專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸鈉的方法及其所用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸鈉的方法及其所用的培養(yǎng)基。即利用復(fù)合氨基酸液為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸鈉的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, Hyaluronan,以下簡稱ΗΑ)，又名玻璃酸，是由β -1，3和β -1，4糖苷鍵連接的(1 — 3) -2-乙酰氨基-2-脫氧-β -葡萄糖 (1 — 4)-0-β-D-葡萄糖醛酸雙糖重復(fù)單位組成，其廣泛存在于生物體的結(jié)締組織中。在不同組織中HA的生理作用有所不同，如在皮膚中表現(xiàn)為保水作用；在關(guān)節(jié)滑液中主要為潤滑作用；在血管壁中主要是調(diào)節(jié)通透性。另外，HA作為聚陰離子電解質(zhì)，分子上所帶的大量負(fù)電荷，可調(diào)節(jié)周圍正負(fù)離子的濃度，抑制多種酶的活性，廣泛應(yīng)用于眼科粘性手術(shù)。治療關(guān)節(jié)病、軟組織修復(fù)和作為藥物載體等，特別是在預(yù)防和減少外科手術(shù)后組織粘連中取得較大的進(jìn)展。目前，生產(chǎn)HA的方法主要有動(dòng)物源組織提取法(如從雞冠中提取)和微生物發(fā)酵法。但動(dòng)物源生化產(chǎn)品在對(duì)人進(jìn)行治療時(shí)，可能產(chǎn)生跨種間毒菌交叉感染(cross-species viral infection)和其它風(fēng)險(xiǎn)性感染。目前發(fā)酵法制備的HA開始替代提取法生產(chǎn)的HA成為趨勢。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸，大大拓展了 HA的來源，推動(dòng)了研究和應(yīng)用。微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA不僅降低了 HA的生產(chǎn)成本，而且具有較高的質(zhì)量和良好的品質(zhì)。但微生物發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸也存在很多問題，工業(yè)上往往采用成分復(fù)雜的酵母粉或酵母膏作為培養(yǎng)基氮源，其成分復(fù)雜、雜質(zhì)蛋白質(zhì)含量較高。這為后期HA的提取純化造成較大困難。工業(yè)生產(chǎn)中一般要通過繁瑣、多種、多次的提取手段來對(duì)發(fā)酵液中的HA進(jìn)行純化。而在復(fù)雜的提取工藝中，HA分子會(huì)受到各種物化手段的影響，分子量受到很大程度的損失，直接影響 HA的產(chǎn)量、質(zhì)量和生產(chǎn)成本。本發(fā)明在現(xiàn)有發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了改進(jìn)，用復(fù)合氨基酸液代替?zhèn)鹘y(tǒng)氮源酵母膏，從根源上降低了培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)和色素的含量，使后期對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵液中蛋白質(zhì)和色素的去除工藝得到簡化，較好地減少了提取過程中物化因素對(duì)透明質(zhì)酸分子量的損傷，從而獲得了分子量較高，產(chǎn)品品質(zhì)較佳的HA-Na產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是為了解決上述的問題而提出一種高分子量透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明的目的之二是提供一種上述的高分子量透明質(zhì)酸鈉的發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的之三是提供一種上述的高分子量透明質(zhì)酸鈉的發(fā)酵生產(chǎn)方法中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明采用復(fù)合氨基酸液培養(yǎng)基對(duì)獸疫鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵，之后通過酸法滅酶、離心去除菌體，活性炭吸附后硅藻土過濾去除雜蛋白和色素等手段對(duì)發(fā)酵液中HA-Na進(jìn)行提純， 再通過95%乙醇沉淀、無水乙醇脫水干燥，制得成品HA-Na。經(jīng)測定，成品分子量為2. 0 2. 2 X IO6D,糖醛酸含量為42. 4 43. 5%，特性粘度為3064 3115，蛋白含量<0. 1%分子量。
上述的采用復(fù)合氨基酸液培養(yǎng)基對(duì)獸疫鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法， 包括如下步驟
1)、菌種
菌名Sti^ptococcus zooepidemicus ；購自ATCC (美國典型微生物菌種保藏中心)編號(hào)=35247 ；
2)、培養(yǎng)基成分配制如下(注以下培養(yǎng)基用水均為注射用水)
I菌種斜面培養(yǎng)基(g/L)
酵母粉5 15 ；葡萄糖0· 5 2 ；MgSO4 · 7H20 1 3 ；瓊脂20
用10%Na0H溶液調(diào)節(jié)pH值至7. O于121°C滅菌15min ；
II種子液培養(yǎng)基
H組分葡萄糖5 20g, MgSO4 · 7H20 1 5g力口 50mL水溶解，121°C滅菌15min ；
G組分在500mL三角燒瓶中加酵母粉1 4g，KH2PO4 0. 1 0. 8g，Na2HPO4 0. 04 0. 3g, NaH2PO4 0. · 02 0. 2g, NaHCO3 0. 02 0. lg, CaCO3 1 3g,生長液 0. 05 0. 4mL 加 90mL水溶解，用10%Na0H溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 0，121°C滅菌15min，備用；
接種前將H組分無菌分裝于G組分中，各分裝IOmL所述的生長液配方(g/L)NaCl1. 5 3 ；CaCl20. 02 0. 06 ；MnSO4 ·H2O0. 01 0. 04 ；NaH2CO35 20 ；CuSO4 ·5H200. 01 0. 025 ；Na2HPO4 12H2016 36 ；NaH2PO4 12H2010 25 ；III發(fā)藤好咅養(yǎng)基每升發(fā)I酵液各組分的體積含量如下A組分300mLB組分20mlC組分1 4mLD組分150mLE組分50mL
余量為水；
A 組分蔗糖 50 85g，MgSO4 · 7H20 2. 0g, K2SO4 0· 3 lg, NaH2PO4 1 2g，于 300mL注射用水中溶解；
B組分氨基酸復(fù)合液配方(g/L) 丙氨酸2. 4 4. 4
精氨酸1. 5 2. 5天冬氨酸3. 5 4. 5
胱氨酸0. 35 0. 55
谷氨酸0. 57 0. 77
甘氨酸1. 3 3. 3
組氨酸0. 7 1. 7
異亮氨酸1. 3 3. 3
酪氨酸1.0 3. 6
亮氨酸1. 5 4. 5
賴氨酸2. 0 4. 5
甲硫氨酸0. 2 1. 3
苯丙氨酸1.0 2. 5
脯氨酸1. 0 2. 5
蘇氨酸1.0 3.0
色氨酸0. 1 1. 5
纈氨酸1. 0 3. 5
絲氨酸1. 5 3. 5
谷氨酰胺0. 3 1
尿嘧啶0. 2 1
天冬氨酸0. 2 1 C組分生長液配方(g/L)
NaCl1. 5 3 ；
CaCl20. 02 0. 06 ；
MnSO4 · H2O0. 01 0. 04 ；
NaH2CO35 20 ；
CuSO4 · 5Η200. 01 0. 025 ；
Na2HPO4 · 12H2016 36 ；
NaH2PO4 · 12H2010 25 ；
D組分蔗糖10 30g加150mL水溶解
E組分L-精氨酸鹽酸鹽0. 05 0. 2g加50mL水溶解，121°C滅菌15min。將溶液A組分、C組分、D組分、E組分分別滅菌，B組分用0. 22um無菌濾膜過濾除菌，后將各組分以無菌方式加入到發(fā)酵罐中，不足體積用注射用水補(bǔ)充。3)、種子培養(yǎng)
所用的培養(yǎng)基為步驟(1)所述的斜面種子培養(yǎng)基，將保存-86°C的冰箱內(nèi)的獸疫鏈球菌(Str印tococcus zooepidemicus)的甘油管經(jīng)梯度解凍，于無菌操作下挑取適量接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h，最終得到斜面菌種獸疫鏈球菌；
將上述所得的斜面菌種獸疫鏈球菌挑取4 10環(huán)接種于步驟(1)所述的種子培養(yǎng)基中，30 40°C培養(yǎng)10-18h，轉(zhuǎn)速為150 250rpm，得發(fā)酵用的種子液； 4)、發(fā)酵培養(yǎng)
將步驟(2)所得的發(fā)酵用種子液按5% 20%的量接種于步驟(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程溫度控制為30 40°C，用步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的F組分調(diào)節(jié)控制PH值為6. 5 7. 5，同時(shí)控制空氣流量7L/min，轉(zhuǎn)速為150 400rpm，發(fā)酵時(shí)間為20 40h ；
發(fā)酵過程，約培養(yǎng)時(shí)間為16h時(shí)，用步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的D組分進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料方式為批補(bǔ)；
5)、分離提取透明質(zhì)酸鈉
取步驟(3)所得的發(fā)酵液，用濃度為50%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH為4. 0 6. 0，維持0. 5 3h,后用濃度為10%的氫氧化鈉溶液回調(diào)至ph5. 0 7. 0后于3000 6000r/min冷凍離心 5 20min，收集上清液；
在上述上清液中加入1 5%的活性碳，震搖0. 5 3h，除色素、雜蛋白后的上清液再用珍珠巖或硅藻土做助濾劑，用孔徑為1. 5 10 μ m的濾布進(jìn)行抽濾，收集濾液；
所得的濾液加1 5倍95%的乙醇醇沉，收集沉淀，所得沉淀再用無水乙醇脫水處理 1 3次，丙酮脫水1 3次，真空干燥，最終得透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明采用復(fù)合氨基酸液代替?zhèn)鹘y(tǒng)酵母粉或酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，可有效降低培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的含量，也減少了酵母粉或酵母膏自身及滅菌過程中產(chǎn)生的色素，同時(shí)減少了后期對(duì)發(fā)酵液中HA-Na提取純化的工藝步驟，有效防止了 HA-Na在提取過程中的產(chǎn)量和分子量的損失，并且有效地降低了工業(yè)生產(chǎn)中后期提取階段的成本，最終得到的HA-Na 的分子量為2. 0 2. 2 X IO6D,糖醛酸含量為42. 4 43. 5%，特性粘度為3064 3115，蛋白含量<0. 1%分子量。另外，此方法不僅在實(shí)驗(yàn)室中可以方便實(shí)施，而且由于其不需高要求的提取手段 (如超濾)，極易在工業(yè)上推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明的HA-Na產(chǎn)品的各指標(biāo)的檢測方法包括糖醛酸含量測定、蛋白質(zhì)含量測定、粘度測定、乙醇?xì)埩袅繙y定等均參照國家醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YY0308-2004 ；
本發(fā)明檢測所用主要的儀器
紫外可見分光光度計(jì)UV2100上海尤尼柯科技有限公司烏式粘度計(jì)0.56mm 江蘇海門玻璃儀器廠
恒溫?cái)嚢杷″?76-1 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠氣相色譜儀AGLIENT 5890A
本發(fā)明所用的原料、試劑均采購于中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。實(shí)施例1
采用本發(fā)明的復(fù)合氨基酸液培養(yǎng)基500mL搖瓶進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)HA-Na
培養(yǎng)基中氨基酸復(fù)合液配比為(g/L) 丙氨酸 3.4 精氨酸 2.0 天冬氨酸 4. 0 胱氨酸 4.0 谷氨酸 0.4 甘氨酸 0. 6組氨酸1. 1異亮氨酸2.1酪氨酸2.2亮氨酸3. 1賴氨酸3.2甲硫氨酸1.0苯丙氨酸1. 8脯氨酸1.5蘇氨酸2.0色氨酸0. 8纈氨酸1.7絲氨酸2.1谷氨酰胺0. 7尿嘧啶0.6天冬氨酸0.8
將保存_86°C的冰箱內(nèi)的獸疫鏈球菌(Sti^ptococcus zooepidemicus)的甘油管經(jīng)梯度解凍，于無菌操作下挑取適量接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h，最終得到斜面菌種獸疫鏈球菌；
將斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，于35°C、300rpm培養(yǎng)IOh后按接種量20%，接種于 500ml三角搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為350rpm，控制pH值在6. 8 7. 3之間，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到30h，終止發(fā)酵。將上述的500ml三角瓶的最終發(fā)酵液用50%三氯乙酸調(diào)整pH值至4. 0，維持2h， 后回調(diào)至7. 5 ；將發(fā)酵液以4000rpm離心20min，取上清液；
在上清液中加入2%活性炭于低溫下震搖2h，硅藻土抽濾，取濾液并向?yàn)V液中加入 3倍體積95%乙醇沉淀HA-Na并收集；后無水乙醇浸泡HA-Na30min，再用無水丙酮浸泡 HA-Na30min,后真空干燥12h，干燥后即為HA-Na產(chǎn)品。將所得到的HA-Na產(chǎn)品進(jìn)行檢查，其檢測結(jié)果見下表。實(shí)施例2
采用本發(fā)明的復(fù)合氨基酸液培養(yǎng)基500mL搖瓶進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)HA-Na
培養(yǎng)基中氨基酸復(fù)合液配比為(g/L):
丙氨酸 2.4精氨酸1.5天冬氨酸3.5胱氨酸 0.35谷氨酸0.57甘氨酸1.3組氨酸 0.7異亮氨酸1.3酪氨酸1.0亮氨酸 1.5賴氨酸2.0甲硫氨酸0.2苯丙氨酸1.0脯氨酸1.0蘇氨酸1.0色氨酸 0.1纈氨酸1.0絲氨酸1.5谷氨酰胺0.3尿嘧啶0.2天冬氨酸0.2
培養(yǎng)及提取方法均與實(shí)施例1相同，對(duì)所得到HA-Na產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測，結(jié)果見下表1。 實(shí)施例3
采用本發(fā)明的復(fù)合氨基酸液培養(yǎng)基500mL搖瓶進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)HA-Na
發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸復(fù)合液配比為(g/L):
丙氨酸4. 4精氨酸2. 5天冬氨酸4.5胱氨酸0. 55谷氨酸0. 77甘氨酸 3. 3組氨酸1. 7異亮氨酸3. 3酪氨酸3. 6亮氨酸4. 5賴氨酸4. 5甲硫氨酸1. 3苯丙氨酸2. 5脯氨酸2. 5蘇氨酸3. 0色氨酸1. 5纈氨酸3. 5絲氨酸3. 5谷氨酰胺1. 0尿嘧啶1. 0天冬氨酸1. 0培養(yǎng)及提取方法均與實(shí)施例1相同，對(duì)所得到HA-Na產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測，結(jié)果見下表1。對(duì)照實(shí)施例1
采用傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基500mL搖瓶進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)HA-Na
培養(yǎng)方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于發(fā)酵培養(yǎng)基中B組分氮源采用傳統(tǒng)的氮源酵母膏。后期對(duì)發(fā)酵液的處理，在醇沉前將發(fā)酵液過陶瓷超濾膜(截留范圍IXlO5D),后向?yàn)V液中加入3倍體積95%乙醇沉淀HA-Na并收集；后無水乙醇浸泡HA-Na30min，再用無水丙酮浸泡HA-Na30min，后真空干燥12h，干燥后即為HA-Na成品，對(duì)所得到HA-Na產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測，結(jié)果見下表1。表1透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量表
權(quán)利要求
1. 一種獸疫鏈球菌(Str印tococcus zoo印idemicus)發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉所用的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括A組分、C組分、D組分和E組分，其特征在于還包括B組分，其中每升發(fā)酵液含各組分的體積含量如下A組分 C組分300mLB組分20ml4mLD組分150mLE組分50mL余量為水； A組分蔗糖50 300mL注射用水溶解；B組分氨基酸復(fù)合液配方(g/L)85g, MgSO4 · 7H20 2. 0g, K2SO4 0· 3 lg, NaH2PO4 1 2g，用以下成分均用注射用水溶解丙氨酸2. 4 --4.4精氨酸1. 5 --2.5天冬氨酸3. 5 --4.5胱氨酸0. 35 --0.55谷氨酸0. 57 --0.77甘氨酸1. 3 --3.3組氨酸0. 7 --1.7異亮氨酸1. 3 --3.3酪氨酸1. 0 --3.6苯丙氨酸脯氨酸蘇氨酸色氨酸纈氨酸絲氨酸谷氨酰胺尿嘧啶天冬氨酸亮氨酸賴氨酸甲硫氨酸 1. 0 -1. 0 -1. 0 -0. 1 -1. 0 -1. 5 -0. 3 0. 2 0. 2.4. 4. 1..2. 5.2.5.3.0 1. 5 3. 5 3. 5 -1 -1 -1C組分生長液配方(g/L)以下成分均用注射用水溶解；NaCl1. 5 ‘3 CaCl20. 02 --0..06MnSO4 ·H2O0. 01 -0.04 ；NaH2CO35 20 ；CuSO4 ·5H900. 01 乂 0.025Na2HPO4 · 12H2016 36 ；NaH2PO4 · 12H2010 25 ；D組分蔗糖10 30g加150mL注射用水溶解； E組分L-精氨酸鹽酸鹽0. 05 0. 2g加50mL注射用水溶解。
2.利用如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于包括如下步驟(1)、培養(yǎng)基成分配制(注以下培養(yǎng)基用水均為注射用水)①、菌種斜面培養(yǎng)基(g/L) 酵母粉5 15 葡萄糖 0. 5 2 MgSO4 · 7H20 1 3 瓊脂 20用10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 0于121°C滅菌15min ；②、種子液培養(yǎng)基H 組分蔗糖 5 20g, MgSO4 · 7H20 1 5g 力口 50mL 水溶解，121°C滅菌 15min ； G組分在500mL三角燒瓶中加酵母粉1 4g，KH2PO4 0. 1 0. 8g，Na2HPO4 0. 04 0. 3g, NaH2PO4 0. · 02 0. 2g, NaHCO3 0. 02 0. lg, CaCO3 1 3g,生長液 0. 05 0. 4mL 加 90mL水溶解，用10%Na0H溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 0，121°C滅菌15min，備用；接種前將H組分無菌分裝于G組分中，各分裝IOmL所述的生長液配方(g/L)NaCl1. 5 3 ；CaCl20. 02 0. 06 ；MnSO4 ·H2O0. 01 0. 04 ；NaH2CO35 20 ；CuSO4 ·5H200. 01 0. 025 ；Na2HPO4 12H2016 36 ；NaH2PO4 12H2010 25 ；③、發(fā)藤好咅養(yǎng)基每升發(fā)I酵液含各組分的體積含量如下A組分300mLB組分20mLC組分1 4mLD組分150mLE組分50mLA 組分蔗糖 50 85g，MgSO4 · 7H20 2. 0g, K2SO4 0· 3 lg, NaH2PO4 1 2g，于 300mL注射用水中溶解；B組分氨基酸復(fù)合液配方(g/L) 丙氨酸2. 4 4. 4精氨酸1. 5 2. 5天冬氨酸3.5 4. 5胱氨酸0.35 0. 55谷氨酸0.57 0. 77甘氨酸1.3 3. 3組氨酸0.7 1. 7異亮氨酸1.3 3. 3酪氨酸1.0 3. 6亮氨酸1.5 4. 5賴氨酸2.0 4. 5甲硫氨酸0.2 1. 3苯丙氨酸1.0 2. 5脯氨酸1. 0 2. 5蘇氨酸1. 0 3. 0色氨酸0. 1 1. 5纈氨酸1. 0 3. 5絲氨酸1. 5 3. 5谷氨酰胺 0.3 1尿嘧啶 0.2 1天冬氨酸 0.2 1C組分:生長液配方(g/L)NaCl 1.5 3；CaCl20.02 0.06；MnSO4 ·H2O 0.01 0.04；NaH2CO35 20；CuSO4·5H20 0.01 0.025；Na2HPO4 · 12H2016 36；NaH2PO4 ·12H20 10 25；D組分蔗糖10 30g加150mL水溶解E組分L-精氨酸鹽酸鹽0. 05 0. 2g加50mL水溶解，121°C滅菌15min將溶液A組分、C組分、D組分、E組分分別滅菌，B組分用0. 22um無菌濾膜過濾除菌，后將各組分以無菌方式加入到發(fā)酵罐中，不足體積用注射用水補(bǔ)充；(2)、種子培養(yǎng)斜面種子培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為步驟(1)所述的斜面種子培養(yǎng)基，將保存_86°C的冰箱內(nèi)的獸疫鏈球菌(Str印tococcus zooepidemicus)的甘油管經(jīng)梯度解凍，于無菌操作下挑取適量接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h，最終得到斜面菌種獸疫鏈球菌；將上述所得的斜面菌種獸疫鏈球菌挑取4 10環(huán)接種于步驟(1)所述的種子培養(yǎng)基中，30 40°C培養(yǎng)10-18h，轉(zhuǎn)速為150 250rpm，得發(fā)酵用的種子液；(3)、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(2)所得的發(fā)酵用種子液按5% 20%的量接種于步驟(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程溫度控制為30 40°C，用步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的F組分調(diào)節(jié)控制PH值為6. 5 7. 5，同時(shí)控制空氣流量7L/min，轉(zhuǎn)速為150 400rpm，發(fā)酵時(shí)間為20 40h ；發(fā)酵過程，約培養(yǎng)時(shí)間為16h時(shí)，用步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的D組分進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料方式為批補(bǔ)；(4)、分離提取透明質(zhì)酸鈉取步驟(3)所得的發(fā)酵液，用濃度為50%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH為4. 0 6. 0，維持0. 5 3h,后用濃度為10%的氫氧化鈉溶液回調(diào)至ph5. 0 7. 0后于3000 6000r/min冷凍離心 5 20min，收集上清液；再從上清液中提取透明質(zhì)酸鈉。
3.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)透明質(zhì)酸鈉的過程中，控制溫度為30 40°C，pH值為6. 5 7. 5，空氣流量為5 7L/ min，轉(zhuǎn)速為150 400rpm，發(fā)酵時(shí)間為20 40h。
4.如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)透明質(zhì)酸鈉的過程中用NaOH水溶液調(diào)節(jié)控制pH值。
5.如權(quán)利要求4所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)透明質(zhì)酸鈉的過程中優(yōu)選用5mol/LNa0H水溶液調(diào)節(jié)控制pH值。
6.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于發(fā)酵過程，約培養(yǎng)時(shí)間為16h時(shí)，用步驟(1)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的D組分進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料方式為批補(bǔ)。
7.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于步驟(4)所述的從上清液中提取透明質(zhì)酸鈉的過程如下向上清液中加入占其質(zhì)量1 5%的活性碳，震搖0. 5 3h，除色素、雜蛋白，再用珍珠巖或硅藻土做助濾劑，用孔徑為1.5 10 μ m的濾布進(jìn)行抽濾，收集濾液；向所得的濾液中加1 5倍95%的乙醇醇沉，收集沉淀，沉淀用無水乙醇脫水處理1 3次，再用丙酮脫水1 3次，真空干燥，即得透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品。
8.如權(quán)利要求7所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于所述的從上清液中提取透明質(zhì)酸鈉的過程的真空干燥，過程控制壓力為-0. IMPa，溫度為室溫。
9.如權(quán)利要求2 8任一權(quán)利要求所述的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的方法所得的透明質(zhì)酸鈉，其特征在于其分子量為2. 0 2. 2 X IO6D,糖醛酸含量為42. 4 43. 5%，特性粘度為 3064 3115，蛋白含量<0. 1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用氨基酸復(fù)合液作為氮源發(fā)酵生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸鈉的新方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸鈉的方法是利用氨基酸復(fù)合液代替酵母膏或酵母粉作為獸疫鏈球菌的發(fā)酵氮源。通過發(fā)酵過程控制，得到分子量為2.2×106D的HA-Na。將本發(fā)明應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，一方面可有效降低發(fā)酵液中雜蛋白和色素的含量，減少后期HA-Na提取的工序，降低對(duì)發(fā)酵液中HA-Na的分子量在提取過程中的物化損傷；另一方面可降低HA-Na生產(chǎn)成本，具有較高工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。通過此方法生產(chǎn)的HA-Na的分子量為2.0～2.2×106D，糖醛酸含量為42.4～43.5%，特性粘度為3064～3115，蛋白含量<0.1%。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102242165SQ20111013798
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者丁保妹, 侯永泰, 管世敏, 榮紹豐, 陳奕涵 申請(qǐng)人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院