專(zhuān)利名稱(chēng):抗CD3抗體Fv片段與白介素3融合蛋白突變體、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和生物藥學(xué)領(lǐng)域,提供了可以產(chǎn)生靶向腫瘤干細(xì)胞殺傷作用的融合蛋白突變體、制備方法及其在靶向治療腫瘤干細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
人白細(xì)胞介素一 3 (human — ntedeukin3,h 一 L 一 3)是一種造血前體細(xì)胞早期分化的關(guān)健調(diào)節(jié)因子,在造血細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起著核心作用。hlL3的主要適應(yīng)癥是造血功能障礙.人白細(xì)胞介素3(IL-3)是CD123的配體,對(duì)各亞型急性髓系白血病干細(xì)胞表面標(biāo)志的研究發(fā)現(xiàn)其在正常造血干細(xì)胞(⑶34+,⑶38_)的表達(dá)< I %,而在急性髓系白血病干細(xì)胞的的表達(dá)>99%。除此之外,⑶123在其他白血病細(xì)胞的表面也有表達(dá)。因此⑶123是一個(gè)很好的腫瘤干細(xì)胞靶向治療的靶點(diǎn)。研制以CD123為靶點(diǎn)的小型、高效的靶向藥物,將為清除白血病干細(xì)胞或誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞凋亡進(jìn)而根治白血病提供可能。為此,本申請(qǐng)人
構(gòu)建了抗CD3與IL3的融合蛋白。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)融合蛋白中白介素3的C末端易發(fā)生斷
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^lPC O1990年,vanLeen的研究表明,除非在hIL3的N端融合一些細(xì)菌蛋白成分,否則野生型hIL3的表達(dá)量很低。北京醫(yī)學(xué)院免疫教研室后來(lái)的研究結(jié)果也證實(shí)了上述結(jié)論。根據(jù)推測(cè)所述現(xiàn)象很可能是由于hIL3富含cG,以及第三個(gè)編碼序列為ATG影響轉(zhuǎn)譯效率所致。接著,有學(xué)者通過(guò)對(duì)翻譯起始區(qū)的改造以及在5 ‘端使用高頻密碼子的方法以及通過(guò)包涵體裂解方法獲得了較高的hIL3的表達(dá)。2000年,F(xiàn)rankel等構(gòu)建了 DT388與IL3的融合蛋白DTLIL3,并通過(guò)包涵體裂解的方法獲得了該蛋白,但在純化過(guò)程也發(fā)現(xiàn)在IL3的C末端發(fā)生了斷裂。除此之外,本申請(qǐng)人曾構(gòu)建了 IL3-LDM的融合蛋白,表達(dá)過(guò)程中同樣發(fā)現(xiàn)在IL3的C末端發(fā)生了斷裂。融合蛋白中白介素3的C末端斷裂的問(wèn)題已成為研究靶向CD123+白血病干細(xì)胞的靶向藥物的一個(gè)嚴(yán)重障礙。本申請(qǐng)人通過(guò)IL3-LDM的融合蛋白斷裂片段純化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)斷裂部位在IL3氨基酸序列C末端的第131與第132位氨基酸之間。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)抗CD3與IL3的融合蛋白中白介素3的C末端發(fā)生斷裂的技術(shù)問(wèn)題,而公開(kāi)一種抗CD3抗體ScFv片段與白介素3融合蛋白突變體、制備方法及其用途。本發(fā)明所公開(kāi)的具體內(nèi)容是融合蛋白,其選自下述序列之一(a)由 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ IDNO :9和SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO : 15所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列;(b)具有 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ IDNO :9和SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :15所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能、且與 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3 或 SEQID NO 5 和 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 9 和SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO : 15所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列;和(C)具有 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ IDNO :9和SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :15所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能,且經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3或SEQ IDNO :5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO :9 和 SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:13 和 SEQ ID NO 15
所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列。2.核酸分子,其編碼項(xiàng)目I的融合蛋白的基因選自下述序列之一(a)SEQ ID NO 2和 SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6和 SEQ ID NO 8或 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID N0:12 或 SEQ ID N0:14 和 SEQ ID NO :16 所示的編碼 EQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 15的核苷酸序列;(b)編碼項(xiàng)目I中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列;(c)編碼項(xiàng)目I中(C)的氨基酸序列的核苷酸序列;和(d)因?yàn)槊艽a子兼并性而分別與SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4或SEQ I DNO :6和SEQ ID NO :8 或 SEQ ID N0:10 和 SEQ ID N0:12 或 SEQ ID N0:14 和 SEQ ID N0:16 不同、但是編碼與 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3 或 SEQID NO 5 和 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :11或SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 15所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。3.載體,其可操作地連接有項(xiàng)目2所述的核酸分子。4.項(xiàng)目3的載體,所述載體是質(zhì)粒。5.宿主菌,其包含項(xiàng)目3所述的載體。6.制備項(xiàng)目I融合蛋白的方法,包括以下步驟(a)將 CD3VL-mlIL3 片段、CDSVhIi1ILS 或 CD3VL_m2IL3 片段、CD3VH_m2IL3 連接到表達(dá)載體pAYZ中,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pAYZ抗CDf-Hi11L3、pAYZ抗CD3-miIL3、pAYZ抗CD3*-m2IL3、pAYZ 抗 CD3_m2IL3 ;(b)在大腸桿菌16C9中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白抗⑶f-mJLS、抗⑶3_mIL3、抗CD3*-m2IL3、抗 CD3-m2IL3 ;(c)篩選并純化步驟(b)中獲得的融合蛋白抗CD3*_m2IL3、抗CD3_m2IL3 ;(d)任選地,其還包括測(cè)定步驟(d)中組裝后的融合蛋白的生物學(xué)活性的步驟。7.藥物組合物,其中含有藥學(xué)有效量的項(xiàng)目I所述的融合蛋白,任選地,還含有藥學(xué)上允許的佐劑。8.項(xiàng)目I的融合蛋白在制備用于腫瘤干細(xì)胞靶向治療藥物中的用途。9.項(xiàng)目8的用途,所述藥物用于靶向殺傷白血病干細(xì)胞。10.項(xiàng)目9的用途,其中的白血病干細(xì)胞是急性髓系白血病干細(xì)胞。11.項(xiàng)目9的用途,其包括向有此需要的受試者給予有效量的項(xiàng)目I的融合蛋白。12.項(xiàng)目9的用途,其中所述疾病是干細(xì)胞(⑶34+⑶38_)中⑶123+高表達(dá)的急性髓系白血病。13.項(xiàng)目9的用途,其中所述疾病是急性髓系白血病。在本發(fā)明中所提及的術(shù)語(yǔ)均按下述定義來(lái)理解抗⑶3指⑶3的ScFv片段,抗⑶3*指在⑶3的\和Vh間弓I入而二硫鍵以提高
其穩(wěn)定性。⑶3'等同與⑶3的輕鏈可變區(qū),⑶3Vh等同與⑶3的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明中的IL3的DNA序列指IL3的⑶S區(qū)片段。本發(fā)明對(duì)抗⑶3抗體ScFv片段與白介素3融合蛋白中IL3氨基酸序列C末端的 第131-132位氨基酸進(jìn)行了改造。人白細(xì)胞介素3(IL_3)是⑶123的配體,是造血干細(xì)胞增殖分化的正性調(diào)節(jié)因子,可刺激多能干細(xì)胞和多種祖細(xì)胞的增殖與分化,因此又稱(chēng)多重集落刺激因子(multi-colony stimulating factor, multi-CSF)。IL-3 受體是由與配體 IL-3 特異性結(jié)合的a鏈(CD123)和參與信號(hào)傳遞的P鏈組成。a鏈和P鏈在無(wú)配體存在時(shí)是分離的,當(dāng)配體與a鏈低親和力特異性結(jié)合后,a鏈中一個(gè)半胱氨酸與P鏈中Cys86和Cys91形成二硫鍵,這是受體活化所必需的,活化的受體成為具有高親和力的異源二聚體,由P鏈負(fù)責(zé)向下游傳導(dǎo)信號(hào)。在進(jìn)行“彈頭”選擇時(shí),本發(fā)明選擇了抗⑶3抗體ScFv。⑶3是T淋巴細(xì)胞表面特異分子,通過(guò)它可以募集具有殺傷作用的T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞可以通過(guò)與腫瘤細(xì)胞接觸形成T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞突觸樣結(jié)構(gòu),直接對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。ScFv由抗體重鏈可變區(qū)VH、和輕鏈VL組成。由于ScFv分子量小,因而免疫原性低而不易產(chǎn)生HAMA反應(yīng),且易穿透致密的腫瘤細(xì)胞間隙屏障,可進(jìn)入實(shí)體瘤深部;同時(shí)因?yàn)槿狈e片段,避免了 Fe介導(dǎo)的受體結(jié)合作用,使得其快速向靶部位集中;此外還易于在體外進(jìn)行基因改造,產(chǎn)生靶向融合蛋白。本發(fā)明通過(guò)基因工程方法,從含⑶3VfIL3和⑶3Vh_IL3的中間載體pBlldl上擴(kuò)增 CD3VL1JL3、CD3Vl1i2IL3 基因片段和 CD3VH1JL3、CD3VH_m2IL3 片段,再通過(guò) PCR 擴(kuò)增在⑶3VH-miIL3、⑶3VH-m2IL3基因片段的末尾引入His標(biāo)簽和SphI的酶切位點(diǎn)。再將CDSVfm1ILS 片段、CD3VJTIHJL3 片段和 CD3'_m2IL3、CD3VH_m2IL3 連接到表達(dá)載體 pAYZ 中,并將表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌株中,通過(guò)改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化培養(yǎng)條件,獲得了可溶性表達(dá)的抗⑶3-H1JL3、抗⑶3-m2IL3融合蛋白。本發(fā)明還通過(guò)PCR在⑶3'-100位和抗⑶3VH-44位引入半胱氨酸突變,獲得了二硫鍵穩(wěn)定的抗⑶3-H1JL3即抗⑶f-mJLS、和二硫鍵穩(wěn)定的抗⑶3-m2IL3即抗⑶3*-m2IL3融合蛋白。WESTEN結(jié)果顯示抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3-m2IL3要比抗⑶抗⑶3-H1JL3,純度與產(chǎn)量高,因此我們選擇抗CD3*-m2IL3、抗CD3_m2IL3研究其活性。體外實(shí)驗(yàn)證明抗CD3*-m2IL3、抗CD3_m2IL3融合蛋白有較好的結(jié)合活性和殺傷活性。由此提供可用于新型的、高效的可介導(dǎo)T細(xì)胞靶向殺傷于腫瘤干細(xì)胞的融合蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于應(yīng)用基因重組和分子重建相結(jié)合的方法,篩選并制備了能夠介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的抗CD3抗體Fv片段與白介素3融合蛋白的突變體抗⑶3*-m2lIL3、抗⑶3-m2lIL3,不僅保留了單抗對(duì)⑶123抗原的結(jié)合性,還具有強(qiáng)烈的腫瘤細(xì)胞特異性的殺傷活性在腫瘤靶向免疫治療藥物的小型化方面達(dá)到一個(gè)新水平,具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)該種改造IL3融合蛋白的方法也為制備其它有效的靶向腫瘤細(xì)胞的藥物提供了參考。
圖 I 為重組表達(dá)質(zhì)粒 pAYZ 抗 CDf-mJLS'pAYZ 抗 0)3-1 IL3、PAYZ 抗 CD3*_m2IL3、pAYZ抗⑶3-m2IL3轉(zhuǎn)化后菌體PCR產(chǎn)物的電泳圖,其中,I為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2_3為pAYZ抗CDS^m1ILS ;4-5 為 pAYZ 抗 CD31JL3 ;6_7 為 PAYZ 抗 CD3*_m2IL3 ;8_9 為 pAYZ 抗 CD3_m2IL3 ;擴(kuò)增片段為CD3Vh-IL3。圖2-1為融合蛋白抗CDf-mJLS、抗CD3*_m2IL3小量表達(dá)產(chǎn)物Western印跡分析結(jié)果,I 為抗 CDf-mJLS,2 為抗 CD3*-m2IL3。 圖2-2A為純化后融合蛋白抗⑶3*_m2IL3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖2-2B為純化后融合蛋白抗⑶3*_m2IL3表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析結(jié)果。圖2-3A為純化后融合蛋白抗⑶3_m2IL3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖2-3B為純化后融合蛋白抗⑶3_m2IL3表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析結(jié)果。圖3-1A抗與Jurckat細(xì)胞的結(jié)合活性。圖3-1B抗Q)3-m2IL3與Jurckat細(xì)胞的結(jié)合活性。圖3-2A抗CD3*_m2IL3與M07e細(xì)胞的的結(jié)合活性。圖3-2B抗CD3_m2IL3與M07e細(xì)胞的的結(jié)合活性。圖3-3A抗CD3*-m2IL3與Jurckat細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。圖3-3B抗CD3-m2IL3與Jurckat細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。圖3-4A抗CD3*_m2IL3與M07e細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。圖3-4B抗⑶3_m2IL3與M07e細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。圖3_5M07e細(xì)胞表面CD 123的表達(dá)情況。圖4-1不同效靶比的PBL被500ng/ml的抗CD3*_m2IL3、抗CD3_m2IL3介導(dǎo)的體外特異性殺傷TFl細(xì)胞的效果對(duì)比圖。圖4-2A 不同效祀比的 PBL 被 500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml 的抗 CD3*_m2IL3 介導(dǎo)的體外特異性殺傷TFl細(xì)胞的效果對(duì)比圖。圖4-2B 不同效祀比的 PBL 被 500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml 的抗 CD3_m2IL3 介導(dǎo)的體外特異性殺傷TFl細(xì)胞的效果對(duì)比圖。圖4-3不同效靶比的PBL被500ng/ml抗CD3*_m2IL3、抗CD3_m2IL3介導(dǎo)的體外特異性殺傷K562細(xì)胞的效果對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行闡述。所述的實(shí)施方式僅僅用來(lái)解釋和說(shuō)明本發(fā)明,其并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公知的知識(shí)和現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)能夠想到的等價(jià)的變體都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。實(shí)施例I 重組表達(dá)質(zhì)粒 pAYZ 抗 CD3*-miIL3、pAYZ 抗 CD3-miIL3、pAYZ 抗 CD3*-m2IL3、pAYZ 抗 CD3-m2IL3 的構(gòu)建
PCR 擴(kuò)增 CD3X-IHJL3, CDSVfm1II^ 和 CD*3VL_m2IL3、CD3VL-m2IL3 基因片段分別以含有CDfVfII^CDSVf IL3的中間載體pBlldl為模板,以引物P1為5’端引物,P2或P3作為3’端引物,擴(kuò)增編碼IL3第131與132位氨基酸的密碼子發(fā)生突變的CDfVLi11L3、CDSVlIi1 IL3 和 0)3'-! IL3、CD3Vl1i2IL3 基因片段。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性10分鐘,94°C變性I分鐘,62°C退火I分鐘,72°C延伸Imin 30s,共30個(gè)循環(huán),72°C再延伸10 分鐘。得到 CDfVfm11LSXDSVfm1ILS 和基因片段。將片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,并用寶生物工程(大連)有限公司A型膠回收試劑盒回收純化。CD3X-IHJL3, CDSVlI1 IL3、CD3*VL_m2IL3、CD3VL-m2IL3 基因片段上游引物 P1 5’ -CTTCGAGCTAGCTACCCGGGGATCCTCTAGAG-3’ (SEQ ID No 17)CD3*VmJL3、CD3VL-miIL3 基因片段下游引物 P2 5’ -GCGCGCTAGCTCAAAAAAGTAAGAGGCTCAAAGT-3’ (SEQ ID No 18)CD3V^-m2IL3、CD3VL-m2IL3 基因片段下游引物 P3 5, -GCGCGCTAGCTCAAAATCTATTGAGGCTCAAAGT-3, (SEQ ID No 19)PCR 擴(kuò)增 CD3X-IHJL3, CDSVhI1 IL3、CD3*VH_m2IL3、CD3VH-m2IL3 基因片段分別以含有⑶3*Vh-IL3、⑶3Vh-IL3的中間載體pBYZlld2為模板,用引物P4為5’端引物,P5或匕作為3’端引物,擴(kuò)增編碼IL3第131與132位氨基酸的密碼子發(fā)生突變的CDYVh-IH1 IL3、CDSVh-HI1 IL3、CD3*VH-m21L3、CD3VH-m21L3 基因片段。再利用引物 P7 和 P8,通過(guò)PCR擴(kuò)增在IL3基因片段的末尾引入His標(biāo)簽和Sph I的酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件同上。將引A His 標(biāo)簽和 Sph I 酶切位點(diǎn)的CdSVh-Iii1ILS, CD3*VH_m2IL3、CD3VH-m2IL3 的基因片段產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳,并用寶生物工程(大連)有限公司A型膠回收試劑盒回收純化。CD3X-IHJL3, CDSVhI1 IL3、CD3*VH_m2IL3、CD3VH_m2IL3 基因片段上游引物 P4 5, -GCGCACGCGTACGCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGT-3, (SEQ ID No 20)CDWhI1 IL3、CD3VH-miIL3 基因片段下游引物 P5 5, -TGAACCTCCGCCTCCAAAAAGTAAGAGGCTCAAAGT-3, (SEQ ID No 21)CD3\_m2IL3、CD3VH_m2IL3 基因片段下游引物 P6 5,-TGAACCTCCGCCTCCAAATCTATTGAGGCTCAAAGT-3,(SEQ ID No 22)包含His標(biāo)簽和Sph I酶切位點(diǎn)的引物P7 5,-GCGCACGCGTACGCTCATCACCATCACCATCATGGTGGAGGC-3,(SEQ ID No 23)包含Hi s標(biāo)簽和Sph I酶切位點(diǎn)的引物P85,-CATCATGGTGGAGGCGGATCAGACATCGAGCTCACTCAGTCT-3,(SEQ ID No 24)將回收得到的IL3、CDSVlI1 IL3 和 CD3*VL-m2IL3、CD3VL_m2IL3 經(jīng)MluI-NheI 雙酶切,CDSIhI1 IL3、CDSVhI1 IL3、CD3*VH_m2IL3、CD3VH_m2IL3 經(jīng) Nhe I -Sph I 雙酶切,表達(dá)載體PAYZ經(jīng)Mlu I-Sph I雙酶切后,將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳,并用寶生物工程(大連)有限公司A型膠回收試劑盒回收純化。將得到的載體酶切產(chǎn)物與目的基因的酶切產(chǎn)物按I : 3 3的比例用TransGen公司的T4連接酶室溫連接15分鐘后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌16C9,篩選出重組克隆質(zhì)粒,并進(jìn)行菌液PCR及酶切鑒定后,測(cè)序,結(jié)果表明,融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致。菌體PCR產(chǎn)物的電泳圖參見(jiàn)圖I。
抗CD3*-miIL3的蛋白質(zhì)序列包括兩條編碼鏈如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :3所示,SEQ ID NO :1 為 CDSIl-HI1 IL3,SEQ ID NO :3 為抗CD31JL3 的蛋白質(zhì)序列如如SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :7所示,SEQ IDNO :5 為 CD3VL1JL3,SEQ ID NO :7 為 Q^VhI1ILS。CDfVLi11L3或CDSVlIi1 IL3 :1_23位為信號(hào)肽;24_130位為輕鏈可變區(qū);131-135位為G4S ;136-268 位為 IL3。CD3*VH-miIL3 或 CD3VH-miIL3 :1-23 位為信號(hào)肽;24_142 為重鏈可變區(qū);143-147位為G4S ; 148-280位為IL3。其中G4S為由4個(gè)甘氨酸和I個(gè)絲氨酸組成的連接肽??笴D3*-miIL3的DNA序列包括兩條編碼鏈,如SEQ ID NO 2和SEQ IDNO 4所示,SEQ ID NO :2 為L(zhǎng)3,SEQ ID 勵(lì)4為0)3<\1111130嫩序列。抗0)3111113的0嫩序列也包括兩條編碼鏈,如如SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :8所示,SEQ ID NO :6為CDSVl-Iii1IL3,SEQ ID NO :8 為 CDSVhI1IL3DNA 序列。CDSsXii1 IL3 或 CDSVfm1ILSDNA 序列1-69 位為信號(hào)肽基因序列,70-390位為輕鏈可變區(qū)基因序列,391-405位為G4S, 406-804位為IL3基因序列,805-807位為終止密碼子。⑶3*VH-miIL3或⑶3VH-miIL3DNA序列1_69位為信號(hào)肽基因序列,70-426位為重鏈可變區(qū)基因序列,427-441位為G4S, 442-840位為IL3基因序 列,841-855位為G4S, 856-873為His6標(biāo)簽,874-876位為終止密碼子??笴D3*-m2IL3的蛋白質(zhì)序列包括兩條編碼鏈如SEQ ID NO 9和SEQ IDNO :11所示,SEQ ID NO 9 為 CD3*VL-m2IL3, SEQ ID NO 11 為 CD3*VH_m2IL3???CD3_m2IL3 的蛋白質(zhì)序列如如 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 15 所示,SEQID NO : 13 為 CD3VL-m2IL3, SEQ ID NO 15 為 CD3*VH-m2IL3。CD3*Vl12IL3 或 CD3Vl12IL3 :1-23 位為信號(hào)肽;24_130 位為輕鏈可變區(qū);131-135 位為 G4S ; 136-268 位為 IL3。CD3*VH-m2IL3 或 CD3VH-m2IL3 :1-23 位為信號(hào)肽;24-142為重鏈可變區(qū);143-147位為G4S ; 148-280位為IL3。其中G4S為由4個(gè)甘氨酸和I個(gè)絲氨酸組成的連接肽。抗CD3*-m2IL3的DNA序列包括兩條編碼鏈,如SEQ ID NO 10和SEQ IDNO 12所示,SEQ ID NO : 10 為 CD3*VL-m2IL3, SEQ ID NO :12 為 CD3*VH-m2IL3DNA 序列???CD3_m2IL3的DNA序列也包括兩條編碼鏈,如SEQ ID N0:14和SEQID N0:16所示,SEQ ID N0:14為CD3VL-m2IL3,SEQ ID NO :16 為 CD3VH_m2IL3DNA 序列。CD3*VL_m2IL3 或 CD3VL_m2IL3DNA 序列1-69位為信號(hào)肽基因序列,70-390位為輕鏈可變區(qū)基因序列,391-405位為G4S, 406-804位為IL3基因序列,805-807位為終止密碼子。CD3*VH_m2IL3或CD3VH_m2IL3DNA序列1_69位為信號(hào)肽基因序列,70-426位為重鏈可變區(qū)基因序列,427-441位為G4S, 442-840位為IL3基因序列,841-855位為G4S,856-873為His6標(biāo)簽,874-876位為終止密碼子。實(shí)施例2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pAYZ 抗 CDfi11L3、pAYZ 抗 CD3-mi IL3、pAYZ 抗 CD3*_m2IL3、pAYZ抗Q)3-m2IL3表達(dá)與驗(yàn)證。2. I將實(shí)施例I中獲得的含有質(zhì)粒pAYZ抗CDf-mJLS、PAYZ抗CD3-H1JL3、pAYZ抗⑶3*-m2IL3、pAYZ抗⑶3-m2IL3的大腸桿菌16C9的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素(Amp) 100 u g/ml的2XYT培養(yǎng)基中,在恒溫?fù)u瓶箱中37 °C,200rpm,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;移入500ml含Amp 100 u g/ml的2XYT培養(yǎng)基(1L的2XYT培養(yǎng)基含I. 6%胰化蛋白胨、I. 0%酵母抽提物、0.5%氯化鈉,PH 7.4)中,37°C,200rpm,振蕩培養(yǎng)8h后,在低溫高速真空離心機(jī)上6000rpm、4°C離心10分鐘收集菌體,將菌體重懸于IOOOml含氨節(jié)青霉素100ug/ml的AP5培養(yǎng)基中,300C,200rpm,振蕩培養(yǎng)24h。在4°C低溫高速真空離心機(jī)上8000rpmX IOmin離心,收集菌體。冷凍于_20°C冰箱備用。將凍存的菌體化凍,加入50ml細(xì)菌周質(zhì)腔蛋白提取液(三羥甲基氨基甲烷25mmol/L,乙二胺四乙酸 lmmol/L,苯甲基磺酰氟(PMSF)O. lmmol/L,鹿糖 20 % (w/w, NaCl200mmol/L, pH 7. 5),振蕩混勻,置于4°C輕搖lh。12000rpm,4°C離心20分鐘,取上清。將pAYZ 抗 CDf-Hi11L3、pAYZ 抗 0)3-1 IL3、pAYZ 抗 CD3*-m21L3、pAYZ 抗 CD3_m21L3 的表達(dá)產(chǎn)物的粗提物行SDS-PAGE電泳。將抗CD3*-m2IL3、抗CD3_m2IL3的提取物用PBS透析24h后,在快速蛋白層析儀(FPLC)上進(jìn)行純化,用結(jié)合緩沖液(0.02M磷酸鹽緩沖液PH7.4,0. 5M NaCL,20mM咪唑)平衡親和層析柱,上樣,再用結(jié)合緩沖液沖洗基線,至基線穩(wěn)定后,用洗脫緩沖液(0. 02M磷酸鹽緩沖液PH7.4,0. 5M NaCL, 0. 5M咪唑)洗脫,用蛋白濃縮柱,以PBS置換洗脫液并濃縮蛋白,分裝后保存于_20°C。然后用12% SDS-PAGE分析外源蛋白表達(dá)情況,結(jié) 果表明,經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株表達(dá)了大量外源蛋白,pAYZ抗⑶3*-m2IL3、pAYZ抗⑶3_m2IL3的表達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)菌可溶性周質(zhì)腔中(圖2-2A,圖2-3A)。2. 2 用 Western 印跡法確認(rèn) pAYZ 抗 CDS^m1ILS, pAYZ 抗 CD31JL3、pAYZ 抗CD3*-m2IL3、pAYZ 抗 CD3_m2IL3。將2. I獲得的蛋白進(jìn)行電泳,電泳后的凝膠在Bio-Rad電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行半干電轉(zhuǎn),條件為恒電流0. 65mA/cm2,時(shí)間為3小時(shí)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后的NC膜與用封閉液1000倍稀釋的一抗即孵育,以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體為二抗,進(jìn)行顯色分析,結(jié)果表明,重組菌株表達(dá)的pAYZ抗⑶f-mJLS'pAYZ抗⑶3*_m2IL3確為末端帶His標(biāo)簽的抗⑶和抗⑶3*-m2IL3重組融合蛋白(圖2_1)??耿?*_m2IL3、抗⑶3_m2IL3的純化結(jié)果如圖(圖2-2B,圖2-3B)。實(shí)施例3抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3_m2IL3的免疫學(xué)活性。3. I通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3_m2IL3的體外免疫熒光結(jié)合活性。取終濃度為20 u g/ml純化抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3-m2IL3與I X IO6Jurkat細(xì)胞或終濃度為50ng/ml 純化抗 CD3*-m2IL3、抗 CD3-m2IL3與 lX106M07e 細(xì)胞 4°C 共同溫育 lh,300 X g,4°C 離心5min,棄上清,冷PBS洗細(xì)胞,重復(fù)3次。細(xì)胞再與小鼠抗His-tag單克隆抗體(I 1000稀釋)4°C共同溫育lh,1500r/min,4°C離心5min,棄上清,PBS洗細(xì)胞,重復(fù)3次,將細(xì)胞重懸于20 u I FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG多抗,4°C共同溫育30min, 300Xg,4°C離心5min,棄上清,PBS洗細(xì)胞,重復(fù)2次,F(xiàn)ACS測(cè)定抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3_m2IL3結(jié)合Jurkat或M07e細(xì)胞的陽(yáng)性率。證明抗 CD3*-m2IL3、抗 CD3-m2IL3 與 Jurkat (圖 3_1A,B)或 M07e (圖 3_2A,B)細(xì)胞均具有良好的靶向結(jié)合能力。3. 2競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制實(shí)驗(yàn)。取終濃度為20 ii g/ml純化抗CD3*-m2IL3、抗CD3_m2IL3的融合蛋白與I X IO6Jurkat細(xì)胞或終濃度為50ng/ml純化抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3_m2IL3的融合蛋白與I X 106M07e細(xì)胞4°C共同溫育lh,300 X g,4°C離心5min,棄上清,冷PBS洗細(xì)胞,重復(fù)3次。Jurkat細(xì)胞與單抗HIT3a, M07e細(xì)胞與單抗AntiO)1234°C共同溫育Ih, 300 X g, 4°C離心5min,棄上清,PBS洗細(xì)胞,重復(fù)3次。20 FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG多抗,4°C共同溫育301^11,300\§,41離心5111111,棄上清,PBS洗細(xì)胞,重復(fù)2次,F(xiàn)ACS測(cè)定熒光強(qiáng)度。證明抗CD3*-m2IL3、抗 CD3-m2IL3 與 Jurkat (圖 3_3A,B)或 M07e (圖 3_4A,B)細(xì)胞均具有良好的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力。M07e細(xì)胞表面⑶123的表達(dá)情況見(jiàn)圖3_5。
實(shí)施例4抗⑶3*_m2IL3、抗⑶3_m2IL3對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的特異性的細(xì)胞毒作用。以Calcein-AM法進(jìn)行測(cè)定細(xì)胞毒作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TFl細(xì)胞、計(jì)數(shù),I X IO4個(gè)/孔鋪于96孔板,然后加入不同濃度的藥物抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3_m2IL3的,每個(gè)藥物濃度按照效靶比25 1,12.5 1、6 : I和3 : I分別加入活化的PBL,每種實(shí)驗(yàn)孔設(shè)3個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放和最大釋放對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后,300g/分鐘離心5分鐘,各組分別取上清70 ii I,用Fluoroskan Ascent FL(Thermo)突光酶標(biāo)儀測(cè)定突光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)為485nm,發(fā)射波長(zhǎng)為535nm。按下式計(jì)算特異性殺傷的百分率
,^a ^ ,,靶麵廳_看藝輸 細(xì)胞特異殺傷百分比涵漏結(jié)果顯示,在雙功能抗體存在的情況下,激活的T淋巴細(xì)胞能夠特異性殺傷⑶123高表達(dá)的TFl細(xì)胞,殺傷效率明顯強(qiáng)于對(duì)照各組(P < 0. 05)(圖4-1)。隨著抗體濃度的增高,激活的T淋巴細(xì)胞裂解殺傷靶細(xì)胞的作用逐漸增強(qiáng)(圖4-2A,B)。當(dāng)E T比逐漸增加時(shí),激活的T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的作用也逐漸增強(qiáng)(圖4-2A,B)。而以⑶123表達(dá)陰性的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí),雙功能抗體相對(duì)于對(duì)照組的殺傷效果,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4-3) o
權(quán)利要求
1.融合蛋白,其選自下述序列之一(a)由SEQ ID NO 1和 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 9和SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :15所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列;(b)具有SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO:9和SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :15所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能、且與 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3 或 SEQID NO 5 和 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 9 和 SEQID NO: 11或SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO : 15所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列;和(c)具有SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO:9和SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO : 15所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能,且經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO :9 和 SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:13 和 SEQ ID N0:15 所示 的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列。
2.核酸分子,其編碼權(quán)利要求I的融合蛋白的基因選自下述序列之一(a)SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :8 或 SEQ ID N0:10 和SEQ ID NO : 12 或 SEQ ID NO 14 和 SEQ ID NO 16 所示的編碼 EQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO :9 和 SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:13 和SEQ ID NO 15的核苷酸序列; (b)編碼權(quán)利要求I中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列; (c)編碼權(quán)利要求I中(C)的氨基酸序列的核苷酸序列;和 (d)因?yàn)槊艽a子兼并性而分別與SEQID NO :2和SEQ ID NO :4或SEQ IDNO :6和SEQID NO :8 或 SEQ ID N0:10 和 SEQ ID N0:12 或 SEQ ID N0:14 和 SEQ ID N0:16 不同、但是編碼與 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3 或 SEQID NO 5 和 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 9 和SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 15所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.載體,其可操作地連接有權(quán)利要求2所述的核酸分子。
4.權(quán)利要求3的載體,所述載體是質(zhì)粒。
5.宿主菌,其包含權(quán)利要求3所述的載體。
6.制備權(quán)利要求I融合蛋白的方法,包括以下步驟(a)將CD3VL-mlIL3 片段、CDSVhIi1ILS 或 CD3Vl1i2IL3 片段、CD3VH_m2IL3 連接到表達(dá)載體 pAYZ 中,得到重組表達(dá)質(zhì)粒 pAYZ 抗 CDf-Hi11L3、pAYZ 抗 CD3-miIL3、pAYZ 抗 CD3*_m2IL3、pAYZ 抗 CD3-m2IL3 ; (b)在大腸桿菌16C9中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白抗⑶f-mJLS、抗⑶3-mIL3、抗⑶3*-m2IL3、抗 CD3-m2IL3 ; (c)篩選并純化步驟(b)中獲得的融合蛋白抗⑶3*-m2IL3、抗⑶3-m2IL3; (d)任選地,其還包括測(cè)定步驟(d)中組裝后的融合蛋白的生物學(xué)活性的步驟。
7.藥物組合物,其中含有藥學(xué)有效量的權(quán)利要求I所述的融合蛋白,任選地,還含有藥學(xué)上允許的佐劑。
8.權(quán)利要求I的融合蛋白在制備用于腫瘤干細(xì)胞靶向治療藥物中的用途。
9.權(quán)利要求8的用途,所述藥物用于靶向殺傷白血病干細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的用途,其中的白血病干細(xì)胞是急性髓系白血病干細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9的用途,其包括向有此需要的受試者給予有效量的項(xiàng)目I的融合蛋白。
12.權(quán)利要求9的用途,其中所述疾病是干細(xì)胞(⑶34+⑶38_)中⑶123+高表達(dá)的急性髓系白血病。
13.權(quán)利要求9的用途,其中所述疾病是急性髓系白血病。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗CD3抗體Fv片段與白介素3融合蛋白突變體、制備方法及其用途,本發(fā)明篩選并制備了能夠介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的抗CD3抗體Fv片段與白介素3融合蛋白的突變體抗CD3*-m21IL3、抗CD3-m21IL3,不僅保留了單抗對(duì)CD123抗原的結(jié)合性,還具有強(qiáng)烈的腫瘤細(xì)胞特異性的殺傷活性在腫瘤靶向免疫治療藥物的小型化方面達(dá)到一個(gè)新水平,具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)該種改造IL3融合蛋白的方法也為制備其它有效的靶向腫瘤細(xì)胞的藥物提供了參考。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102796199SQ20111013945
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者楊純正, 熊冬生, 張秀麗, 彭洪薇, 李雙靜, 顏次慧, 姜琳琳 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院