專利名稱：在dna水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法。
背景技術：
我國有豐富的藥用植物資源，因其種類繁多，各地同名異物或同物異名現(xiàn)象普遍存在；同一品種道地藥材與非道地藥材，在形態(tài)、組織構造等特征的差別不十分明顯，但質量有時差異很大，很難識別。即便同一品種，產(chǎn)地不同時其有效成分含量也可能存在差異。 在中草藥銷售中因利益驅動而摻雜使假的情況時有發(fā)生，因此中草藥的品種及質量鑒定顯得尤為重要。中草藥材傳統(tǒng)的鑒定方法主要是性狀和/或組織顯微鑒別，有些根據(jù)中草藥的有效成分發(fā)展了薄層色(光)譜、電泳法、X射線衍射法等。這些方法各有優(yōu)缺點及其局限性。 隨著分子遺傳標記技術在藥用植物學研究領域的滲透及應用，越來越多的植物類藥材開始嘗試分子水平的遺傳分析鑒定。由于植物物種的遺傳組成不會隨其實物形態(tài)、生理及外部條件而變化，是更客觀、更可靠的識別標記，能更好地提供中草藥的植物基源特征。以PCR 為基礎的 DNA 分子標記技術，如 low-Cot DNA fingerprinting, RAPD, AP-PCR，PCR-RFLLP, Amplified DNA RFLP等，在中草藥材真?zhèn)舞b別中發(fā)揮了重要的作用。這不僅能對藥用植物基源進行遺傳特征分析，而且能夠逐步積累這些藥用植物的遺傳分子信息，有利于保護優(yōu)勢物種資源。如著名中藥人參(Panax ginseng)與西洋參(Panax quinquefolius)可用 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)及 DAMD(Directed Amplification of Minisatellite Region DNA)加以鑒別；RAPD也用于區(qū)別不同產(chǎn)地來源的黃芪，如韓國黃芪或中國黃芪；用于車前子、積雪草等藥用植物基源的聚類及特征分析。國外這方面的研究進展非常快速，已有多項專利。目前，尚未見有關于絞股藍DNA分子鑒定的方法。rDNA是編碼核糖體rRNA的基因，在植物中以重復連續(xù)排列方式存在，包含進化速率不等的編碼區(qū)、非編碼轉錄區(qū)。進化上較保守的18S、5S rRNA已被用于各種真核生物的親緣關系研究。18S rRNA基因為高度重復序列，約800 10000拷貝，以連續(xù)排列方式存在于細胞內。同時18S rRNA基因序列結構、功能十分保守，進化速率較慢，若它們的序列存在變異就能成為一種很好的DNA標記。18S rRNA基因的保守性為進行中草藥材的基因鑒定和真?zhèn)舞b定打下了良好的分子基礎。目前，18S rRNA基因測序技術已被用于人參、三七、 山藥、大黃、姜黃等的基源鑒別。根據(jù)我們查詢的已在GenBank中登錄的一些植物或苔蘚類 18S rRNA序列所做的聚類分析，結果表明18S rRNA在同科屬植物中進化速率較慢，但在不同科屬植物類群中有較大差別，或可作為藥用植物分類鑒定的一個很好標記。絞股藍(Gynostemma pentaphyllum(Thrunb. )Mak)為葫蘆科絞股藍屬植物。我國絞股藍資源非常豐富。絞股藍主要有效成分為皂苷，目前已分離的絞股藍皂苷有80多種， 均為四環(huán)三萜達瑪烷型，有6種皂苷與人參皂苷結構相同，還有一些經(jīng)水解可得到人參皂苷。絞股藍是五加科以外為數(shù)不多的含人參皂苷的植物。目前對絞股藍皂苷的藥理作用機制也有了較多研究報道。一些研究發(fā)現(xiàn)絞股藍皂苷可減弱宮頸癌細胞中氨基芴-DNA加合物的形成，抑制人宮頸癌乙酰氨基轉移酶的表達；絞股藍皂苷還能通過抑制iNOS(誘導型一氧化氮合酶)活性及減弱NF-K B介導的iNOS蛋白表達來抑制一氧化氮的合成，作為其發(fā)揮治療作用的機制之一；用絞股藍皂苷處理人肝癌細胞，能通過上調Bax和Bak、下調 Bcl-2、釋放線粒體細胞色素C、激活級聯(lián)反應來誘導細胞凋亡；絞股藍皂苷還能保護大鼠腦部缺血再灌注區(qū)損傷的神經(jīng)元；可通過改變肝葡萄糖代謝酶活性來降低血糖濃度等等。 目前醫(yī)藥市場上對絞股藍皂苷的需求量也越來越高。絞股藍在長期的自然環(huán)境及人工栽培的條件下，逐漸形成了眾多品種及栽培類型。根據(jù)其鳥足狀復葉小葉片數(shù)目分，有七葉或五葉絞股藍；根據(jù)其葉片味道分有甜味或苦味絞股藍。絞股藍遺傳多樣性復雜，植物表型及皂苷種類、含量均有一定區(qū)別。我們的研究結果表明，七葉絞股藍葉片的三萜皂苷含量為6. 78%，五葉絞股藍葉片的三萜皂苷含量只有3. 69% ；絞股藍葉片的三萜皂苷含量為4. 72%，而其莖的含量只有1. 85%，廣西南部產(chǎn)五葉絞股藍葉片的三萜皂苷含量為4. 1%，而其廣西北部產(chǎn)五葉絞股藍的三萜皂苷含量為 3.6%。另外，絞股藍藥材中還存在一些其他植物的混淆品，如葡萄科的烏蘞莓(Cayratia japonica(Thunb.)Gagnep.)等。因此，對絞股藍進行遺傳多樣性分析及分子生物學鑒定，對優(yōu)選皂苷含量高的絞股藍品種、解決絞股藍偽品的問題是很有意義的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的為了克服藥用植物葫蘆科絞股藍的傳統(tǒng)鑒定主要是以性狀或/和組織顯微鑒別等方法的局限性和復雜性的技術不足，針對葫蘆科絞股藍DNA序列特異性， 建立一個更為客觀和易行的在DNA水平鑒定葫蘆科絞股藍并與其形態(tài)上易混淆的葡萄科烏蘞莓區(qū)別的方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，其特征在于利用藥用植物葫蘆科絞股藍DNA特征性片段SCAR標記克隆測序的結果，設計葫蘆科絞股藍SCAR標記的特異引物對，結合葫蘆科絞股藍和葡萄科烏蘞莓植物各自的18S rRNA基因保守區(qū)設計引物對做為內參，分別組合成PCR復合體系1和PCR復合體系2進行擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳分析，從而對藥用植物葫蘆科絞股藍進行DNA水平鑒定，并與形態(tài)上易與絞股藍混淆的葡萄科烏蘞莓相區(qū)別。以上所述的PCR復合體系1，包含擴增葫蘆科絞股藍SCAR標記359bp片段的引物對Wjs-T1和WJS-T2,擴增葫蘆科絞股藍18S rRNA 293bp片段的內參引物對WHL-18S-Q和 WHL-ISS-C2,應用降落PCR程序擴增葫蘆科絞股藍DNA，得到兩條葫蘆科絞股藍的359bp和 293bp區(qū)帶，建立的過程如下(1)采用生物信息分析方法，篩選出19條IOmer RAPD隨機引物，建立RAPD分析體系，找出葫蘆科絞股藍共有的SCAR分子標記J-750 ；采用篩選出來的19條隨機引物，見附表1，進行PCR擴增，分析葫蘆科絞股藍鮮樣品(實驗用鮮樣品來源，見附表幻和干燥樣品 (實驗用干燥樣品來源，見附表3)的DNA多態(tài)性差異。其中，采用10號引物擴增8份廣西境內不同產(chǎn)地來源的葫蘆科絞股藍DNA均出現(xiàn)共有擴增帶，長度約為750bp，見附圖
4。對 17份干燥葫蘆科絞股藍藥材的DNA樣品，也擴增到此特征條帶，可做為絞股藍的一個分子標記，記為J-750，見附圖5和附圖6。采用分子克隆的方法，分別進行克隆測序，獲得8條長度在766 770bp的DNA序列。對獲得8份不同來源的葫蘆科絞股藍部分特征DNA序列，長度在766 770bp范圍，經(jīng)采用NCBI的Blast軟件分析，獲得8份不同來源的葫蘆科絞股藍J-750均為一段新克隆的尚未在NCBI登錄的植物DNA序列；對所獲得的8份不同來源的葫蘆科絞股藍分子標記J-750的克隆序列，使用Vector NTI軟件分析測序結果。結果表明，上述8條序列的一致性在97. 4% 99. 9%之間，具有高度一致性，見附表4。經(jīng)酶切位點分析，8條序列均含有11種內切酶的酶切位點，其中序列Jl-750、J6-750有一個kpl 酶切位點，J3-750、J4-750、J5-750、J7-750、J8-750 有二個 kpl 酶切位點，J2-750 有三個 SspI酶切位點，其他10種內切酶在8條序列的酶切位點均為單一酶切位點，見附表5。8份不同來源絞股藍經(jīng)10號引物擴增出來的絞股藍分子標記J-750DNA片段已克隆測序，已在GenBank中登錄，并已獲登錄號，見附表6及核苷酸序列表，但尚未公開。運用NCBI基因數(shù)據(jù)庫中的Blast程序對葫蘆科絞股藍特征條帶進行同源比對分析，結果顯示8條序列與GenBank中99個來自其他物種的基因序列有部分相似性，但相似位點片段僅在40-90bp之間，整體同源性小，見附圖7 14。說明本發(fā)明中的8條葫蘆科絞股藍DNA序列為新序列。(3)利用Oligo 6軟件針對本發(fā)明獲得的絞股藍SCAR分子標記J-750設計特異引物對Wjs-T1和WJS-T2,建立PCR體系擴增葫蘆科絞股藍DNA，擴增得到長度為359bp的特異區(qū)帶；附表1 :RAPD分析用的19條IOmer隨機引物序列一覽表
權利要求
1.一種在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，其特征在于利用藥用植物葫蘆科絞股藍DNA特征性片段SCAR標記克隆測序的結果，設計葫蘆科絞股藍SCAR標記的特異引物對，結合葫蘆科絞股藍和葡萄科烏蘞莓植物各自的18S rRNA基因保守區(qū)設計引物對做為內參，分別組合成PCR復合體系1和PCR復合體系2進行擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳分析，從而對藥用植物葫蘆科絞股藍進行DNA水平鑒定，并與形態(tài)上易與絞股藍混淆的葡萄科烏蘞莓相區(qū)別。
2.根據(jù)權利要求1所述的在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，其特征在于 所述的PCR復合體系1，包含擴增葫蘆科絞股藍SCAR標記359bp片段的引物對WJS-T1和 WJS-T2，擴增葫蘆科絞股藍18S rRNA 293bp片段的內參引物對WHL-18S-Q和WHL-18S_C2， 應用降落PCR程序擴增葫蘆科絞股藍DNA，得到兩條葫蘆科絞股藍的359bp和區(qū)帶， 建立的過程如下(1)采用生物信息分析方法，篩選出19條IOmerRAPD隨機引物，建立RAPD分析體系， 找出葫蘆科絞股藍共有的SCAR分子標記J-750 ；(2)對已獲得的葫蘆科絞股藍共有的SCAR分子標記J-750進行克隆測序，獲得8份不同來源的葫蘆科絞股藍部分特征DNA序列，長度在766 770bp范圍，經(jīng)采用NCBI的Blast 軟件分析，獲得8份不同來源的葫蘆科絞股藍J-750均為一段新克隆的尚未在NCBI登錄的植物DNA序列；(3)利用Oligo6軟件針對絞股藍SCAR分子標記J-750設計特異引物對WJS-T1和 WJS-T2，建立PCR體系擴增葫蘆科絞股藍DNA，擴增得到長度為359bp的特異區(qū)帶；(4)根據(jù)葫蘆科絞股藍18SrRNA基因保守區(qū)設計引物對WHL-18S-CjnWHL-18S-C2，建立PCR體系擴增葫蘆科絞股藍DNA，擴增得到一段長度為^!Bbp的葫蘆科絞股藍18S rRNA 基因保守區(qū)共有帶；(5)將葫蘆科絞股藍SCAR分子標記引物對WJS-T1和WJS-T2與18SrRNA基因保守區(qū)引物對WHL-18S-Q和WHL-18S-C2組合，建立PCR復合反應體系1，采用降落PCR程序擴增葫蘆科絞股藍DNA模板，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析得到兩條區(qū)帶，其中1條為359bp 的葫蘆科絞股藍SCAR特異帶，另1條為^ bp的葫蘆科絞股藍18S rRNA基因區(qū)保守帶。
3.根據(jù)權利要求1所述的在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，其特征在于所述的PCR復合體系2，包含擴增葫蘆科絞股藍SCAR標記359bp片段的引物對 WJS-T1和WJS-T2，擴增葡萄科烏蘞莓的18S rRNA 177bp片段的內參引物對WPT-18S-Q和 WPT-ISS-C2，應用降落PCR程序擴增葡萄科烏蘞莓DNA，得到1條葡萄科烏蘞莓的18S rRNA 177bp區(qū)帶，建立的過程如下(1)根據(jù)葡萄科18SrRNA基因保守區(qū)設計引物對WPT-18S-Q和WPT_18S_C2，建立PCR 體系擴增葡萄科烏蘞莓DNA，得到一段長度為177bp的葡萄科烏蘞莓18S rRNA基因保守區(qū)共有帶；(2)將葡萄科烏蘞莓18SrRNA基因保守區(qū)引物對WPT-ISS-C1 *WPT-18S-C2，與葫蘆科絞股藍SCAR分子標記特異引物對WJS-T1和WJS-T2組合成PCR復合反應體系2，采用降落 PCR程序對葡萄科烏蘞莓DNA模板進行擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到1條 177bp的葡萄科烏蘞莓18S rRNA基因保守區(qū)帶，無葫蘆科絞股藍SCAR片段359bp區(qū)帶。
4.權利要求1所述的在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，在鑒定葫蘆科絞股藍并與植物形態(tài)上易與葫蘆科絞股藍相混淆的葡萄科烏蘞莓區(qū)別中應用。
5.根據(jù)權利要求1所述的在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，其特征在于 8份不同來源絞股藍經(jīng)10號引物擴增出來的絞股藍分子標記J-750DNA片段序列 J1-750序列(1)序列特征a.長度:769basesb.類型DNAc.鏈型雙鏈(2)分子類型核酸(3)序列描述
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在DNA水平鑒定絞股藍并與烏蘞莓區(qū)別的方法，其特征在于利用藥用植物葫蘆科絞股藍DNA特征性片段SCAR標記克隆測序的結果，設計絞股藍SCAR標記的特異引物對WJS-T1和WJS-T2，根據(jù)葫蘆科絞股藍18S rRNA保守區(qū)設計內參引物對WHL-18S-C1和WHL-18S-C2，組成PCR復合體系1，應用降落PCR程序擴增葫蘆科絞股藍DNA，得到359bp和293bp兩條區(qū)帶；再根據(jù)葡萄科18S rRNA保守區(qū)設計內參引物對WPT-18S-C1和WPT-18S-C2，與擴增葫蘆科絞股藍SCAR標記的特異引物對WJS-T1和WJS-T2，組成PCR復合體系2，應用降落PCR程序擴增葡萄科烏蘞莓DNA，得到1條葡萄科18S rRNA 177bp區(qū)帶。從而對藥用植物葫蘆科絞股藍進行DNA水平鑒定，并與形態(tài)上易與葫蘆科絞股藍混淆的葡萄科烏蘞莓相區(qū)別。
文檔編號C12Q1/68GK102191333SQ201110139269
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權日2011年5月27日
發(fā)明者吳耀生, 周娟, 羅育 申請人:廣西醫(yī)科大學