專利名稱：用BAC-retrieve的方法同時(shí)構(gòu)建條件基因打靶載體和傳統(tǒng)打靶載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)模型小鼠構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及到用BAC-retrieve的方法同時(shí)構(gòu)建條件基因打靶載體和傳統(tǒng)打靶載體。
背景技術(shù)：
基因敲除(gene knockout)是目前研究基因功能最普遍的技術(shù)平臺(tái)，近年來技術(shù)逐步成熟；其原理是利用同源重組(homologous recombination)的技術(shù)原理，按照研究者的設(shè)計(jì)意圖，在小鼠整體水平上進(jìn)行的可時(shí)空調(diào)控的滅活特定靶基因的理論和技術(shù)；涉及分子生物學(xué)，分子遺傳學(xué)，胚胎學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域。目前基因敲除可以分為以下幾步1.設(shè)計(jì)并構(gòu)建目的基因打靶載體(targeting vector)；2.將線性化的打靶載體通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)；3.小鼠胚胎于細(xì)胞(ES細(xì)胞)的體外培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染后陽性ES細(xì)胞的篩選；4.將篩選出的中靶陽性克隆顯微注射到小鼠囊胚；5.假孕母鼠接受囊胚移植產(chǎn)生出嵌合體小鼠；6.嵌合體小鼠再與囊胚供體小鼠雜交，即可得到雜合型的基因敲除小鼠。在獲得敲除小鼠的步驟中，設(shè)計(jì)和構(gòu)建打靶載體是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其構(gòu)建的好壞直接影響到敲除的成功與否；構(gòu)建速度對(duì)獲得敲除小鼠也有很重要的影響。打靶載體一般由載體骨架、左右同源臂及正負(fù)篩選基因組成。生物學(xué)家們根據(jù)自己的需要不斷改進(jìn)它，現(xiàn)在甚至可以讓特定的基因到了預(yù)定的時(shí)間便開始在生物體內(nèi)停止行使其功能，以避免敲除對(duì)發(fā)育至關(guān)重要的基因時(shí)引起動(dòng)物死亡；還可以讓基因敲除只在特定的組織內(nèi)發(fā)生，使基因的功能研究更具有針對(duì)性。條件性基因敲除獲得純合子小鼠的交配過程比較繁瑣，需要構(gòu)建在特定階段特定組織或細(xì)胞中表達(dá)Cre或FLP重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過與在基因組中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配，可導(dǎo)致子代鼠中特定組織或細(xì)胞中的靶基因被刪除。另一方面，IoxP的引入也難免會(huì)破壞基因組本身的穩(wěn)定性。因此，對(duì)于那些并不致死的基因，我們?nèi)匀豢梢圆捎脗鹘y(tǒng)型的基因打靶方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的第一是提供用BAC-retrieve的方法構(gòu)建條件型打靶載體和傳統(tǒng)型打靶載體的方法；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能由條件性打靶載體轉(zhuǎn)變?yōu)閭鹘y(tǒng)打靶載體的方法。本發(fā)明的目的通過如圖1的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)自Sanger研究所定購的U9BAC克隆被裝入DH108菌株以瓊脂為載體進(jìn)行郵寄。 為使后續(xù)操作易于進(jìn)行，我們首先從100 2001Λ的BAC中將包含左右同源臂的目的片段 (約10 201Λ)套取下來(見圖2-A)。pL253載體中的兩段同源序列各長500bp，是以129基因組DNA為模板，用PCR的方法獲得，經(jīng)內(nèi)切酶消化后連接克隆入PL253載體。利用介于兩段同源序列之間的線性化位點(diǎn)進(jìn)行線性化的PL253載體在EL350中與BAC發(fā)生同源重
組，陽性克隆可用氨芐青霉素篩選獲得。 插入IoxP位點(diǎn)的原理如圖2-B所示。包含兩段各長約70bp同源序列的IoxP-NEO/ Kan-IoxP片段同樣以PCR制備，所不同的是該同源序列包含在PCR的引物進(jìn)行合成。同源重組后的質(zhì)粒同時(shí)具有氨芐青霉素和卡那霉素抗性。重新將質(zhì)粒抽提物轉(zhuǎn)入EL350中可以去除菌株中其它未發(fā)生重組的質(zhì)粒。加入阿拉伯糖后Cre重組酶的表達(dá)可以將IoxP位點(diǎn)間的NEO剪切掉，從而只留下一個(gè)ΙοχΡ。同樣道理我們可以在EL250中插入第二個(gè)ΙοχΡ。 FRT-NEO/Kan-FRT留在載體中可用于ES細(xì)胞的篩選。最終的載體用測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。


圖1利用BAC-retrieve系統(tǒng)構(gòu)建條件性打靶載體的基本步驟示意圖
圖2用PCR的方法來驗(yàn)證訂購的BAC(bMQ-373N20，bMQ-53016)的正確性
圖3小鼠基因TNFAIP1編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息
圖4小鼠TNFAIP1基因的外顯子信息和敲除部位的選擇，套索載體構(gòu)建示意圖
圖5用PCR的方法檢測(cè)第一個(gè)LoxP中neo片段是否已經(jīng)去掉
圖6用PCR的方法檢測(cè)第二個(gè)LoxP是否已經(jīng)插入合并純化情況
圖7用酶切的方法驗(yàn)證載體的正確性
表1』用酶切的方法驗(yàn)證載體的正確性
權(quán)利要求
1.一種兩用型基因打靶載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法選用BAC-retrieve的方法構(gòu)建條件型打靶載體，所構(gòu)建的載體含有正選基因(neo)和負(fù)選基因(tk)，其中，正選基因的兩端各有FRT序列，LoxP序列分別插入到被去掉的目的序列的兩端，該載體在體外表達(dá)重組酶Cre的情況下，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生傳統(tǒng)型打靶載體，所產(chǎn)生的傳統(tǒng)型打靶載體含有正選基因(neo)和負(fù)選基因(tk)，其中，正選基因的兩端各有FRT序列，負(fù)選基因(tk)位于 3’同源臂外側(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的兩用型打靶載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法具體包括下列步驟A，129小鼠品系BAC克隆的查詢及訂購B，含有兩段目的基因同源序列PL253載體的構(gòu)建C，PL253載體與BAC的同源重組D，第一個(gè)LoxP位點(diǎn)的插入E，將IoxP位點(diǎn)間的NEO剪切掉，從而只留下一個(gè)IoxPF，第二個(gè)LoxP位點(diǎn)，以及FRT-NEO-FRT的插入G，用測(cè)序的方法驗(yàn)證載體H，由條件性敲除載體誘導(dǎo)產(chǎn)生傳統(tǒng)型敲除載體
3.一種如權(quán)利要求2所述的第一個(gè)LoxP序列來自載體pMD18-T-Loxp-Neo-LoxP，通過 PCR的方法將Loxp-Neo-LoxP擴(kuò)增出來
4.一種如權(quán)利要求2中所述的第二個(gè)LoxP序列來自載體pMD-18T-frt-neo-frt-loxp， 通過PCR的方法將frt-neo-frt-loxp擴(kuò)增出來
5.一種如權(quán)利要求2所述的由條件性敲除載體誘導(dǎo)產(chǎn)生傳統(tǒng)型敲除載體是通過原核表達(dá)Cre重組酶的方法實(shí)現(xiàn)
6.一種如權(quán)利要求1所述的兩用型打靶載體含有線性化位點(diǎn)Notl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用噬菌體的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)(BAC-retrieve)的方法同時(shí)構(gòu)建含有Cre-LoxP的條件敲除載體(conditional targeting vector)和傳統(tǒng)打靶載體(convetional targeting vector)，用來同時(shí)制作條件基因敲除小鼠和傳統(tǒng)敲除小鼠。該方法擺脫了傳統(tǒng)意義上的打靶載體的構(gòu)建受基因組DNA上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的局限性，更有利于篩選用于后期Southern雜交進(jìn)行陽性克隆篩選時(shí)的內(nèi)切酶的選取，更好區(qū)分重組和野生型染色體，而且更有利于我們對(duì)打靶區(qū)域的選擇，具有高效、省時(shí)、靈活的三大特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102277382SQ20111013578
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者任凱群, 張健, 高翔 申請(qǐng)人:南京大學(xué)