVAV、YGRKKRRQRRR、NGR、pK7序列中的任意一個。本發(fā)明的在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達第一外源基因的表達元件中的第一外源基因是Arresten、Trail、Endostatin、Canstatin、 tumostatin中的任意一種。本發(fā)明的在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達第二外源基因與eGFP的表達元件中的第二外源基因是IL-24、Trail, Endostatin、Canstatin、 tumostatin的任意一禾中。上述的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法由下述步驟組成1、構(gòu)建pAd5 ElB 55kd缺失的穿梭載體以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR反應(yīng)模板，引物)(bal A序列為 GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG 與引物 XbaI B 序列為 TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT 進行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段，該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為719bp。以引物BglII A序列為ATAAAGGATAAATG GAGTGAAGAAACCCATCTGAG 和引物 BglII B 序列為 GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA 進行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為270bp，將上述兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合作為模板，以引物)(bal A序列為GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG與引物BglIIB序列為GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA進行第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為95^p，得到第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，將聚此片段與pGEMT-T easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci細胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆經(jīng))(bal和BglII雙酶切，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后得到的片斷與用)(bal和BglII雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pHElB55D shuttle，獲得 pAd5ElB 55kd缺失的穿梭載體。2、構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因的穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增第一外源基因，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ 第一外源基因；將第一外源基因的片段從PGEMT/第一外源基因上經(jīng)ClaI和Not I雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的pAd5.ElB55kd shuttle進行連接，連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達第一外源基因的Ad5El區(qū)穿梭載體，命名為PHE1B55D-第一外源基因 shuttle。3、構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架將kal線性化的PHE1B55D-第一外源基因shuttle的穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BJ5183，將菌液涂布在含有100μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架，命名為PHE1B55D_第一外源基因 /SwaI載體。4、構(gòu)建pshuttle Ad5_E4-fiber-小肽序列穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開放讀碼框的兩端通過基因突變的方式產(chǎn)生兩個單一的酶切位點^CbaI及Sful，然后將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點中，所獲得的卡那抗性載體與Ec0RI-HindIII 1 inker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增位于Ad5E4區(qū)3'端上游2.01Λ的片段，基因片段兩端分別含有 I^cI與SwaI位點，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點中，得到的載體稱為 pshuttle Ad5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增Ad5纖維蛋白3'端上游2. 01Λ的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3'載體相應(yīng)的酶切位點中，獲得的新載體稱為pshuttleAd5-E4-fiber，通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，將小肽序列插入以上載體的fiber中，獲得的載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列。5、構(gòu)建表達eGFP及第二外源基因的穿梭載體pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增miniCMV-SV40表達元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與 PGEMT-T easy載體連接，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動子穿梭載體進行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為ρshu111 e-Bio-PGK-eGFP-miηiCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增第二外源基因，擴增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pGEMT/第二外源基因，將第二外源基因片段從 pGEMT/第二外源基因上經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切下來，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40進行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達eGFP及第二外源基因的雙向啟動子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；將 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因經(jīng) BamHI 及SfuI雙酶切末端補平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭載體進行連接，獲得的陽性克隆為表達eGFP及第二外源基因的腺病毒E4-fiber穿梭載體，命名為pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4_fiber_小肽序列；6、制備條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因用XhoI線性化的pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因_E4-fiber_小肽序列的穿梭載體與SwaI線性化的PHE1B55D-第一外源基因/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1 共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183，通過酶切及測序獲得陽性克隆，所得到的載體命名為PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因；采用磷酸鈣法將I^acI線性化的表達綠色熒光蛋白的PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因的條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)染 HEK 293細胞系，經(jīng)過7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴增，通過兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的表達綠色熒光蛋白的的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒 HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因，-80°C冰箱內(nèi)保存。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤藥物中的用途。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肝癌藥物中的用途。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療胃癌藥物中的用途。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肺癌藥物中的用途。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療乳腺癌藥物中的用途。小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療黑色素瘤藥物中的用途。本發(fā)明在Ad5_ElB55kd條件復(fù)制型腺病毒載體的基礎(chǔ)上，經(jīng)過兩方面的改造以提高增加載體外源基因的表達數(shù)目個)，對病毒載體進行修飾以提高其感染效率。采用本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體，經(jīng)藥效試驗表明，條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對惡性腦膠質(zhì)瘤細胞、肝癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞有明顯的抑制作用。


圖1是實施例1條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對惡性腦膠質(zhì)瘤細胞生長抑制作用。圖3是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對肝癌細胞生長抑制作用。圖4是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對胃癌細胞生長抑制作用。圖5是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對肺癌細胞生長抑制作用。
圖6是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對結(jié)腸癌細胞生長抑制作用。圖7是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對乳腺癌細胞生長抑制作用。圖8是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體在體外對黑色素瘤細胞的生長抑制作用。圖9是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體在體內(nèi)對黑色素瘤細胞生長抑制作用。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體如下1、在人腺病毒5型基因組2245bp_3327b之間有1083bp堿基的缺失，所缺失的序列如下ATGTTGTACAGGTGGCTGAACTGTATCCAGAACTGAGACGCATTTTGACAATTACAGAGGATGGGCAGG GGCTAAAGGGGGTAAAGAGGGAGCGGGGGGCTTGTGAGGCTACAGAGGAGGCTAGGAATCTAGCTTTTAGCTTAATGACCA GACACCGTCCTGAGTGTATTACTTTTCAACAGATCAAGGATAATTGCGCTAATGAGCTTGATCTGCTGGCGCAGAAGTATT CCATAGAGCAGCTGACCACTTACTGGCTGCAGCCAGGGGATGATTTTGAGGAGGCTATTAGGGTATATGCAAAGGTGGCAC TTAGGCCAGATTGCAAGTACAAGATCAGCAAACTTGTAAATATCAGGAATTGTTGCTACATTTCTGGGAACGGGGCCGAGG TGGAGATAGATACGGAGGATAGGGTGGCCTTTAGATGTAGCATGATAAATATGTGGCCGGGGGTGCTTGGCATGGACGGGG TGGTTATTATGAATGTAAGGTTTACTGGCCCCAATTTTAGCGGTACGGTTTTCCTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACG GTGTAAGCTTCTATGGGTTTAACAATACCTGTGTGGAAGCCTGGACCGATGTAAGGGTTCGGGGCTGTGCCTTTTACTGCT GCTGGAAGGGGGTGGTGTGTCGCCCCAAAAGCAGGGCTTCAATTAAGAAATGCCTCTTTGMAGGTGTACCTTGGGTATCC TGTCTGAGGGTAACTCCAGGGTGCGCCACAATGTGGCCTCCGACTGTGGTTGCTTCATGCTAGTGAAAAGCGTGGCTGTGA TTAAGCATAACATGGTATGTGGCAACTGCGAGGACAGGGCCTCTCAGATGCTGACCTGCTCGGACGGCAACTGTCACCTGC TGAAGACCATTCACGTAGCCAGCCACTCTCGCAAGGCCTGGCCAGTGTTTGAGCATAACATACTGACCCGCTGTTCCTTGC ATTTGGGTAACA
GGAGGGGGGTGTTCCTACCTTACCAATGCAATTTGAGTCACACTAAGATATTGCTTGAGCCCGAGAGCA TGTCCAAGGTGAACCTGAACGGGGTGTTTGACATGACCATGA。2、在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達Arresten的表達元件，該表達元件序列為AGCCTGCAGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAAT GGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGC TATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCC CATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATGGT ACCGTTTAAACTCGAGGTCGACGGTATCGATatgTCTGTTGATCACGGCTTCCTTGTGACCAGGCATAGTCAAACAATA GATGACCCACAGTGTCCTTCTGGGACCAAAATTCTTTACCACGGGTACTCTTTGCTCTACGTGCAAGGCAATGAACGGG CCCATGGACAGGACTTGGGCACGGCCGGCAGCTGCCTGCGCAAGTTCAGCACAATGCCCTTCCTGTTCTGCAATATTAA CAACGTGTGCAACTTTGCATCACGAAATGACTACTCGTACTGGCTGTCCACCCCTGAGCCCATGCCCATGTCAATGGCA CCCATCACGGGGGAAAACATAAGACCATTTATTAGTAGGTGTGCTGTGTGTGAGGCGCCTGCCATGGTGATGGCCGTGC ACAGCCAGACCATTCAGATCCCACCGTGCCCCAGCGGGTGGTCCTCGCTGTGGATCGGCTACTCTTTTGTGATGCACAC CAGCGCTGGTGCAGAAGGCTCTGGCCAAGCCCTGGCGTCCCCCGGCTCCTGCCTGGAGGAGTTTAGAAGTGCGCCATTC ATCGAGTGTCACGGCCGTGGGACCTGCAATTACTACGCAAACGCTTACAGCTTTTGGCTCGCCACCATAGAGAGGAGCG AGATGTTCAAGAAGCCTACGCCGTCCACCTTGAAGGCAGGGGAGCTGCGCACGCACGTCAGCCGCTGCCAAGTCTGTAT GAGAAGAACATAAACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGG ACAAACCACA
ACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATT ATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTT TTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG TGAAAACCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCG TCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGC。3、在人腺病毒5型基因組第32679bp處即纖維蛋白HI loop處，插入編碼含有RGD 的序列，該序列為 Tgt gac tgc cgc gga gac tgt ttc tgc。4、在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達IL-M與eGFP的表達元件。其序列如下CCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCC CCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTG GGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGtcta gaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTT CTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGG GGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATG CCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCC GTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCT TGTAGTTGCCG TCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGC TGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGG CAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGA ACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACC ATctcgagATACAGCTCCACCGCACATGCCACCCTCCGGATATATTCGTCTCGAGCAAATCACTCGAGTATGTCGAGGTG GCGTGTACGGT
GGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGTTGGCAGTCTAGCGgctagcATACCGGGTAGGGGAGG CGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCT CGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCC CCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGGAGTAGCACGTCTCACTACTA GCTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCMTGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTG CTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGG GCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCA TCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCatcgatATGAATTTTCAACAGAGGCTGCAAAGCCTGTGGACTTTAGCCAGACCC TTCTGCCCTCCTTTGCTGGCGACAGCCTCTCAAATGCAGATGGTTGTGCTCCCTTGCCTGGGTTTTACCCTGCTTCTCTG GAGCCAGGTATCAGGGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACTTTGGGCCCTGCCAAGTGAAGGGGGTTGTTCCCCAGAAACTGT GGGAAGCCTTCTGGGCTGTGAAAGACACTATGCAAGCTCAGGATAACATCACGAGTGCCCGGCTGCTGCAGCAGGAGGTT CTGCAGAACGTCTCGGATGCTGAGAGCTGTTACCTTGTCCACACCCTGCTGGAGTTCTACTTGAAAACTGTTTTCAAAAA CTACCACAATAGAACAGTTGAAGTCAGGACTCTGAAGTCATTCTCTACTCTGGCCAACAACTTTGTTCTCATCGTGTCAC AACTGCAACCCAGTCAAGAAAATGAGATGTTTTCCATCAGAGACAGTGCACACAGGCGGTTTCTGCTATTCCGGAGAGCA TTCAAACAGTTGGACGTAGAAGCAGCTCTGACCAAAGCCCTTGGGGAAGTGGACATTCTTCTGACCTGGATGCAGAAATT CTACAAGCTCTGAactagtCACAGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAG AATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAAC AAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAAC CTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATG CAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAG上述的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體的構(gòu)建方法步驟如下1、構(gòu)建pAd5 ElB 55kd缺失的穿梭載體以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR反應(yīng)模板，Ad5基因組質(zhì)粒為市場上銷售的商品，弓丨物 XbaI A 序列為 GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG 與 Xl^aI B 序列為 TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT,進行第一次 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C、2 分鐘，94°C、 50秒，55°C、60秒，72°C、45秒，30個循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段，該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為719bp。以引物BglIIA序列為ATA AAGGATAAATGGAGTGAAGAAACCCATCTGAG 和引物 BglIIB 序列為 GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCT ATACAACA進行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件為94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C、60秒， 72°C、20秒，30個循環(huán)，所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為270bp。將上述兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合作為模板，以引物)(bal A序列為GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG與引物BglIIB序列為GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA進行第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為95^p，得到第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。將此片段與PGEMT-T eaSy載體連接。連接條件是2μ 1酶切純化片段，1 μ 110 X Τ4連接酶緩沖液，1 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水，16°C 連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細胞，并涂布于含有I00 μ g/ml的氨芐青霉素的 LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆經(jīng)^CbaI和 BglII雙酶切，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后得到的片斷與用^CbaI和BglII雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進行連接。連接條件是2μ 1酶切純化片段，1μ 1 10ΧΤ4 連接酶緩沖液，Ιμ 酶切載體，0.5μ1 Τ4連接酶，5.5μ1三蒸水。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pHElB55D shuttle。此載體為獲得的Ad5ElB 55kd缺失的穿梭載體。2、構(gòu)建 pHElB55D_Arresten 的穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增Arresten基因，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增條件94°C、5分鐘，94°C、30秒，55°C、30秒，72°C、1分鐘。使用伯樂聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增儀，30個循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Dffia，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/Arresten。將Arresten片段從pGEMT/Arresten 上經(jīng)ClaI和NotI雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的pAd5. ElB55kdshuttle進行連接。連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒 DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達Arresten的Ad5El區(qū)穿梭載體，命名為 pHElB55D_Arresten shuttle。3、構(gòu)建PHE1B55D-Arresten/Swal的腺病毒載體骨架將kal線性化的pHElB55D_Arresten shuttle的穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BJ5183，將菌液涂布在含有 100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，16 M小時后，挑取菌落，接種到100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為pHElB55D-Arresten/SWaI的腺病毒載體骨架，命名為 pHElB55D-Arresten/SwaI 載體。4、構(gòu)建 pshuttle Ad5_E4-f iber-RGD 穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開放讀碼框(ORF)的兩端通過基因突變的方式產(chǎn)生兩個單一的酶切位點OCbaI及SfuI)，將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點中，所獲得的卡那抗性載體與 EcoRI-HindIII linker (EcoRI PacI SwaI SpeI HindIII) 連接，所獲得的載體命名為pUCKanEHL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增位于Ad5E4區(qū)3‘端上游約 2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有I^cI與SwaI位點，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點中，由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E4-3'。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增Ad5纖維蛋白3'端上游約2. 01Λ的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點。將此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3'載體相應(yīng)的酶切位點中，所獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber，然后通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，將RGD插入以上載體的fiber中，獲得的載體稱為 pshuttle Ad5-E4-fiber-RGD。5、構(gòu)建表達 eGFP 及 IL-24 的穿梭載體 pshuttle Ad5_CMVeGFP/ IL-24-E4-fiber-RGD通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增miniCMV-SV40表達元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C、30秒，72°C、40秒，30個循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與pGEMT-T eaSy載體連接。連接條件是2 μ 1酶切純化片段，1 μ 110XT4連接酶緩沖液，1 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水，16°C連接12小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci細胞，并涂布于含有100yg/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒 DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pGEMT/miniCMV-SV40。將 miniCMV-SV40片段從pGEMT/miniCMV-SV40上經(jīng)ClaI和NotI雙酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動子穿梭載體進行連接，連接條件是2μ 1酶切純化片段，Iy 1 10ΧΤ4連接酶緩沖液，1 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1 Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水。連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40穿梭載體。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法擴增IL-M基因，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增條件94°C、5分鐘，94°C、30秒，55°C、30秒，72°C、1分鐘。使用伯樂聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增儀，30個循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Dffia，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/IL-M。將IL-M片段從pGEMT/IL-M上經(jīng)BioI 和^CbaI雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的psh uttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40進行連接。連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達eGFP及IL-24的雙向啟動子穿梭載體,命名為 pshuttle-Bio-eGFP-IL-24。將 pshuttle-Bio-eGFP-IL-24 經(jīng) BamHI 及 SfuI 雙酶切末端補平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭載體進行連接，所獲得的陽性克隆為表達eGFP及IL-24的腺病毒E4_fiber穿梭載體，此載體命名為pshuttleAd5_CMVeGFP/ IL-24E4-fiber-RGDο
6、制備條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體XhoI 線性化的 pshuttle Ad5-CMVeGFP/IL-24-E4-fiber-RGD 穿梭載體與 SwaI 線性化的pHElB55D-Arresten/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183, 通過酶切及測序獲得陽性克隆，所得到的載體稱為PHE1B55D-RGD. IL-24/Arresten見圖1。 采用磷酸鈣法將I^acI線性化的表達綠色熒光蛋白和Arresten的PHE1B55D_RGD. IL-24/ Arresten條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK 293細胞系。經(jīng)過7 10天后，可見明顯的細胞病變，然后經(jīng)過離心收獲病毒原液，經(jīng)過2 3輪的病毒擴增后，進一步將所獲得的病毒原液感染10個150cm的細胞培養(yǎng)平皿，擴增獲得足夠量的病毒原液用于后續(xù)的進一步純化。感染的病毒的細胞經(jīng)37°C /酒精干冰反復(fù)凍融3次，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，通過兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的條件復(fù)制型腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/ Arresten,并于_80°C冰箱內(nèi)保存。實施例2本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Trail載體如下實施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達Arresten的表達元件中的Arresten第一外源基因用Trail替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Trail載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例3本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Endostat in載體如下實施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達Arresten的表達元件中的Arresten第一外源基因用Endostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Endostat in載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例4本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Canstatin載體如下實施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達Arresten的表達元件中的Arresten第一外源基因用Canstatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Canstatin載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例5本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/tumostatin載體如下實施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達Arresten的表達元件中的Arresten第一外源基因用tumostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/tumostatin載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例6本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Trail/Arresten載體如下實施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達IL-M與eGFP 的表達元件中的IL-M第二外源基因Trail替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Trail/Arresten載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例7本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Endostatin/Arresten載體如下實施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達IL-M與eGFP 的表達元件中的IL-M第二外源基因Endostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Endostatin//Arresten載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例8本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Canstatin/Arresten載體如下實施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達IL-M與eGFP 的表達元件中的IL-M第二外源基因用Canstatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Canstatin/Arresten載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例9本實施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. tumostatin/Arresten載體如下實施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達IL-M與eGFP 的表達元件中的IL-M第二外源基因用tumostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. tumostatin/Arresten載體。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例10以上的實施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用SIKVAV序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實施例相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例11以上的實施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用YGRKKRRQRRR序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實施例相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例12以上的實施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用NGR序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實施例相同。其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例13以上的實施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用pK7序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實施例相同。
其構(gòu)建方法與實施例1相同。實施例14有效成分小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的藥用常規(guī)制劑含作為活性成分的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機或無機固體或液體賦形劑混合，在制劑中，活性成分的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體含量為95%。為了驗證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實施例1的條件復(fù)制型腺病毒 HE1B55D-RGD. IL24/Arresten 載體(以下簡稱 HE1B55D-RGD. IL24/Arresten)進行了藥效試驗，各種試驗情況如下1、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對惡性腦膠質(zhì)瘤細胞生長抑制作用采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法檢測 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系U87增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系U87，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1 X IO30HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 10M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系U87，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液 (PBS)處理作為對照組。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系U87生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用統(tǒng)計產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件(SPSS) 13.0軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖2。由圖2可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系U87增殖具有明顯的抑制作用。2、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對肝癌細胞生長抑制作用采用MTT方法檢測HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對肝癌細胞系H印G2增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的肝癌細胞系H印G2，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染肝癌細胞系IfepG2，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對照組。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對肝癌細胞系IfepG2生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖3。由圖3可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對肝癌細胞系IfepG2增殖具有明顯的抑制作用。3、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對胃癌細胞生長抑制作用采用MTT方法檢測HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對胃癌細胞系BGC-823增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的胃癌細胞系BGC-823，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染胃癌細胞系BGC-823，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對照。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對胃癌細胞系BGC-823生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖4。由圖4 可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對胃癌細胞系BGC-823增殖具有明顯的抑制作用。4. HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對肺癌細胞生長抑制作用采用MTT方法檢測HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對肺癌細胞系A(chǔ)549增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的肺癌細胞系A(chǔ)549，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染肺癌細胞系A(chǔ)549，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對照。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對肺癌細胞系A(chǔ)549生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖5。由圖5 可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對肺癌細胞系A(chǔ)549增殖具有明顯的抑制作用。5、HE1B55D-RGD. IL24/Arresten對結(jié)腸癌細胞生長抑制作用采用MTT方法檢測HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對結(jié)腸癌細胞系Caco2增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細胞系Caco2，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染結(jié)腸癌細胞系Caco2，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對照。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對結(jié)腸癌細胞系Caco2生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖6。由圖6 可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對結(jié)腸癌細胞系Caco2增殖具有明顯的抑制作用。6、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對乳腺癌細胞生長抑制作用采用MTT 方法檢測 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞系MDA-MB-231，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1 X IO30HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 10M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染乳腺癌細胞系MDA-MB-231，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對照。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對乳腺癌細胞系 MDA-MB-231生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖7。由圖7 可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖具有明顯的抑制作用。7、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten在體外對黑色素瘤細胞的生長抑制作用采用MTT方法檢測HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對黑色素瘤細胞系 B16F10-G5-luc增殖的影響，具體操作如下(1)接種細胞取對數(shù)生長期的黑色素瘤細胞系B16F10-G5-1UC，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1X103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 10M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對照病毒感染黑色素瘤細胞系B16F10-G5-1UC，每組設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對照。分別在M小時，48小時及72小時后檢測以上病毒載體對黑色素瘤細胞系B16F10-G5-luc生長的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結(jié)果見圖8。由圖8 可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對黑色素瘤細胞系B16F10-G5_luc增殖具有明顯的抑制作用。8、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 在體內(nèi)對 B16F10-G5_luc 黑色素瘤細胞生長抑制作用取處于對數(shù)生長期的B16F10-G5-1UC黑色素瘤細胞，用PBS洗滌后經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 2%胰酶消化，PBS吹打懸浮細胞，4°C，2000g離心lOmin，棄上清；用無血清培養(yǎng)液重懸細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)，制備成6. 6 X IO6VL的細胞懸液，并按ImL每支分裝至1. 5mL EP管中。取健康純種4-6周齡Balb/c雌性裸鼠49只，在本實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進行動物實驗，動物試驗根據(jù)NIH試驗動物的護理和使用指導(dǎo)說明實施。先用75%酒精在其右后肢消毒，進行乙醚吸入麻醉，細胞懸液搖勻后進行皮下注射，按150 μ L(細胞總數(shù)為 IX IO6)/只進行注射。每天觀察皮下成瘤情況。皮下接種4天，裸鼠皮下出現(xiàn)直徑5mm的黑色硬結(jié)，即為種植瘤生長。49只裸鼠隨機分成7組，每組7只。重組腺病毒基因治療抗腫瘤實驗方案如下各組均使用瘤體內(nèi)注射，每只裸鼠注射病毒總量均為2X109空斑形成單位 (Plaque Forming Units，PFU)，隔日注射1次，共注射4次，每次劑量為5X IO8PFU。開始治療后，每隔一天進行移植瘤的體積測量，根據(jù)移植瘤的長徑(a)、短徑(b)，按公式計算瘤體體積(V = aXb2/2)，繪制腫瘤體積-時間變化曲線。以對照組裸鼠平均體積超過3，000mm3 時，作為實驗終點。結(jié)果顯示各組裸鼠皮下種植瘤的體積均有增加，但是在同一個檢測時間點比較 (如注射腫瘤細胞后的第16天時)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten組比對照組Ad5. eGFP的腫瘤生長緩慢，實驗結(jié)果見圖9，由圖9可見，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten具有更強腫瘤抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，其特征在于在人腺病毒5型基因組2245bp-3327b之間有1083bp堿基的缺失，在人腺病毒5型基因組2245bp 與3327bp之間處插入一個表達第一外源基因的表達元件，在腺病毒5型基因組第32679bp 處即纖維蛋白HIloop處，插入編碼含有一個小肽序列，在人腺病毒5型基因組32787bp 與32788bp之間插入雙表達第二外源基因與eGFP的表達元件；上述的小肽序列為RGD、 SIKVAV、YGRKKRRQRRR、NGR、pK7 序列中的任意一個。
2.按照權(quán)利要求1所述的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，其特征在于所說的在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達第一外源基因的表達元件中的第一外源基因是Arresten、Trail、Endostatin、Canstatin、 tumostatin中的任意一種。
3.按照權(quán)利要求1所述的小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體， 其特征在于所說的在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達第二外源基因與eGFP的表達元件中的第二外源基因是IL-24、Trail, Endostatin、Canstatin、 tumostatin的任意一禾中。
4.一種權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于由下述步驟組成(1)構(gòu)建pAd5ElB55kd缺失的穿梭載體以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR反應(yīng)模板，引物)(bal A序列為 GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG 與引物 XbaI B 序列為 TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT 進行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段，該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為719bp。以引物BglII A序列為ATAAAGGATAAATG GAGTGAAGAAACCCATCTGAG 和引物 BglII B 序列為 GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA 進行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為270bp，將上述兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合作為模板，以引物)(bal A序列為GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG與引物BglIIB序列為GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA進行第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為95^p，得到第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，將聚此片段與pGEMT-T easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci細胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆經(jīng))(bal和BglII雙酶切，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳純化后得到的片斷與用)(bal和BglII雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pHElB55D shuttle，獲得 pAd5ElB 55kd缺失的穿梭載體；(2)構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因的穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增第一外源基因，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/第一外源基因；將第一外源基因的片段從pGEMT/第一外源基因上經(jīng)ClaI和NotI雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的pAd5. ElB55kd shuttle進行連接，連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達第一外源基因的Ad5El區(qū)穿梭載體，命名為PHE1B55D-第一外源基因shuttle ；(3)構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架將kal線性化的PHE1B55D-第一外源基因shuttle的穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BJ5183，將菌液涂布在含有 100yg/ml的氨芐青霉素的LB平板中，經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架，命名為PHE1B55D_第一外源基因/ SwaI載體；(4)構(gòu)建pshuttleAd5-E4-fiber-小肽序列穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開放讀碼框的兩端通過基因突變的方式產(chǎn)生兩個單一的酶切位點)(bal及Sful，然后將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點中，所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-Hindlll linker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增位于Ad5E4區(qū)3 ’端上游2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有I^cI與 SwaI位點，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點中，得到的載體稱為pshuttle Ad5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增Ad5纖維蛋白3'端上游2. 01Λ的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3'載體相應(yīng)的酶切位點中，獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber，通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，將小肽序列插入以上載體的fiber中，獲得的載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列；(5)構(gòu)建表達eGFP及第二外源基因的穿梭載體pshuttleAd5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增miniCMV-SV40表達元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與 PGEMT-T easy載體連接，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動子穿梭載體進行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增第二外源基因，擴增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pGEMT/第二外源基因，將第二外源基因片段從 pGEMT/第二外源基因上經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切下來，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40進行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，所獲得的載體為表達eGFP及第二外源基因的雙向啟動子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；將 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因經(jīng) BamHI 及SfuI雙酶切末端補平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭載體進行連接，獲得的陽性克隆為表達eGFP及第二外源基因的腺病毒E4-fiber穿梭載體，命名為pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4_fiber_小肽序列；(6)制備條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因用XhoI線性化的pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因-E4_fiber_小肽序列的穿梭載體與SwaI線性化的PHE1B55D-第一外源基因/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1 共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183，通過酶切及測序獲得陽性克隆，所得到的載體命名為PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因；采用磷酸鈣法將I^acI線性化的表達綠色熒光蛋白的PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因的條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK 293細胞系，經(jīng)過7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴增，通過兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的表達綠色熒光蛋白的的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒 HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因，-80°C冰箱內(nèi)保存。
5.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤藥物中的用途。
6.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肝癌藥物中的用途。
7.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療胃癌藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肺癌藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療乳腺癌藥物中的用途。
11.權(quán)利要求1小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療黑色素瘤藥物中的用途。
全文摘要
一種小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，在人腺病毒5型基因組2245bp-3327b之間有1083bp堿基的缺失，在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個表達第一外源基因的表達元件，在腺病毒5型基因組第32679bp處即纖維蛋白HI loop處，插入編碼含有一個小肽序列，在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達第二外源基因與eGFP的表達元件。其構(gòu)建方法為構(gòu)建pAd5E1B 55kd缺失的shuttle、構(gòu)建pHE1B55D-第一外源基因的shuttle、構(gòu)建pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架、構(gòu)建pshuttleAd5-E4-fiber-小肽序列shuttle、構(gòu)建表達eGFP及第二外源基因的shuttle、制備小肽修飾表達兩個外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體。上述的腺病毒載體在制備治療腫瘤藥物中的用途。
文檔編號C12N15/861GK102229961SQ201110139710
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者劉世海, 夏海濱 申請人:陜西師范大學(xué)