專利名稱：氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及-構(gòu)建方法。
-株氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌及其
背景技術(shù)：
木糖醇為天然的五碳糖醇，是重要的功能性食品添加劑之一。木糖醇的甜度是蔗糖的1.05倍，熱量與蔗糖相當(dāng)，其代謝不需要胰島素，可替代蔗糖作為糖尿病患者食用的甜味劑。木糖醇不被細(xì)菌發(fā)酵，用在口香糖中作為甜味劑，具有維持口腔酸堿平衡、預(yù)防齲齒的功能。有研究表明，木糖醇可阻止細(xì)菌與人體細(xì)胞的結(jié)合，預(yù)防呼吸道感染；木糖醇還有促進(jìn)腸道對(duì)鈣質(zhì)的吸收，減少骨質(zhì)流失，維持正常骨密度以及降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶等作用。隨著人們對(duì)健康重視程度的增加，木糖醇的需求量將會(huì)越來越高。目前木糖醇生產(chǎn)方法主要為化學(xué)法即采用玉米芯、甘蔗渣等富含聚戊糖(含36 40%的多縮戊糖)的原料，經(jīng)酸水解成含木糖的糖液，然后經(jīng)中和、脫色、離子交換、結(jié)晶等復(fù)雜的凈化過程從水解液中分離純化出木糖，接著化學(xué)加氫使木糖生成木糖醇?；瘜W(xué)法制備木糖醇存在兩大共同問題(1)資源和環(huán)境污染問題嚴(yán)重。研究表明生產(chǎn)1噸木糖醇，會(huì)產(chǎn)生6噸酸性玉米芯殘?jiān)幚磉@些殘?jiān)鼊t需要2噸煤。由于環(huán)保問題難以解決，2005年， 全球最大的食品添加劑公司-丹尼斯克關(guān)閉了一條1萬噸/年木糖醇的生產(chǎn)線。(2)原料價(jià)格走高，并存在潛在的原料短缺風(fēng)險(xiǎn)。由于近年來我國玉米芯大量用于生產(chǎn)木糖醇、糠醛和食用菌，原料問題已經(jīng)凸現(xiàn)，這樣導(dǎo)致木糖醇的生產(chǎn)成本增加。為了解決木糖醇生產(chǎn)中的資源和環(huán)境問題，許多人致力于開發(fā)一種采用來源廣泛、價(jià)格低廉的淀粉或葡萄糖為原料來生產(chǎn)木糖醇。如Onishi和Suzuki報(bào)道了一種從葡萄糖出發(fā)制備木糖醇的方法，首先通過高滲酵母D. hansenii將葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇(D-arabitol, D-ara)，然后在Acetobacter suboxydans的作用下氧化為D-木酮糖，最后D-木酮糖在酵母C. guilliermondii作用下還原為木糖醇。如日本味之素株式會(huì)社Suzuki等選育到一株將阿拉伯糖醇一步高效生物轉(zhuǎn)化為木糖醇的氧化葡萄糖酸桿菌 (Gluconobacter oxydans)，將木糖醇生物合成路線簡化為兩菌兩步法，第一步利用酵母菌
發(fā)酵葡萄糖高效制備D-阿拉伯糖西藝路線如下
權(quán)利要求
1.一種氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌，其特征在于該細(xì)菌是缺失S-ArDH基因，且在 S-ArDH基因的位置上用)(DH基因增強(qiáng)的氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacteroxydans)。
2.權(quán)利要求1所述的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物，引物如下所示s-ardh L-fwd 5' -TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3‘ EcoR I， s-ardh L-rev :5’ -CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3’ Xho I， s-ardh R-fwd 5' -AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3' Xho I， s-ardh R-rev :5’ -ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3' EcoR I ；(2)s-ardh L、s-ardh R 基因的克隆通過 PCR 技術(shù)，以 Gluconobacter oxydans 菌株基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增s-ardh L和s-ardh R各800bp序列；(3)抗性片段Km的獲得根據(jù)GenBank公布的卡納霉素抗性基因Km序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增Km的完整⑶s，引物如下km-fwd :5’ -GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3' Xho I， km-rev :5，-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3' Xho I， km-fwd和km-rev引物兩端加同樣的限制性酶切位點(diǎn)B10 I及保護(hù)堿基，下劃線部分均為酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增出900bp序列；(4)pMD 18-KR的構(gòu)建將s-ardh R和Km片段通過重疊PCR方法連接，獲得大小為 1700bp的片段KR，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Ε. coli JM109中，通過含Amp和Km 抗性平板篩選獲得含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒PMD18-KR ；(5)pMD18-LKR的構(gòu)建將s-ardhL和KR片段通過重疊PCR方法連接，獲得大小為 2500bp的片段LKR，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Ε. coli JM109中，通過含Amp和Km 的LB平板篩選獲得含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pMDIS-LKR ；(6)s-ardh基因敲除載體pSUP202-s-ardh: :Km的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pMD18_LKR用EcoR I酶切；載體PSUP202用EcoR I酶切后用CIAP去磷酸化；將酶切后的LKR片段和去磷酸化后的載體PSUP202用"Γ4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli JM109中，通過含Amp和Km的 LB平板篩選獲得含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pSUP202-S-ardh: :Km ；(7)s-ardh 基因敲除突變體 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 的獲得將含敲除突變載體pSUP202-s-ardh: :Km的Ε. coli JM109作為供體菌用于三親接合，受體菌為 G. oxydans ；敲除突變載體在幫助菌pRK2013的幫助下進(jìn)入G. oxydans，將含Km基因的目標(biāo)基因片段整合到G. oxydans的染色體上，通過Cefotaxime、Km來篩選三親接合子；(8)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物，引物如下所示xdh-fwd :5’ -AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3’ Xho I， xdh-rev :5’ -ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3’ Xho I ；(9)xdh基因的克隆通過PCR技術(shù)，以Gluconobacter oxydans菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增800bpxdh序列；(10)xdh基因增強(qiáng)載體pSUP202-S-ardh: xdh的構(gòu)建將含目標(biāo)基因的質(zhì)粒pMD18-xdh用Β ο I酶切，膠回收目的片段；載體pSUP202-s-ardh: :Km用)(ho I酶切后用CIAP去磷酸化；將酶切后的目的片段和去磷酸化后的載體用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli JM109中，通過含Amp和Km抗性平板篩選獲得含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒 pSUP202-s-ardh::xdh ；(11) xdh基因增強(qiáng)突變體G. oxydans s-ardh xdh NSAX31的獲得將含敲除突變載體pSUP202-s-ardh::xdh的Ε. coli JM109作為供體菌用于三親接合，受體菌為 G. oxydanss-ardh: :Km mutant NSA18 ；敲除突變載體在幫助菌pRK2013的幫助下進(jìn)入 G. oxydansNSA18，將含xdh基因的目標(biāo)基因片段整合到G. oxydans NSA18的染色體上；通過 Cefotaxime、Km來篩選三親接合子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟 (9)中，xdh基因克隆的方法為采用PCR技術(shù)，以Gluconobacter oxydans菌株基因組DNA 為模板，用引物xdh-fwd、xdh-rev進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為=IOXPCR buffer5 μ L, Mg2+ 2 μ L，dNTP 5 μ L，弓 |物 xdh-fwd 禾口 xdh—rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，基因組模板1 μ L，加(MH2O至反應(yīng)總體積為50 μ L ；PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iiin ；94°C變性 30s, 53. 6°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循環(huán) 30 次；72°C延長 lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(11)中，三親接合增強(qiáng)的方法為將供體菌E. coli JM109/pSUP202-S-ardh::Xdh、幫助菌JM109/pRK2013分別接種在加有氨芐青霉素和卡納霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，受體菌 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 接種在 G-Ara 培養(yǎng) 15 20h，A660 值為 0. 6 1. O 時(shí)進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)；按受體親本菌幫助菌供體菌=3:1:3的菌液體積比收集菌體，轉(zhuǎn)移到不加抗生素的固體G-Ara培養(yǎng)基上，倒置30°C培養(yǎng)過夜；用G. oxydans具有的抗性加上重組質(zhì)粒上帶有的抗性，來篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子；將培養(yǎng)過夜的三親接合菌體用無菌雙蒸水從固體G-Ara培養(yǎng)基上洗下，涂到加入頭孢噻肟酸的G-Ara平板上，培養(yǎng)2 4天，長出接合子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌，該細(xì)菌是缺失s-ArDH基因的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)。本發(fā)明還公開了一種氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌，該細(xì)菌是缺失s-ArDH基因，且在s-ArDH基因的位置上用XDH基因增強(qiáng)的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)。本發(fā)明同時(shí)公開了上述兩種基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌可以阻斷生物法轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇制備木糖醇過程中木酮糖逆反應(yīng)生成D-阿拉伯糖醇，進(jìn)而從根本上解決木糖醇生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物伴生的問題，此外，XDH增強(qiáng)菌株提高了木糖醇脫氫酶活力，提高了木糖醇的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)C12P19/02GK102250820SQ20111013841
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者馮小海, 徐虹, 朱宏陽, 李莎 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)