專利名稱：一種角質酶的突變體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶突變體及其制備方法，尤其涉及角質酶的突變體及其制備方法，本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領域，具體地說本發(fā)明是利用蛋白質工程的定點突變方法改善耐熱角質酶的底物特異性的技術。
背景技術：
角質酶是能夠水解角質大分子的水解酶。作為一種多功能酶，在紡織工業(yè)、食品工業(yè)以及化工工業(yè)等諸多領域都有著廣泛的應用。尤其在紡織工業(yè)中，角質酶可用于棉纖維生物精練，以去除棉纖維表面蠟質和角質，并有助于果膠、蛋白質等雜質的進一步去除，從而達到精練目的。近年來研究表明，角質酶還可用于合成纖維聚對苯二甲酸乙二酯(PET) 的改性，增加織物吸水性，改善手感，提高織物品質。上述兩工藝目前均采用傳統(tǒng)堿處理工藝，存在水耗、能耗大，排放廢水堿性強、色度深、COD值高以及對纖維損傷大等弊病。酶精練工藝作為一種節(jié)能降耗、環(huán)境友好的紡織品清潔生產技術，已成為國內外染整行業(yè)發(fā)展的新趨勢。國外對角質酶進行了大量的研究，主要集中于Fusarium solani等真菌來源角質酶。但真菌角質酶熱穩(wěn)定性差，不適合在紡織工業(yè)中的應用。而本實驗室開發(fā)的嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產耐熱角質酶可有效水解角質、PET等聚酯，但水解效率較低(陳堅，吳敬，陳晟.一種耐熱角質酶及其編碼基因和表達.申請?zhí)?00710026074. 2)。因此通過結構模擬確定突變位點，通過定點突變技術提高耐熱角質酶對角質和PET的催化效率極為重要，具有較強的工業(yè)應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的一個技術問題是提供一種角質酶的突變體，包括一個或兩個相應于嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質酶活性中心位點附近的氨基酸殘基的取代， 與親代角質酶相比具有更強的角質或PET水解能力。所述嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產角質酶的基因與NCBI數(shù)據(jù)庫中 Thermobifida fusca編碼的蛋白Tfu_0883極其類似，基因全長906個核苷酸，編碼301個氨基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有兩個核苷酸的差異，編碼氨基酸相同(陳堅，吳敬，陳晟.一種耐熱角質酶及其編碼基因和表達.申請?zhí)?00710026074. 2)。所述角質酶突變體是218位氨基酸異亮氨酸Ile突變?yōu)楸彼酇la，命名為 I218A。所述角質酶突變體是是第132位氨基酸谷氨酰胺Gln和第101位氨基酸蘇氨酸 Thr同時突變?yōu)楸彼酇la，命名為Q132A/T101A。所述角質酶突變體是是第195位氨基酸色氨酸Trp和第249位氨基酸苯丙氨酸 Phe同時突變?yōu)楸彼酇la，命名為W195A/F249A。本發(fā)明的所要解決的另一個技術問題是提供上述突變體的制備方法。
為解決上述問題，本發(fā)明的技術方案是在嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶模擬結構的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物，以攜帶角質酶基因的載體為模板進行定點突變構建突變質粒I218A-pet20b(+)、W195/F249-pet20b (+)、Q132A/ T101A-pet20b(+)；將突變質粒轉化轉化大腸桿菌BL21 (DE!3)細胞，挑選驗證后的陽性單克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)，25°C恒溫培養(yǎng)至80h，對上清液進行硫酸銨沉淀、離子交換柱純化角質酶突變體 I218A、Q132A/T101A 和 W195A/F249A。所述攜帶角質酶的載體為pUC系列，PET系列，活PGEX中的任一一種。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一組具有纖維高催化效率的角質酶突變體及其制備方法，I218A、Q132A/T101A和W195A/FM9A對棉纖維的催化效率均有所提高，其中突變體I218A對角質的催化效率比原角質酶提高50% ；Q132A/T101A對合成纖維對苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角質酶提高3倍。這三種突變體在紡織工業(yè)中有重要的應用價值。


圖1嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體純化SDS-PAGE電泳圖。泳道1 標準分子量蛋白；泳道2 :I218A發(fā)酵液；泳道3 J218A純化制品；泳道4 :W195A/F249A 發(fā)酵液；泳道5 :W195A/F249A 純化制品；泳道6 :Q132A/T101A 發(fā)酵液；泳道7 :Q132A/T101A 純化制品。圖2嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體角質水解活力分析。Δ 嗜嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶；□ J218A ；■ :W195A/F249A ； ▲ :Q132A/T101A圖3嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體PET水解活力分析。Δ 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶；□ J218A ；· :W195A/F249A ;▲ Q132A/T101A
具體實施例方式實施例1 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體突變位點確定的方法。角質等聚酯是由大量脂肪酸構成的疏水性大分子物質，角質酶活性中心周圍氨基酸的大小對聚酯大分子和活性中心的結合造成影響，此外氨基酸的疏水性影響底物結合位點和底物的結合，因此，以角質酶模擬結構為基礎，從以上兩方面出發(fā)，確定突變位點進而對角質酶基因進行定點突變。通過對嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶模擬結構的分析，設計三組突變系列(1)位于絲氨酸活性中心正上方的氨基酸異亮氨酸1218所占空間較大，對活性中心和大分子底物的結合形成較大的位阻，因此將其突變?yōu)槲蛔栎^小的丙氨酸，以提高底物和活性中心的親和力；( 位于絲氨酸活性中心兩側的芳香族氨基酸色氨酸W195和苯丙氨酸F249由于苯環(huán)的存在，也占用大量空間，因此也將其突變?yōu)楸彼釡p少位阻效應；(3)位于活性中心附近的親水性氨基酸谷氨酰胺Q132和蘇氨酸TlOl對疏水性底物的結合力較差，將其突變?yōu)槭杷园被岜彼嵋栽黾訉κ杷缘孜锏慕Y合力， 提高催化效率。實施例2 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體的制備方法。利用快速PCR 定點突變方法構建 I218A-pet20b (+)、W195/F249_pet20b (+)、 Q132A/T101A-pet20b (+)突變質粒。I218A_pet20b(+)、W195_pet20b(+)、Q132A_pet20b (+)突變質粒的構建以 ⑶T-pet20b(+)質粒為模板(陳堅，吳敬，陳晟.一種耐熱角質酶及其編碼基因和表達.申請?zhí)?00710026074. 2)，分別用I218A、W195A和Q132A的突變引物通過一次PCR得到大小為4500bp左右產物，將PCR產物經(jīng)DpnI處理后轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，挑選轉化子測序驗證。W195/F249-pet20b (+)、Q132A/T101A_pet20b (+)突變質粒的構建分別以驗證正確的 W195-pet20b(+)、Q132A_pet20b (+)質粒為模板，用 F249A 和 TlOlA 為突變引物，PCR 擴增得到大小為4500bp左右產物，將PCR產物DpnI處理后轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞， 挑選轉化子測序驗證。測序驗證結果表明除了所需突變位點外，沒有出現(xiàn)隨機突變，因此突變質粒 I218A-pet20b (+)、W195/F249-pet20b (+)、Q132A/T101A-pet20b (+)構建成功。突變引物如下所示(方框為突變位點):1、I218A突變引物對P 1218A1 5 ’ -GCCGACCTCGACACG |GCC| GCGCCGTCGCCACG-3 ’P 1218A2 5 ’ -CGTGGCGACCGGCGC |GGC| CGTGTCGAGGTC-3 ’2、W195A突變引物對P W195A1 :5’ -ATCCCGCTCACCCCG IGCGl CACCTCAACA AGAA C-3’PW195A2 5 ’ -GTTCTTGTTGAGGTG |CGC| CGGGGTGAGCGGGATGG-3 ’3、F249A突變引物對 P F249A1 5 ’ -gACGGCGCAACCCAC |GCC| GCCCCGAACATCC-3 ’P F249A2 :5’ -GGATGTTCGGGGC |GGC| GTGGGTTGCGCCGTC-3
4、Q132A突變引物對P Q132A1 :5’ -CATCACCACCCTCGAC |GC(^ CCGGACAGCCGGGC Ag-3，P Q132A2 :5’ -CTGCCCGGCTGTCCGG |CGC| GTCGAGGGTGGTGATG-3‘5、TlOlA突變引物對P T10IA1 5，-GATCTCCCCCGGCTAC |GCC| GGCACTGAGGCTTC-3 ’P T101A2 :5’ -GAAGCCTCAGTGCC |GGC| GTAGCCGGGGAGATC-3‘上述PCR體系均為
權利要求
1. 一種角質酶的突變體，其特征是將嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質酶第 195位氨基酸色氨酸Trp和第249位氨基酸苯丙氨酸Wie同時突變?yōu)楸彼酇la，命名為 W195A/F249A,所述嗜熱放線菌的角質酶的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中Tfu_0883基因編碼的氨基酸序列相同。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶的突變體及其制備方法，突變體包括一個或兩個相應于嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質酶活性中心位點附近的氨基酸殘基的取代，I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A對棉纖維的催化效率均有所提高，其中突變體I218A對角質的催化效率比原角質酶提高50％；Q132A/T101A對合成纖維對苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角質酶提高3倍，這三種突變體在紡織纖維前處理中有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/55GK102260654SQ20111013932
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權日2009年12月18日
發(fā)明者吳敬, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學