專利名稱：一種降解葉綠素的菌株及降解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)、生物技術(shù)、生物工程、生物化工領(lǐng)域，特別是一種降解葉綠素的菌株及降解方法。
背景技術(shù)：
葉綠素存在于植物葉片葉綠體的膜上，是綠色植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，包括葉綠素a和葉綠素b。葉綠素的分子結(jié)構(gòu)由葉醇基和鎂卟啉構(gòu)成，鎂卟啉由一個(gè)鎂離子和四個(gè)吡咯環(huán)上的氮結(jié)合而成。此外植物葉綠素的鎂卟啉化學(xué)結(jié)構(gòu)和動(dòng)物紅血球的鐵卟啉極為相似，適量補(bǔ)充葉綠素對(duì)意外失血者的造血功能恢復(fù)有很好的幫助。在當(dāng)代社會(huì)中有相當(dāng)一部分的工業(yè)原料、食品、保健品及藥物來自于綠色植物，由于傳統(tǒng)的葉綠素降解方法存在著一定的難度和局限性，一定程度上直接增大了這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。目前工業(yè)上脫除葉綠素的方法主要有①物理吸附法包括大孔樹脂吸附法和活性炭吸附法；②化學(xué)氧化法包括雙氧水氧化脫色法和次氯酸鈉氧化脫色法。兩種降解葉綠素方法都有一定的局限性。如①大孔樹脂法吸附色素成本高，樹脂不能多次重復(fù)利用，廢棄的樹脂對(duì)環(huán)境存在著污染；活性炭吸附法存在著吸附量少且使用局限性(對(duì)食品和藥品不適用)，廢棄活性炭難于處理等問題。物理吸附法在吸附葉綠素的同時(shí)，被提取的有效成分也部分的被吸附，有效成分不能完全解吸下來，因此兩種方法都不可避免地造成有效成分提取率的下降。②雙氧水或次氯酸鈉脫色法原理是它們作為氧化劑將葉綠素氧化成非綠色產(chǎn)物。由于是氧化法，所以往往在葉綠素被氧化時(shí)，有效成分也不同程度地被氧化；另外雙氧水或次氯酸鈉在成品中都有殘留，造成對(duì)產(chǎn)品的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述情況，提供一種降解葉綠素的菌株及降解方法。本發(fā)明的菌株在土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上菌落最初為白色絨毛狀，后變?yōu)榫G色、 暗綠色，外觀呈絨毛狀。在顯微鏡下觀察此菌株的孢子梗沒有分支，孢子梗頂端膨大為近似圓狀形，另外還發(fā)現(xiàn)它的無形繁殖不產(chǎn)生次生小柄，分生孢子主要集中在孢子梗的上半部并且呈串珠狀散開，分生孢子呈圓形或卵圓形以扇形狀生長。參照《真菌的形態(tài)和分類》 (戴芳瀾1987版)和《真菌鑒定手冊(cè)》(魏景超1979版)將本發(fā)明菌株種屬定在曲霉屬。 中國典型培養(yǎng)物保藏中心確定的分類命名為曲霉GLHZB319 (Aspergillus GLHZB319)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2011101 ；保藏單位為武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址為湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)；保藏日期為2011年4月6日。一、曲霉GLHZB319菌株的制備方法為取有落葉的土壤0.50-2. 00g，加入盛有25mL無菌水的三角瓶中，振蕩l_3min，使土壤均勻分散后得到土壤懸浮液；吸取土壤懸浮液3-5滴，滴于用80%丙酮提取的單一葉綠素和瓊脂平板培養(yǎng)基上，用涂布環(huán)涂布均勻，30°C恒溫培養(yǎng)2-4d后檢查平板培養(yǎng)結(jié)果； 能在平板上生長并產(chǎn)生透明圈的菌株，將通過它在80%丙酮提取的單一葉綠素水溶液中的發(fā)酵效果來進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)酵條件溫度30°C、自然pH、轉(zhuǎn)速lOOr/min，發(fā)酵效果最好的為曲霉GLffiB319菌株。二、用曲霉GLHZB319菌株降解葉綠素的具體步驟為(1)制備培養(yǎng)基稱取去皮土豆200. 00g，并將土豆切成l-3cm的方塊，加水IL后加熱煮沸30min， 之后冷卻至室溫；用三層紗布過濾，定容濾液至IL ；(2)取出步驟(1)的濾液0. IL于250ml的三角瓶中，向瓶?jī)?nèi)加入1.50-2. OOg的瓊脂粉，用牛皮紙包扎瓶口，在1. 103MPa、121°C下滅菌20min，取出后迅速倒入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋；待瓊脂凝固后為固體培養(yǎng)基，然后在無菌條件下接入曲霉GLHZB319菌株，在30°C 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周后放置在4°C冰箱保藏；(3)將步驟(1)剩余的0. 9L濾液轉(zhuǎn)移至1. 5L錐形瓶?jī)?nèi)，用牛皮紙包扎瓶口，在滅菌鍋中滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；(4)曲霉GLHZB319菌株發(fā)酵培養(yǎng)在無菌條件下，用打孔器在步驟(2)的產(chǎn)物上打孔一個(gè)，接種到從步驟(3)制得發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下?lián)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)2-3天后為發(fā)酵液；曲霉GLHZB319菌株小餅直徑0. 6cm,厚度0. 3-0. 6cm,搖床振蕩速度100r/min ；(5)取附有葉綠素的植物8-10. 00g,于250mL的三角瓶?jī)?nèi)，將步驟⑷得到的發(fā)酵液取出0. IL倒入瓶?jī)?nèi)，用牛皮紙包扎瓶口 ；在振蕩速度為lOOr/min的搖床上振蕩培養(yǎng)1 天，植物上的葉綠素即被完全降解。本發(fā)明在菌株發(fā)酵降解葉綠素的過程中不需要添加額外的碳源和氮源以及無機(jī)鈉鹽，菌株在生長發(fā)育過程中可以利用葉綠素為底物生長繁殖，它對(duì)葉綠素具有降解速度快、降解率高、成本低、無殘留、無污染、安全環(huán)保等特點(diǎn)，可以部分代替目前天然產(chǎn)物提取工藝中的脫色樹脂。


圖1為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株的菌落形態(tài)圖。圖2為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株在顯微鏡下孢子梗形態(tài)圖(10X40倍)。圖3為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株在顯微鏡下菌絲形態(tài)圖(10X10倍)。圖4為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株在顯微鏡下菌絲形態(tài)圖(10X4倍)。圖5為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株對(duì)葉綠素水溶液的降解前后對(duì)照?qǐng)D，圖中左邊為降解前。圖6為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株對(duì)被葉綠素污染的劍麻纖維降解前后劍麻纖維表面對(duì)照?qǐng)D(10X4倍)，圖中左邊為降解前。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一、曲霉GLHZB319菌株的制備方法為取有落葉的土壤1. 00g，加入盛有25mL無菌水的三角瓶中，振蕩lmin，使土壤均勻分散后得到土壤懸浮液；吸取土壤懸浮液4滴，滴于用80%丙酮提取的單一葉綠素和瓊脂配制的平板培養(yǎng)基上，用涂布環(huán)涂布均勻，30°C恒溫培養(yǎng)3d后檢查平板培養(yǎng)結(jié)果；能在平板上生長并產(chǎn)生透明圈的菌株，將通過它在80%丙酮提取的單一葉綠素水溶液中的發(fā)酵效果來進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)酵條件溫度30°C、自然pH、轉(zhuǎn)速lOOr/min，發(fā)酵效果最好的為曲霉 GLHZB319 菌株。曲霉GLHZB319菌株特征在土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上菌落最初為白色絨毛狀，后變?yōu)榫G色、暗綠色，外觀呈絨毛狀。在顯微鏡下觀察此菌株的孢子梗沒有分支，孢子梗頂端膨大為近似圓狀形，另外還能發(fā)現(xiàn)它的無形繁殖不產(chǎn)生次生小柄，分生孢子主要集中在孢子梗的上半部并且成串珠狀散開，分生孢子呈圓形或卵圓形以扇形狀生長。二、用曲霉GLHZB319菌株降解葉綠素的具體步驟為(1)制備培養(yǎng)基稱取去皮土豆200. OOg,并將土豆切成約2cm左右的方塊，加水IL后加熱煮沸 30min，之后冷卻至室溫；用三層紗布過濾，定容濾液至IL ；(2)取出步驟(1)的濾液0. IL于250ml的三角瓶中，向瓶?jī)?nèi)加入1. 50g的瓊脂粉，用牛皮紙包扎瓶口，在1. 103MPa、121°C下滅菌20min，取出后迅速倒入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)， 加蓋；待瓊脂凝固后為固體培養(yǎng)基，然后在無菌條件下接入曲霉GLHZB319菌株，在30°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周后放入4°C冰箱保存；(3)將步驟(1)剩余的0. 9L濾液轉(zhuǎn)移至1. 5L錐形瓶?jī)?nèi)，用牛皮紙包扎瓶口，在滅菌鍋中滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；(4)曲霉GLHZB319菌株的發(fā)酵培養(yǎng)在無菌條件下，用打孔器在步驟( 的產(chǎn)物上打孔一個(gè)，接種到步驟C3)得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下?lián)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)3天，為發(fā)酵液；曲霉GLHZB319菌株小餅直徑 0. 6cm，厚度0. 5cm，搖床振蕩速度100r/min ；(5)取附有葉綠素的劍麻纖維10. OOg,劍麻纖維長度為10-15cm，放于250mL的三角瓶?jī)?nèi)，將步驟(4)制得的發(fā)酵液取出0. IL倒入瓶?jī)?nèi)，用牛皮紙包扎瓶口。在振蕩速度為 100r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)1天，圖6為本發(fā)明曲霉GLHZB319菌株對(duì)被葉綠素污染的劍麻降解前后劍麻表面對(duì)照?qǐng)D，處理后的劍麻纖維變白、變軟、無麻糠和葉綠素附著。
權(quán)利要求
1.一種降解葉綠素的菌株，其特征在于菌株在土豆瓊脂培養(yǎng)基上菌落最初為白色絨毛狀，后變?yōu)榫G色、暗綠色，外觀呈絨毛狀。在顯微鏡下觀察此菌株的孢子梗沒有分支，孢子梗頂端膨大為近似圓狀形，另外還能發(fā)現(xiàn)它的無形繁殖不產(chǎn)生次生小柄，分生孢子主要集中在孢子梗的上半部并且成串珠狀散開，分生孢子呈圓形或卵圓形以扇形狀生長，中國典型培養(yǎng)物保藏中心確定的名稱為曲霉GLHZB319即Aspergillus GLHZB319，保藏號(hào)CCTCC NO :M2011101o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株的制備方法，其特征在于具體步驟為取有落葉的土壤0. 50-2. OOg,加入盛有25mL無菌水的三角瓶中，振蕩l_3min，使土壤均勻分散后得到土壤懸浮液；吸取土壤懸浮液3-5滴，滴于用80%丙酮提取的單一葉綠素和瓊脂配制的平板培養(yǎng)基上，用涂布環(huán)涂布均勻，30°C恒溫培養(yǎng)2-4d后檢查平板培養(yǎng)結(jié)果；能在平板上生長并產(chǎn)生透明圈的菌株，將再用80%丙酮提取的單一葉綠素水溶液中的發(fā)酵效果來進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)酵條件溫度30°C、自然pH、轉(zhuǎn)速lOOr/min，發(fā)酵效果最好的為曲霉GLHZB319菌株。
3.一種利用權(quán)利要求1或2所述菌株降解葉綠素的方法，其特征在于具體步驟為(1)稱取去皮土豆200.OOg,并將土豆切成l-3cm的方塊，加水IL后加熱煮沸30min，之后冷卻至室溫；用三層紗布過濾，定容濾液至IL ；(2)取出步驟(1)的濾液0.IL于250ml的三角瓶中，向瓶?jī)?nèi)加入1. 50-2. OOg的瓊脂粉，用牛皮紙包扎瓶口，在1. 103MPa、121°C下滅菌20min，取出后迅速倒入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)， 加蓋；待瓊脂凝固后為固體培養(yǎng)基，然后在無菌條件下接入曲霉GLHZB319菌株，在30°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周后放置在4°C冰箱保藏；(3)將步驟(1)剩余的0.9L濾液轉(zhuǎn)移至1.5L錐形瓶?jī)?nèi)，用牛皮紙包扎瓶口，在滅菌鍋中滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；(4)在無菌條件下，用打孔器在步驟(2)的產(chǎn)物上打孔一個(gè)，接種到從步驟(3)制得發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下?lián)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)2-3天后為發(fā)酵液；曲霉GLHZB319菌株小餅直徑0. 6cm,厚度0. 3-0. 6cm,搖床振蕩速度100r/min ；(5)取附有葉綠素的植物8-10.00g，于250mL的三角瓶?jī)?nèi)，將步驟(4)得到的發(fā)酵液 0. IL倒入瓶?jī)?nèi)，用牛皮紙包扎瓶口 ；在振蕩速度為lOOr/min搖床上振蕩培養(yǎng)1天，植物上的葉綠素即被完全降解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種降解葉綠素的菌株及降解方法。中國典型培養(yǎng)物保藏中心確定的名稱為曲霉GLHZB319(Aspergillus GLHZB319)，保藏號(hào)CCTCC NOM2011101，通過微生物發(fā)酵的方法來降解植物上的殘留葉綠素。本發(fā)明在菌株發(fā)酵降解葉綠素的過程中不需要添加額外的碳源和氮源以及無機(jī)鈉鹽，菌株在生長發(fā)育過程中可以利用葉綠素為底物降解葉綠素，它對(duì)葉綠素具有降解速度快、降解率高、成本低、無殘留、無污染、安全環(huán)保的特點(diǎn)，可以部分代替目前天然產(chǎn)物提取工藝中的脫色樹脂。
文檔編號(hào)C12R1/66GK102286382SQ20111013385
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者張會(huì)香, 李海云, 王彥超, 郝再彬, 陳志良 申請(qǐng)人:桂林理工大學(xué)