專利名稱：通過LXRa基因多態(tài)性進行牛育種方法
技術領域：
本發(fā)明涉及牛育種方法，具體涉及通過牛LXRa基因多態(tài)性檢測來進行牛育種的方法。
背景技術：
牛肉肉質鮮美、營養(yǎng)豐富、蛋白質含量要比一般肉類高，其不僅含有人類所必需的一切氨基酸，還具有低膽固醇、低脂肪的優(yōu)點，是人類肉類食品中的佳品。從上世紀60年代開始，國際市場對牛肉的需求持續(xù)增長，世界的肉牛業(yè)在快速發(fā)展，而我國也成為繼美國、 巴西之后的世界第三大牛肉生產(chǎn)國。隨著人民生活水平的不斷提高，肉食結構的改善，牛肉的消費量呈現(xiàn)持續(xù)增長的局面，目前我國每年仍需要進口大量的高檔牛肉。優(yōu)質牛肉產(chǎn)品成為世界人民消費的發(fā)展趨勢，但牛肉質量正成為制約我國肉牛業(yè)發(fā)展的一個瓶頸。培育優(yōu)質的肉牛品種一要注重生長速度、肌肉豐度和育肥速度；二要重視肉質性狀和生長性狀。在西方國家，肌內(nèi)脂肪、嫩度、背膘厚等指標是作為育種的重要指標；在東方國家，日本和韓國特別重視從本國的役用牛品種培育出適合自己本國人民口味的優(yōu)質肉牛品種。意大利皮埃蒙特牛、日本和牛及韓國韓牛都是從本土品種選育而成的頗具特色的優(yōu)質肉牛品種，其品味獨特、肉質優(yōu)良、產(chǎn)肉率高，價格也比其他牛肉高。肉牛品種是肉牛產(chǎn)業(yè)中的關鍵，要生產(chǎn)高品質的牛肉就需要有優(yōu)良的肉牛品種。 我國的黃牛品種資源豐富、肉質良好、適應性強，有清香之特色，是世界牛品種資源的寶庫。 但我國黃牛在歷史上以役用為主，要作為規(guī)模化產(chǎn)肉品種還是有一些差距的。我國本地黃牛多具有產(chǎn)肉少、育肥速度慢、后軀不發(fā)達的缺點，加之品種內(nèi)個體間肉用性能差異較大 (陳幼春，2001)，沒有系統(tǒng)化的選育，高檔肉塊相對較少，因而肉牛生產(chǎn)的規(guī)模和效益與國外專門化肉牛品種相比較差。但在一些群體或者部分個體上，我國本地黃牛具有很好的肉用性能(陳幼春，1990 ；邱懷，1986)，若經(jīng)過高強度的品種內(nèi)選育，很有可能在較短時間內(nèi)培育出我國特有的優(yōu)質肉牛品種。在育種進程中，韓牛和皮埃蒙特牛為了保持自身品種牛肉肉質的特性沒有引入外源血統(tǒng)，而是通過純繁育種選育的，這為我國本地黃牛選育提供了豐富的經(jīng)驗(許尚忠， 2005)。我國育種工作者從1981年開始通過引種和雜交等方法對本地黃牛品種進行改良， 經(jīng)過20年的努力成功選育了中國西門塔爾牛品種，這是一個肉乳兼用的新品種。2007年， 我國又成功培育了 “夏南牛”，這是我們國家第一個肉牛品種，它是以法國夏洛來牛為父本， 我國本地黃牛南陽牛為母本，采用了正反回交、導入雜交和橫交固定的育種技術培育出來的，填補了我們國家肉牛品種的空白。但引進外來品種和我國本地品種雜交并不能從根本上加快我國肉牛業(yè)的發(fā)展，新品種也不一定能很快適應當?shù)氐淖匀粭l件及人民的口味的需要，同時也不能最大效率的利用我國優(yōu)良的地方品種資源。據(jù)報道，我國本地黃牛品種，如秦川牛和晉南牛分別有5-10%和20- %的個體不亞于國外優(yōu)質肉牛品種的性能特點(張英漢，2001)。因此，我們要充分利用本地黃牛品種的優(yōu)質資源，應用現(xiàn)代分子生物技術并結合傳統(tǒng)育種方法，培育具有我國特色的優(yōu)良品質肉牛。
魯西牛魯西牛(LuXi Cattle, LX)主要分布于山東省菏澤市，作為五大地方良種黃牛之一，其生長速度較快、肉用性能好、役用能力強，肉質細嫩、柔軟多汁、大理石花紋明顯，耐粗飼，體軀高大結實、性情溫和，是選育中國肉牛的基礎(石璞等2006)。缺點是需要耗費大量的粗、精飼料，現(xiàn)牛存欄數(shù)少，雜交利用過度，對純種保護沒有重視(王淑輝等2007)。郟縣紅牛郟縣紅牛(JiaXian Catltle，JX)主產(chǎn)于我國河南省平頂山市郟縣及周邊地區(qū)，是我國八大優(yōu)良地方黃牛品種之一。其體格較大、結構勻稱、體質結實、肌肉發(fā)達，被毛紅色、 毛短且富有光澤，遺傳穩(wěn)定、抗逆性強且耐粗飼，對地理環(huán)境的適應性及分布的廣泛性是其他品種不可比擬的(張花菊等2005，2006)。郟縣紅牛肉用性能較好，具有明顯的大理石花紋，肉質細嫩、肉味香醇、色澤鮮紅，具有很好的生產(chǎn)潛力，可以向肉役兼用型、肉用型牛品種發(fā)展，缺點是后軀不發(fā)達、生長緩慢(馬桂變等2009)。秦川牛秦川牛^jinChuan Cattle, QC)主要分布于陜西關中一帶，因產(chǎn)于八百里秦川而得名，在地方黃牛品種中體型最高大。其皮質優(yōu)良、肉質鮮美、適應性強、遺傳穩(wěn)定、役肉兼用， 被譽為“國之瑰寶”(蔣洪茂等1993)，是中國五大優(yōu)良黃牛品種之一，在國際市場上占有重要的地位，國內(nèi)市場上也高于其它牛品種價格。缺點是產(chǎn)肉效率低、飼料利用率低，正在向肉牛品種的方向選育(陳宏等2002 ；張巖2004)。南陽牛南陽牛(NangYang Cattle，NY)主要分布于河南省南陽市，是我國五大優(yōu)良黃牛品種之一，役肉兼用型的黃牛品種。其體型高大、結構緊湊、皮薄毛細、肌肉發(fā)達、耐粗飼，產(chǎn)肉能力強、大理石紋明顯、肉質細嫩，毛色以黃色為主(王冠立2000 ；張玉才等2010)。缺點是生長發(fā)育緩慢、不耐寒、產(chǎn)肉率一般、飼料利用率低(王建欽2006)。DNA分子標記是指能夠反映生物種群間或個體間基因組上某段DNA片段差異性的技術，常用電泳譜帶的形式直接反映DNA水平上的遺傳多態(tài)性，這項研究開始于19世紀80 年代。隨著DNA分子標記研究的深入，它在動物遺傳及動物育種上也發(fā)揮了重要作用。分子育種即分子標記輔助選擇育種(MAS)，是應用分子數(shù)量遺傳學的理論及技術來改良畜禽品種，是傳統(tǒng)育種理論和方法的發(fā)展，其包括轉基因動物育種和基因組育種。前者采用基因轉移技術，外源DNA被導入另種動物基因組上，培育出新品系；其是在DNA水平上對目標性狀的基因進行選擇，選種準確率得到很大提高，且選育時間由傳統(tǒng)育種的8 10代縮短到2 3代，克服了傳統(tǒng)動物育種方法的缺陷，加快了品種改良和新品種培育的進展(陳宏等2008 ；陳丹霞等2009)。后者是以基因組和比較基因組研究為基礎，利用DNA 分子標記技術對動物數(shù)量性狀基因座位進行篩選，或者通過標記輔助淘汰清除不利基因而達到改良品系性狀的目的。DNA分子標記可以用來構建家畜的基因圖譜、預測家畜雜種優(yōu)勢、鑒定品種或個體、分析親緣關系或遺傳分化和保護遺傳資源。在肉牛育種進程中，育種工作者希望通過選擇與生長或肉質性狀密切相關的DNA標記，達到提高育種準確性和早期選種的目的，以期在動物品種選育中獲得較快的進展。隨著基因組計劃的逐步實施以及深入發(fā)展，分子標記育種已經(jīng)在動物遺傳育種過程中發(fā)揮著愈來愈重要的作用，也正不斷呈現(xiàn)出廣闊的應用前景，并帶來巨大的效用和經(jīng)濟價值。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphisms, SNPs)是基因組 DNA 序列中某一個特定核苷酸發(fā)生改變而引起的多態(tài)性，它包括單個堿基的插入或者缺失、堿基轉換或者顛換等，是生物基因組中最廣泛存在的一類變異(劉萬清等1998 ；Halushka M K等 1999)。1996年，這個概念由美國人Lander提出，被稱為“第三代DNA遺傳標記”。前兩代以序列的長度差異作為遺傳標記，SNPs則是以由單個堿基改變而造成的單鏈構象的差異為標記。SNI^s分布廣泛，每一千個核苷酸中就可能出現(xiàn)一個堿基突變(Bond C等1998)。SWs的特點是(1)高多態(tài)性。雖然每個SNP就只有2種變異體，其變異程度也不如微衛(wèi)星或者小衛(wèi)星DNA強，但是在整體上SNPs數(shù)量巨大，占基因組所有已知多態(tài)性的90% 以上(Lewis R 2002)。( 高遺傳穩(wěn)定性。SNPs的遺傳穩(wěn)定性高，在漫長歷史上先形成的SNPs在群體中會穩(wěn)定遺傳，常有很高的頻率，而后形成的則所占的頻率較低(BrookesA J1999)。同時，SM^s在各地各群體中所占比例也并非相同，但仍然有大約85%是共通的 (Cargill M 1999)。(3)檢測方法多。SNP是由單個核苷酸突變引起的，凡是可以檢測點突變的方法都可以用于鑒定SWs位點。檢測分析SNPs的技術很多，常用且有代表性的有限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、單鏈構象多態(tài)性分析(single strand conformaion polymorphism，SSCP)、寡核苷酸連接分析 (οligo-nucleotide ligation assay，OIJV)、$f生梯月交電^永分(denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)等(方唯意等 2003)。本實驗中采用的是 RFLP、SSCP 和 DNA 直接測序法。(4)功用廣泛。DNA分子標記的的研究一直很活躍，其功用也十分廣泛。研究者們常利用DNA分子標記技術對可以用家畜基因圖譜進行構建，鑒定分析品種優(yōu)勢和起源進化等，對保護生物多樣性和遺傳資源發(fā)揮了重要作用。肝χ 受體(liver X receptors, LXRs)家族有兩個亞型，LXRa (NR1H3)及 LXR^ (NR1H2)，是 1994年在人和鼠上分離得到的(Apfel et al. 1994 ；Shinar et al. 1994 ； Song etal. 1994)。LXRi^在各組織中都有表達，LXRα則僅僅在脂類代謝旺盛的組織表達， 如肝臟、腎臟、脾臟和腸Olin et al. 2009)。序列分析表明LXRα和LXRi^在配體結合區(qū)及 DNA結合區(qū)具有77%的高同源性。LXR α結構中包含核心的DNA結合區(qū)(DBD)和配體結合區(qū)(LBD)，與維甲酸X受體 (RXR)結合形成異源二聚體LXR/RXR，再與配體結合后引起異源二聚體與靶基因上特異的 DNA元件(LXRE)結合，從而調節(jié)靶基因在轉錄水平上的表達。此途徑在維持機體內(nèi)膽固醇和脂肪的代謝平衡中具有非常重要的作用(Wu and Zhao 2009 ；Kim etal. 2008)。LXRa調控Angptl3基因，可激活甾醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory elementbinding protein-lC, SREBPlC)的表達，從而在脂肪酸代謝中也發(fā)揮重要作用， 導致肝臟內(nèi)脂肪的積聚和血漿中甘油三酯水平的升高，甚至引起肝脂肪變性(黃曉宇等 2006 ；ChaJY et al. 2007 ；Zhou J et al. 2008 ；Yan qin et al. 2009)。韓春春發(fā)現(xiàn)鵝 LXR α mRNA基因在填飼條件下表達豐度增加(韓春春等2009)。于浩則發(fā)現(xiàn)豬LXR α基因的表達在3-12月齡間隨著月齡的增大表達量增加(于浩等2009)。LXRa介導的信號轉導途徑對膽固醇合成、外源膽固醇的吸收及逆轉運有重要調節(jié)作用(Millatt LJ et al. 2003)。 當膽固醇在血管壁細胞內(nèi)過多時，通過激活細胞膜上ATP結合盒轉運子Al (ABCAl)將細胞內(nèi)多余的膽固醇轉移到血漿HDL分子上運回肝臟代謝，這一過程稱為膽固醇的逆向轉運(reverse cholesterol transport，RCT) (Sabine Rode et al. 2008 ；朱靜和王素莉2009)。 LXRa也是糖代謝的重要調控者(Stuinig et al. 2002)。LXR α能被胰島素誘導表達，抑制糖異生關鍵酶(曾建濤等2008)，故LXRa可作為糖尿病治療中重要的藥物作用靶點。LXRa 還參與調節(jié)特異與非特異的免疫反應。LXRa基因敲除小鼠更容易感染李斯特(Listeria) 細菌，而LXRi3基因敲除小鼠沒有這種現(xiàn)象，這表明LXRα發(fā)揮了重要的保護作用(Jowph SB et al. 2004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，通過分析牛LXRa基因的單核苷酸多態(tài)性，并將其與生產(chǎn)性狀進行關聯(lián)分析，以篩選出SNP位點以輔之于育種，加快牛育種進程。為了實現(xiàn)上目的，本發(fā)明采取如下技術方案一種基于LXRa基因多態(tài)性進行牛育種的方法，篩選具有特定LXRa基因的牛作為父本和/或母本進行育種，其特征在于所述的LXRa基因的1514位點序列TT。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，進一步的，所述的LXRa基因的10 位點序列為CC。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的牛為魯西黃牛或郟縣紅牛，優(yōu)選為魯西黃牛。本發(fā)明還涉及具有特定LXRa基因的牛篩選方法，包括提取待篩選牛的DNA，其特征在于采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATCGTGTCCGACTCTCTGC 作為 PCR 引物對牛 DNA 進行擴增；或者采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATAGCGGACTGCGGCGT 作為 PCR 引物對牛 DNA 進行擴增；并進一步包括對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，還包括GAGTTTTCAGGTCGGAGAGA和 TAGGCACGAGAACCAGCAC作為PCR引物對牛DNA進行擴增；并進一步包括對擴增引物進行凝膠電泳檢測。通過本發(fā)明的方法，能夠培育出在體高、體斜長和腰角寬等指標上都更加優(yōu)良的牛，促進我國的肉牛養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展。


圖1牛LXRa基因Pl (561bp)對引物擴增結果；圖2牛LXRa基因P2 (455bp)和P3(139bp)對引物擴增結果圖3牛LXRa基因Pl對引物測序圖譜圖4牛LXRa基因P2對引物測序圖譜；
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。1引物設計與合成以GenBank公布的牛LXRa基因(登錄號NC_007313)和ANGPTL4基因(登錄號 NC_007305)序列為參照，使用I^rimer Premier 5. 0軟件設計引物，送南京金斯瑞公司合成，具體信息見表1。表1牛LXRa基因和ANGPTL4基因引物相關信息
Table 1 Primers information of bovine LXR α and ANGPTL4 gene
權利要求
1.一種基于LXRa基因多態(tài)性進行牛育種的方法，篩選具有特定LXRa基因的牛作為父本和/或母本進行育種，其特征在于所述的LXRa基因的1514位點序列TT。
2.根據(jù)權利要求1所述的牛育種方法，進一步的，所述的LXRa基因的10 位點序列為CC。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的牛育種方法，所述的牛為魯西黃?；蜞P縣紅牛，優(yōu)選為魯西黃牛。
4.一種特定LXRa基因的牛篩選方法，包括提取待篩選牛的DNA，其特征在于采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATCGTGTCCGACTCTCTGC 作為 PCR 引物對牛 DNA 進行擴增；或者采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATAGCGGACTGCGGCGT 作為 PCR 引物對牛 DNA 進行擴增；并進一步包括對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。
5.根據(jù)權利要求4所述的篩選方法，還包括GAGTTTTCAGGTCGGAGAGA和 TAGGCACGAGAACCAGCAC作為PCR引物對牛DNA進行擴增；并進一步包括對擴增引物進行凝膠電泳檢測。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的牛育種方法，所述的牛為魯西黃?；蜞P縣紅牛，優(yōu)選為魯西黃牛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于LXRa基因多態(tài)性進行牛育種的方法，篩選具有特定LXRa基因的牛作為父本和/或母本進行育種，其特征在于所述的LXRa基因的1514位點序列TT。通過本發(fā)明的方法，能夠培育出在體高、體斜長和腰角寬等指標上都更加優(yōu)良的牛，促進我國的肉牛養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展。
文檔編號C12Q1/68GK102242199SQ20111013615
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權日2011年5月25日
發(fā)明者李芬, 李榮榮, 楊婷, 林峰, 王新莊, 石奎林, 陳寧博, 馬云 申請人:信陽師范學院