專利名稱：抗殺螟硫磷的單鏈抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)用抗體，具體涉及抗殺螟硫磷的單鏈抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，食品安全問(wèn)題已引起全社會(huì)廣泛的關(guān)注，可是因殘留農(nóng)藥超標(biāo)而造成的食物中毒事件卻時(shí)有發(fā)生，因此農(nóng)藥殘留的檢測(cè)工作顯得尤為重要。殺螟硫磷是目前廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥之一，多年來(lái)，氣相色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜等方法已經(jīng)非常成功地應(yīng)用于農(nóng)藥分析，能精確地檢測(cè)殘留的農(nóng)藥量。然而， 它們需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的前處理、熟練的技術(shù)人員及較長(zhǎng)的分析周期；因此，人們迫切希望一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、價(jià)廉的檢測(cè)技術(shù)，能在野外或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)進(jìn)行大批量的檢測(cè)和篩選試驗(yàn)。酶免疫分析(EIA，enzyme immunoassay)技術(shù)近年來(lái)脫穎而出，尤其在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域，應(yīng)用十分廣泛。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，農(nóng)藥殘留酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)得到了迅速發(fā)展，美國(guó)化學(xué)會(huì)(AOAC)已將免疫分析與氣相色譜、液相色譜同列為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的3大支柱技術(shù)。
免疫分析法是以抗原-抗體的特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，獲得高親和力和特異性的抗體是免疫分析成功的關(guān)鍵。單鏈抗體(ScFv，single-chain variable fragment)是由免疫球蛋白的VH(重鏈可變區(qū))和VL(輕鏈可變區(qū))通過(guò)一段連接肽連接而成的重組蛋白，它是保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段，具有分子小、免疫原性弱、穿透力強(qiáng)、便于操作等優(yōu)點(diǎn)，因此在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。目前尚無(wú)制備抗殺螟硫磷單鏈抗體的有關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供抗殺螟硫磷的單鏈抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供上述抗殺螟硫磷單鏈抗體的制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的
一種抗殺螟硫磷的單鏈抗體&FV-LD76，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列為 SEQ ID NO 1。上述SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的單鏈抗體&FV-LD76，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4。一種抗殺螟硫磷的單鏈抗體&FV-LE18，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列為 SEQ ID NO :2ο上述SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列的單鏈抗體&FV-LE18，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5。一種抗殺螟硫磷的單鏈抗體&FV-LE39，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列為 SEQ ID NO :3ο
上述SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的單鏈抗體&FV-LE39，其核苷酸序列如SEQ ID NO :6。上述抗殺螟硫磷單鏈抗體的制備方法，按如下步驟進(jìn)行
(1)用免疫抗原殺螟硫磷-BSA(牛血清白蛋白)免疫小鼠，取小鼠的脾臟細(xì)胞提取總 RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA ；
(2)以上述cDNA為模板擴(kuò)增全套的VH、VL基因，拼接構(gòu)建抗殺螟硫磷全套單鏈抗體 DNA文庫(kù)；
(3)將上述單鏈抗體DNA文庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯；
(4)以殺螟硫磷-OVA(卵清蛋白)作為篩選抗原，對(duì)上述單鏈抗體DNA文庫(kù)體外翻譯完成的產(chǎn)物進(jìn)行親和篩選，再反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到篩選后的單鏈抗體DNA文庫(kù)；
(5)將上述篩選后的單鏈抗體基因與載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)；再經(jīng)ELISA篩選、Biacore篩選得到高親和力和高特異性的抗殺螟硫磷單鏈抗體。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明抗殺螟硫磷單鏈抗體具有很高的特異性、親和力；ScFv-LD76、ScFv-LE18, ScFv-LE39檢測(cè)殺螟硫磷時(shí)的最低檢測(cè)限分別是0.02、0. 07和0.01 ng /ml, IC50 (50%inhibiting concentration，半抑制濃度)分別是1· 6、3.4 和 2.2 ng/ml，用 Biacore測(cè)定該組抗體與殺螟硫磷的解離平衡常數(shù)分別是4. 56x10, M, 1. 42xl0_9 M and 2.66x10, Μ?？梢?jiàn)，本發(fā)明抗殺螟硫磷單鏈抗體親和力好。與殺螟硫磷具有高特異性，對(duì)其它有機(jī)磷交叉反應(yīng)低，除與對(duì)硫磷的交叉反應(yīng)率《2. 8%)，與其它有機(jī)磷的交叉反應(yīng)率均低于0. 1%。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)快速簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)地檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留有著重要意義、提供了一個(gè)新方向。本發(fā)明利用了核糖體展示技術(shù)，核糖體展示技術(shù)簡(jiǎn)化了單鏈抗體的篩選過(guò)程，大大提高了篩選到高親和力單鏈抗體的效率；核糖體展示完全在體外進(jìn)行，彌補(bǔ)了噬菌體展示、細(xì)菌表面展示、酵母表面展示等細(xì)胞內(nèi)展示的不足，顯著增強(qiáng)了庫(kù)容量及分子多樣性， 庫(kù)容量可以達(dá)到IO13-IO15,比噬菌體展示文庫(kù)(約IO9)提高了 IO4-IO6倍。


圖1是本發(fā)明全套VH、VL基因的PCR (polymerase chain reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增圖2是本發(fā)明全套單鏈抗體基因的PCR擴(kuò)增圖3是本發(fā)明全套單鏈抗體基因IMGT (international immunogenetics)分析的CDR (complementarity-determining region,互補(bǔ)決定區(qū))與連接妝(Linker)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1
(一)殺螟硫磷抗原的制備將殺螟硫磷5 g溶于40ml乙醚中，倒入分液漏斗后，用30ml冷的1 % Na2CO3溶液洗3 次。向上層溶液中加入40ml乙酸-鹽酸溶液(體積比為9:1)，分多次加入鋅粉8 g。黃色反應(yīng)混合物升溫?cái)嚢杌亓鞣磻?yīng)50min ；冷卻，過(guò)濾，并用四氯化碳洗滌沉淀，合并濾液，加四氯化碳萃取2次，濾液用40ml的雙蒸水萃取。靜置分層后除去上層，下層用無(wú)水Na2SO4 除水。次日，過(guò)濾后，得棕色油狀氨基-殺螟硫磷。取氨基-殺螟硫磷500 mg溶于含有10 mmol鹽酸的50 ml蒸餾水中，冷卻，緩慢滴加冷的0. 1 mol/L NaNO2溶液至淀粉碘化物試紙變藍(lán)，再換成冰浴，繼續(xù)攪拌30 min后，加入適量的尿素以除去過(guò)量的亞硝酸。稱取BSA (牛血清清蛋白)2.5g溶于硼酸鹽緩沖液(pH=9)100 ml，混合2溶液，冰浴反應(yīng)2 h，反應(yīng)液逐漸呈橙色透明狀，將反應(yīng)物裝入透析袋后，用4 L的雙蒸水在4°C下透析5天，每天更換雙蒸水4次，透析產(chǎn)物為殺螟硫磷-BSA免疫抗原。包被抗原殺螟硫磷-OVA的合成同上。(二)免疫動(dòng)物
6-8周齡雌性BALB/c小鼠6只用于免疫，首次免疫時(shí)，每只小鼠用含60ug殺螟硫磷-BSA的IOOul的PBS和等體積的弗氏完全佐劑混合物。一周后第二次免疫將弗氏完全佐劑改為弗氏不完全佐劑，共免疫3-5次，第三次免疫2-3天后，斷尾取血測(cè)抗血清效價(jià)(以殺螟硫磷-OVA為包被抗原)。(三)總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成
取抗血清效價(jià)最高的小鼠，處死后取其脾臟，用RNA提取試劑盒(Promega)提取RNA， 用oligo-dt為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA第一鏈。反應(yīng)產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆谩?四)全套VH、VL基因的擴(kuò)增
將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分為兩份，分別加入輕鏈、重鏈可變區(qū)引物各1 μ 1，IOx緩沖液2. 5 μ 1， 0. 2μ 1 DNA聚合酶，四種dNTP至終濃度2. 5 mmol/L，用去離子水補(bǔ)至25 μ 1，擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C 1 min, 54°C 1 min, 72°C 1 min。最后 72°C保溫10 min。洲瓊脂糖凝膠回收VH、VL擴(kuò)增產(chǎn)物。(五)VH、VL的隨機(jī)拼接及全套kFv基因的擴(kuò)增
將近等摩爾濃度的VH、VL混合，加dNTP至終濃度2. 5 mmol/L,0.8 μ 1 DNA聚合酶， 用去離子水補(bǔ)至25 μ 1，進(jìn)行隨機(jī)拼接，反應(yīng)條件94°C 1 min,63°C 4 min，8個(gè)循環(huán)。然后立即加入VH的上游引物和VL的下游引物，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C 1 min, 58°C 1 min, 72°C 1 min，最后72°C保溫10 min。洲瓊脂糖凝膠回收kFv連接產(chǎn)物。(六)用核糖體展示篩選高親和力kFv抗體
1.將上述回收的kFv連接產(chǎn)物2. 5 μ g,用購(gòu)自Promega公司的TNT T7 Quick for PCR DNA進(jìn)行體外快速轉(zhuǎn)錄/翻譯，加入試劑如下
TNT T7 PCR Master Mix (快速混合母液) 401 μ 1 Methionine (甲硫氨酸)，ImmM1 μ 1
ScFv連接產(chǎn)物2. 5 μ g
Nuclease-Free Water (無(wú)核酸酶水)5 μ 1
使總體積為50μ 1，30°C恒溫反應(yīng)80 min，反應(yīng)完成向混合體系中加入40 U DNase I， 并加H2O至終體積為60μ1，再將上述混合物在30°C恒溫溫育15 min消化以去除多余的DNA 片段。2.親和篩選用PBS將包被抗原殺螟硫磷-OVA稀釋成濃度為50 Pg/ml，在酶標(biāo)板上每孔加入100 μ ,于4°C包被過(guò)夜。次日，倒掉酶聯(lián)板中液體，用PBSTM (含5 mM的MgCl2和0. 05%的 Tween-20的磷酸鹽緩沖溶液)，處理沖洗三次。每孔加入200 μ 封閉液1%的明膠于37°C 封閉1-2 h。倒去酶聯(lián)板中液體，PBSTM沖洗三次，然后用冰冷的PBSM(含5 mM的MgCl2的磷酸鹽緩沖溶液)洗兩次。將酶聯(lián)板中的水控干，放在4°C冰上至少10 min0將體外翻譯完成的產(chǎn)物立即從30°C拿出，加入150 μ 冰冷的PBSMO (含5 mM的MgCl2和1%的OVA的磷酸鹽緩沖溶液)，輕輕混勻后，加入封閉好預(yù)冷的酶聯(lián)板中，每孔50 μ ，冰上放置1-2 h。 傾去酶聯(lián)板中剩余液體，用冰冷的PBSTM沖洗三遍，每次5 min,然后用冰冷的PBSM沖洗兩遍，每次5 min。加入EB緩沖液(IX磷酸鹽緩沖溶液中含20 mM EDTA)，冰上放置10 min, 吸取上清。并以上清為模板，以VH的上游引物和VL的下游引物反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增RNA得到一輪篩選后的單鏈抗體DNA文庫(kù)。將DNA文庫(kù)又進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、翻譯、篩選，重復(fù)2次。得到三次篩選后的單鏈抗體DNA文庫(kù)。(七)全套單鏈抗體基因的克隆及篩選 1.單鏈抗體與載體PP0W3. 0連接
用 VH/bs (5' GACATGCCATGGCCCATCATCACCATCATCACATGAGGTSMARC TGCA GSAG TC3，，含 NcoI 酶切位點(diǎn)和 His-tag)和 VL/fn (5，AGCCGGAATTCTACT TACTTAGG ATCCTGCAGCATCAGCCCGTTT3，，含BamHI酶切位點(diǎn))作引物擴(kuò)增用核糖體展示篩選后的單鏈抗體基因，NcoI和BamHI雙酶切單鏈抗體和載體PP0W3. 0，再用T4連接酶將單鏈抗體與載體PP0W3. 0連接。2. CaCl2法制備感受態(tài)
將宿主菌DH5ci在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37°C培養(yǎng)16-20 h。從平板中挑取單菌落， 于100 ml LB新鮮配制培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取1 ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液于100 ml LB 新鮮配制培養(yǎng)液中，37°C，250 !"/!^!！培養(yǎng)丨-丨；h，使細(xì)胞濃度達(dá)到5 X IO7 CFU/ml，此時(shí)菌液吸光度為0. 2-0. 4，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期。將培養(yǎng)物于冰上放置10 min，然后轉(zhuǎn)移到兩個(gè)50 ml離心管中，4000 r/min，4°C，離心10 min。棄上清，倒置離心管1 min，流盡剩余液體，然后加入10 ml冰冷的0. IM CaCl2致敏液懸浮細(xì)胞，置冰上10 min。4000 r/ min，4°C離心10 min，回收細(xì)胞，棄上清，加滿冰冷的0. 1 M CaCl2致敏液，懸浮細(xì)胞，于冰上放置過(guò)夜，次日倒上清，懸浮細(xì)胞。分裝入離心管中，每管100 μ ，每管加入80%甘油14.5 μι使終濃度為10%，標(biāo)注，置-70°C凍存，若在M h內(nèi)用于轉(zhuǎn)化可置于冰上保存，以提高轉(zhuǎn)化效率。3. CaCl2 法轉(zhuǎn)化法
將連接產(chǎn)物&FV-PP0W3. 0 10 μ 與制備的感受態(tài)菌90 μ 輕柔混合，分別作陽(yáng)性、 陰性對(duì)照，手指輕彈，使之混勻，在冰上放置30 min。42°C水浴熱沖擊90 s，快速放置于冰上2 min。每管加入900 μ LB新鮮培養(yǎng)液，混勻，180 r/min，37°C震蕩培養(yǎng)lh。分別將 ScFv-載體和載體本身的轉(zhuǎn)化菌100 μ 涂布于相應(yīng)的LB固體平皿中(含氨芐)，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。(A) ELISA 篩選 1.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證
挑取培養(yǎng)板中長(zhǎng)出的克隆子，PCR驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
2. kFv克隆子表達(dá)挑取PCR驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證呈陽(yáng)性的185個(gè)單菌落，接種Amp+ (100μ g/ml) 2 X YT 培養(yǎng)基 5ml, 30°C、200 r/min 搖振培養(yǎng) 16 小時(shí)，4°C、4000g 離心 10 分鐘，棄上清，以50ml Amp+(100 μ g/ml) 2 X YT培養(yǎng)基重懸菌體，30°C、200r/min搖振培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A6tltl = 0. 8 1. 0)，升溫至42°C、200r/min誘導(dǎo)表達(dá)搖振4小時(shí)，4°C、4 OOOg離心10分鐘，收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體，置-20°c過(guò)夜，以含100g/ml溶菌酶(lysozyme) TBS ( 1. 5mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH 7.4)重懸，置 4°C1 小時(shí)，以超聲波 5X10 秒處理裂解菌體溶液(冰浴)，4°C、12000g離心15分鐘，吸取上清，用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾·
3. ELISA篩選陽(yáng)性克隆
用PBS將包被抗原殺螟硫磷-OVA稀釋成濃度為50 μδ/πι1在酶標(biāo)板上每孔加入100 μ ，于4°C包被過(guò)夜。次日，倒掉酶聯(lián)板中液體，用PBST沖洗三次。每孔加入200 μ 封閉液 (PBS含1%明膠)于37°C封閉1-2 h。PBST洗三遍，將表達(dá)的抗體蛋白(用含21的OVA的 PBS溶解)室溫封閉15 min，取100 μ 加入酶標(biāo)板中，37°C孵育1_2 h。PBST洗三遍，用封閉液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗his-tag抗體，每孔加入100 μ1，37 孵育1_2 h。PBST洗三遍，加入底物顯色5-15 min。酶標(biāo)儀讀數(shù)。ELISA篩選出與包被抗原有較強(qiáng)結(jié)合的克隆。(九)Biacore篩選高親和力抗體 1.抗原固定
將含4(^g/mL殺螟硫磷-OVA的HEPS緩沖液注入Biacire，使殺螟硫磷-OVA與CM5芯片結(jié)合，再注入5 μ 0. 1 M NaOH，短暫洗滌芯片，洗去未結(jié)合的殺螟硫磷-OVA。2.相互作用分析
將ELISA篩選出與包被抗原有較強(qiáng)結(jié)合的轉(zhuǎn)化子所表達(dá)的蛋白，濃度為10 Pg/ml，流經(jīng)固定有抗原的CM5芯片，觀察抗原抗體結(jié)合解離情況。(十)抗體親和常數(shù)的測(cè)定
將與抗原結(jié)合較強(qiáng)轉(zhuǎn)化子的蛋白溶液稀釋成160、80、40、20、10ug/ml，分別流經(jīng)固定有抗原的CM5芯片，然后用Biacore的圖像擬合得到轉(zhuǎn)化子與包被抗原的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合常數(shù)最大的便是本發(fā)明所篩選出的三個(gè)單鏈抗體，即ScFV-LD76、ScFV-LE18和&Fv_LE39，參見(jiàn)表1。
權(quán)利要求
1.一種抗殺螟硫磷的單鏈抗體，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
2.如權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于其核苷酸序列如SEQID N0:4所示。
3.一種抗殺螟硫磷的單鏈抗體，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
4.如權(quán)利要求3所述的單鏈抗體，其特征在于其核苷酸序列如SEQID N0:5所示。
5.一種抗殺螟硫磷的單鏈抗體，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3。
6.如權(quán)利要求5所述的單鏈抗體，其特征在于其核苷酸序列如SEQID N0:6所示。
7.如權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述抗殺螟硫磷單鏈抗體的制備方法，按如下步驟進(jìn)行(1)用免疫抗原殺螟硫磷-BSA(牛血清白蛋白)免疫小鼠，取小鼠的脾臟細(xì)胞提取總 RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA ；(2)以上述cDNA為模板擴(kuò)增全套的VH、VL基因，拼接構(gòu)建抗殺螟硫磷全套單鏈抗體 DNA文庫(kù)；(3)將上述單鏈抗體DNA文庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯；(4)以殺螟硫磷-OVA(卵清蛋白)作為篩選抗原，對(duì)上述單鏈抗體DNA文庫(kù)體外翻譯完成的產(chǎn)物進(jìn)行親和篩選，再反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到篩選后的單鏈抗體DNA文庫(kù)；(5)將上述篩選后的單鏈抗體基因與載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)；再經(jīng)ELISA篩選、Biacore篩選得到高親和力和高特異性的抗殺螟硫磷單鏈抗體。
全文摘要
本發(fā)明利用核糖體展示技術(shù)，繞過(guò)雜交瘤技術(shù)，構(gòu)建了抗殺螟硫磷全套單鏈抗體基因的核糖體展示文庫(kù)，并從該文庫(kù)中篩選得到3個(gè)對(duì)殺螟硫磷具有高親和力、高特異性的單鏈抗體基因。該單鏈抗體基因與載體PPOW3.0連接后在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)，得到3個(gè)分子量大約為30KDa的可溶性蛋白，經(jīng)ELISA和Biacore分析，該3個(gè)抗體蛋白對(duì)殺螟硫磷具有高親和力和高特異性，為建立ELISA和免疫傳感器提供了優(yōu)秀的單鏈抗體基因及抗體蛋白。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)快速簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)地檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留有著重要意義、提供了一個(gè)新方向。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102229672SQ20111013401
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者夏玉先, 羅義輝 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)