專利名稱：Rankl-tnf樣區(qū)融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，本發(fā)明還涉及該融合蛋白的制備方法以及在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療性疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性全身性自身免疫病，以破壞性關(guān)節(jié)炎為特征，病變特點(diǎn)為侵蝕性滑膜炎，以及由此造成的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形而致殘。由于RA的患病率高、致殘率高、病因尚未完全闡明，特別是RA給社會(huì)經(jīng)濟(jì)、勞動(dòng)力造成了嚴(yán)重?fù)p失，因此，對(duì)RA治療的研究具有重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。 而RA又是一種難治性疾病，雖然現(xiàn)有治療手段多種多樣，但都不甚理想。本發(fā)明針對(duì)RA發(fā)病中骨破壞及慢性炎癥反應(yīng)這兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的RA關(guān)鍵性病理學(xué)問題，研制RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，為RA的治療開辟了一種新的思路。RANKL 是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily, TNFSF) 的成員，基因位于人13號(hào)染色體13ql4，全長(zhǎng)316個(gè)氨基酸，分子量大小為35 45kD，分三個(gè)亞型 -RANKL1 和 RANKL2 為跨膜型三聚體(trimeric transmembrane form)，RANKL3 為可溶型單體(solublemonomer)，兩種類型均可與誘餌受體骨保護(hù)素(osteoprotegerin, 0PG)結(jié)合而失去生物活性，人鼠同源性為77%。RANKL為I型跨膜蛋白，由胞內(nèi)、胞外和跨膜段組成，核心結(jié)構(gòu)為胞外羧基端的158個(gè)氨基酸，由數(shù)條β型折疊構(gòu)成，為TNF家族同源性結(jié)構(gòu)域。RANKL主要分布在免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。參與骨破壞的RANKL 主要由成骨/骨髓基質(zhì)細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌，通過自分泌和旁分泌方式與受體RANK結(jié)合發(fā)揮作用。RANKL的表達(dá)受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控， 如骨吸收因子、糖皮質(zhì)激素、1 α ,25 (0H)2-VD3> IL-1、IL-6、IL-IU TNF-α、PGE2 和 PTH 等， 這些因子都可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，從而促進(jìn)骨吸收。RANKL的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)破骨細(xì)胞(osteoclast，0C)分化、活化、增殖有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。RANKL的受體RANK (receptor activatorof nuclear factor)是月中瘤壞死因子受體超家方矣(tumor necrosis factor receptorsuperfamily,TNFRSF)成員，基因定位于18q22. 1，是616個(gè)氨基酸的肽段，屬I型跨膜蛋白，有一個(gè)短的含有21個(gè)氨基酸的穿細(xì)胞膜基團(tuán)和一個(gè)383個(gè)氨基酸殘基的細(xì)胞內(nèi)羧基末端，人鼠同源性為60%。主要表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，包括破骨細(xì)胞及前體細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。RANKL在RA患者關(guān)節(jié)腔表達(dá)量增加并與破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，RANK胞內(nèi)域構(gòu)象改變與其銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6 (TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)結(jié)合后使其活化；活化的 TRAF6 作為一個(gè)多功能的第二信使(second messager)使轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B或分裂原激活的蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)激活，其中 MAPK 又包含了應(yīng)激活化蛋白激 Sl (c-Jun N-terminalkinases/stress-activated protein kinase, JNK)禾口Ifi夕卜胃號(hào)ijf 節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)兩條途徑。JNK 能進(jìn)一步激活 c-Jun和活化蛋白1 (AP-I)，影響破骨細(xì)胞和T細(xì)胞核內(nèi)因子的活性。ERK是c-Fos表達(dá)與否的調(diào)控因子，后者是破骨細(xì)胞分化中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κ B作為一個(gè)二聚體轉(zhuǎn)錄因子，激活后由胞漿進(jìn)入胞核識(shí)別DNA序列的κΒ位點(diǎn)；鈣信號(hào)啟動(dòng)核因子活化的T細(xì)胞 cl (nuclear factor ofactivated T cell cl, NFATc 1)并與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，使破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，破骨前體細(xì)胞增殖、分化、成熟為有功能的破骨細(xì)胞，使骨吸收增加。 同時(shí)，破骨細(xì)胞表面也存在RANK，與RANKL結(jié)合后使破骨功能增強(qiáng)。與此同時(shí)，表達(dá)在活化的T細(xì)胞上的RANKL與自身或DC上RANK結(jié)合，能激活免疫系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)證明，T細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL能直接啟動(dòng)破骨細(xì)胞的增殖；ctla4+基因敲除鼠能抑制活化T細(xì)胞對(duì)骨密度的破壞。免疫系統(tǒng)與骨系統(tǒng)之間的惡性循環(huán)是RA骨破壞持續(xù)存在的原因。RA是慢性進(jìn)展的系統(tǒng)性炎癥，許多炎性因子參與了類風(fēng)濕的病理過程，TNF-α是 RA發(fā)病機(jī)理中居中心地位的炎癥細(xì)胞因子之一，它參與了 RA的發(fā)生發(fā)展過程。TNF-α可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子(inter-cellularadhesion molecule，ICAM)，促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附滲透導(dǎo)致局部的炎癥。此外，TNF-α刺激滑膜纖維母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)和膠原酶，促進(jìn)骨質(zhì)破壞和骨的吸收及纖維母細(xì)胞的增生， 抑制骨膠原的合成。TNF-α也能促進(jìn)人軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶激活劑，使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶而加快關(guān)節(jié)炎的損失過程，TNF-α增加了滑膜內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的釋放而促進(jìn)血管翳的形成。TNF-α還可促使滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-I、IL_8，加之TNF-α本身而加重組織損傷。Saxne等學(xué)者報(bào)告50%的 RA患者血清中TNF-α水平升高，且TNF-α升高的多為關(guān)節(jié)明顯腫脹、壓痛及血沉快的活動(dòng)期患者。提示RA關(guān)節(jié)炎癥越重，TNF-α水平越高。TNF-α在活動(dòng)性RA中參與三種主要病理過程①激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM的表達(dá)，在關(guān)節(jié)炎時(shí)血液中白細(xì)胞正是通過與ICAM的相互作用被匯集到關(guān)節(jié)腔的。②刺激結(jié)締組織細(xì)胞和多形核細(xì)胞產(chǎn)生PGE 等小分子炎癥介質(zhì)。③通過刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，使破骨細(xì)胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶、釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和軟骨的破壞?？扇苄訲NFR可有效地減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎的病理改變。研究發(fā)現(xiàn)，以RANKL為阻斷目標(biāo)的藥物可以減輕RA骨和軟骨的破壞，用RANKL單克隆抗體或RANK-Fc能顯著改善腫瘤轉(zhuǎn)移性溶骨和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的癥狀。在一項(xiàng)阿根廷的隨機(jī)雙盲試驗(yàn)中，應(yīng)用人源化的單克隆抗體AMG-162治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病人的研究表明，RANKL單抗能顯著增加骨量，減輕骨痛等癥狀，未見明顯不良反應(yīng)，但缺點(diǎn)是對(duì)炎癥性滑膜炎無效，必須與抗TNF-α的其他制劑聯(lián)合應(yīng)用。TNF-α拮抗劑是臨床上抑制RA炎癥反應(yīng)療效肯定的制劑，但有1/3的患者對(duì)目前上市的三種拮抗劑無效，而且由于TNF-α拮抗劑的價(jià)格比較昂貴，很難得到普遍應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于針對(duì)上述不足提供一種RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物制劑/疫苗制備中的用途。本發(fā)明RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，其為RANKL-TNF樣區(qū)蛋白與具有泛宿主性的Th2 細(xì)胞表位片段的融合蛋白。
RANKL和TNF- α是RA骨損傷和炎癥持續(xù)存在的關(guān)鍵因子，同時(shí)，RANKL為TNFSF 家族成員，RANKL的TNF樣區(qū)與TNF- α的氨基酸序列有高度的相似性，本發(fā)明將RANKL中與TNF-α相似性高的兩段區(qū)域作為多肽疫苗的候選表位，但RANKL為自體成分，因此天然狀態(tài)下很難產(chǎn)生抗體。本發(fā)明通過將RANKL與TNF-α的非相似區(qū)域用泛宿主性的Th2細(xì)胞表位取代，從而增強(qiáng)了其免疫原性。這種泛宿主性的Th2細(xì)胞表位可以是HIV-I的BRU 株逆轉(zhuǎn)錄酶 RI^414-4Maa)的基因序列 GAATGGGAGTTCGTAAACACCCCACCTCTCGTC (氨基酸序列EWEFVNTPPLV)，或者是其他的泛宿主性Th2細(xì)胞表位，例如0VA、BSA、PPD等。術(shù)語“泛宿主性”是指廣泛的宿主適應(yīng)性。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 或4 ；本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)該片段，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如，將第6位的絲氨酸替換為酪氨酸，或者將第77位的賴氨酸缺失，或者在第118位添加芳香族氨基酸。因此，RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白還包括SEQ ID No. 2或4所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等活性的由SEQ ID No. 2或4衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括編碼上述融合蛋白的基因。在本發(fā)明實(shí)施例中，編碼該融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1或3所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子?？蓪⒈景l(fā)明上述基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的重組表達(dá)載體，進(jìn)而可以將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到表達(dá)RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白的基因工程菌。本發(fā)明所使用的表達(dá)載體可以選用各種已知的原核表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種制備上述融合蛋白的方法，包括如下步驟將編碼RANKL-TNF 樣區(qū)融合蛋白的基因克隆到表達(dá)載體中，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)菌體培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，分離純化得到該融合蛋白。在本發(fā)明實(shí)施例中，通過構(gòu)建重組基因，與pET_28a表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，表達(dá)融合蛋白，并通過分子篩或離子交換層析等方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，采用SDS-PAGE、Western-blot等對(duì)融合蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在合適的條件下發(fā)酵培養(yǎng)工程菌的步驟包括將測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落接種于IOmL LB培養(yǎng)基(含30mg/L的卡那霉素)，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日取30mL 過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于IL LB培養(yǎng)基(含30mg/L的卡那霉素)中，37°C，250rpm培養(yǎng)至0D_至 0. 5，加入IPTG使之終濃度為0. 4mM, 37°C，250rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4. 5h后離心收集菌體。取培養(yǎng)后收集的大腸桿菌菌體，用預(yù)冷的PBS洗滌菌體6次，超聲重懸IOmin (超 4s停6s，功率為40% )。每克濕菌體加10倍體積的細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液重懸，加入溶菌酶至lmg/mL，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑PMSF至ImM，冰上放置30min后，在冰浴中超聲裂菌 IOmin, 12，OOOrpm離心IOmin收集沉淀。再分別用TE緩沖液、trixton-100各洗滌一次，將沉淀溶于PBS中超聲重懸菌體(5mL/g濕菌體)，同時(shí)緩慢滴加等體積的8M尿素溶液， 磁力攪拌子攪拌30min，離心后沉淀用4M尿素溶液洗滌1次，沉淀重懸于含4M尿素的溶解緩沖液中，離心取上清經(jīng)0. 45 μ m的微孔濾膜過濾獲得含目的融合蛋白的變性液。親和層析法(Ni-NTA *His預(yù)裝柱5mL)純化融合蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量法將純化的蛋白變性液濃度稀釋到 0. 5mg/mL。按尿素濃度逐步遞減(4M-3M-2. 5M-2M-1. 5M-1. 2M-0. 8M-0. 5M-0. 2 Μ-0Μ)的方法配好復(fù)性液(4M尿素，50mM Tris, 0. 5mM EDTA, 50mM NaCl，3mM還原型谷胱甘肽，ImM氧化型谷胱甘肽，10% (V/V)甘油，甘氨酸，PBS，pH7.6)，將稀釋的蛋白變性液置于透析袋內(nèi)，按復(fù)性內(nèi)、外液比例不大于1 20的比例4°C緩慢攪拌透析復(fù)性。根據(jù)透析過程中蛋白是否析出以及析出量的多少確定最佳復(fù)性透析條件，約4個(gè)小時(shí)更換一次尿素濃度逐漸降低的透析液，最后在PH7. 6的PBS溶液中透析過夜，其間更換一次PBS溶液，對(duì)蛋白變性液進(jìn)行透析復(fù)性。實(shí)驗(yàn)表明，RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗體具有結(jié)合RANKL和 TNF- α的功效，可以用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病，發(fā)揮減輕骨破壞和抑制炎癥作用，從而可以用于制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疫苗。進(jìn)而，本發(fā)明還包括一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療性疫苗，其為有效劑量的上述RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白與生物制劑/疫苗學(xué)上可接受的載體制成。本發(fā)明RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病提供了一種新的治療途徑和思路。本發(fā)明通過體外表達(dá)RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，表達(dá)量高，可控性強(qiáng)，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1顯示本發(fā)明所選用的表達(dá)載體及重組后表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖 1(a)為pET-28a(+)質(zhì)粒示意圖；圖1(b) ^ pET-28a(+)-RTFP-I重組質(zhì)粒示意圖；圖1(c) 為pET48a(+)-RTFP-2重組質(zhì)粒示意圖；圖1 (d)為pET48a(+)-RTFP-3重組質(zhì)粒示意圖。圖2為RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜；其中，圖2(a)為融合蛋白R(shí)TFP-I重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果，泳道MnM2 分子量Marker ；泳道1 :RANKL的全基因克隆質(zhì)粒(BC117286,1097bp ；pD0NR223, 5004bp)；泳道2，3 目的基因的AB，CD片段； 泳道4:目的基因全長(zhǎng)G43bp)；泳道5:目的基因全長(zhǎng)的雙酶切片段(Sal I, Nde I)；泳道 6 :PET-28a(+)質(zhì)粒；泳道7 :pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切(Sal I,Nde I)；泳道8 含目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒(pET-28a(+)-RTFP-l)；泳道9，10 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定(pET_28a(+)， pET-28a(+)-RTFP-1)；泳道 11 :pET_28a(+)-RTFP-1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定(Sal I、 Nde I)；其中，圖2(b)為融合蛋白R(shí)TFP-2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果，泳道M1, M2 分子量 Marker ；泳道 1 =RANKL 的全基因克隆質(zhì)粒(BC117286,1097bp ；pD0NR223, 5004bp)；泳道 2， 3，4 目的基因的AB、⑶、CE片段；泳道5 目的基因全長(zhǎng)G43bp)；泳道6 目的基因全長(zhǎng)的雙酶切片段(Sal I、Nde I)；泳道7 :pET-28a(+)質(zhì)粒；泳道8 :pET_28a(+)質(zhì)粒雙酶切 (Sal I,Nde I)；泳道9 含目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒(ρΕΤ_2&ι(+)-RTFP-2)；泳道10，11:重組表達(dá)質(zhì)粒的 PCR 鑒定(pET-28a(+)，pET_28a(+)-RTFP-2)；泳道 12 :pET_28a(+)-RTFP-2 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定(Sal I, Nde I)；其中，圖2(c)融合蛋白R(shí)TFP-3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果，泳道M1, M2 分子量 Marker ；泳道1，2 目的基因的全長(zhǎng)(410bp)；泳道3 :pET_28a⑴質(zhì)粒；泳道4，5 含目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒(pET-28a(+)-RTFP-3)。圖3為RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；其中，泳道M1 分子量Marker ；泳道1，3，5，7 未加IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)質(zhì)粒(pET48a(+)， pET-28a(+)-RTFP-I, pET_28a(+)-RTFP-2，pET_28a(+)-RTFP-3 ；37 "C,250rpm)；泳道 2， 4，6，8 加入 IPTG 誘導(dǎo)的重組表達(dá)質(zhì)粒(pET-28a (+)，pET_28a (+) -RTFP-I (17. 9KDa)， pET-28a(+)-RTFP-2(19. 9KDa)，pET_28a (+)-RTFP-3 (16. 6KDa) ；37 "C,250rpm, IPTG 0. 4mM)。圖4顯示的是Western-blot分析RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白；其中，圖a為用抗人RANKL多克隆抗體檢測(cè)融合蛋白，泳道1 :RTFP-1融合蛋白；泳道2 :RTFP-2融合蛋白；泳道3 :RTFP-3融合蛋白；其中，圖b為用抗人TNF-α多克隆抗體檢測(cè)融合蛋白，泳道1 陽性對(duì)照 (rhTNF- α，17. 5KDa)；泳道2 陰性對(duì)照(pET-28a(+)質(zhì)粒)；泳道3 =RTFP-I融合蛋白；泳道4 :RTFP-2融合蛋白；泳道5 :RTFP-3融合蛋白。圖5純化復(fù)性后的RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；其中，泳道M1 分子量Marker ；泳道1 :RTFP_1融合蛋白；泳道2 :RTFP_2融合蛋白；泳道3 :RTFP_3融合蛋白。圖6顯示的是RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白的安全性鑒定；其中，圖6 (a)是破骨細(xì)胞生成試驗(yàn)，其中A.陽性對(duì)照組(M-CSFlOng/mL+RANKL 40ng/mL) ；B.融合蛋白 RTFP-I 實(shí)驗(yàn)組(M-CSF10ng/mL+融合蛋白 RTFP-I 30 μ g/mL) ；C.融合蛋白 RTFP-2 實(shí)驗(yàn)組(M-CSF 10ng/mL+ 融合蛋白 RTFP-2 30 μ g/mL)；其中，圖6(b)是細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，其中A.空白對(duì)照組(L929) ；B.陽性對(duì)照組 (L929+TNF- α 20ng/mL) ；C.融合蛋白 RTFP-1 實(shí)驗(yàn)組(L929+融合蛋白 RTFP-1 30ug/mL)； D.融合蛋白R(shí)TFP-2實(shí)驗(yàn)組(L929+融合蛋白R(shí)TFP-2 30ug/mL)；其中，圖6(c)是融合蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡活性的測(cè)定結(jié)果。圖7顯示的是RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的滴度及持續(xù)時(shí)間，其中圖7(a)是用rhRANKL作為包被抗原檢測(cè)免疫小鼠血清中產(chǎn)生的中和抗體滴度及持續(xù)時(shí)間；圖7(b)是用rhTNF-α作為包被抗原檢測(cè)免疫小鼠血清中產(chǎn)生的中和抗體滴度及持續(xù)時(shí)間。圖8顯示的是RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體中和rhTNF- α和 rhRANKL的能力，其中圖8 (a)是rhTNF-α所致的惡液質(zhì)小鼠的各組生存率檢測(cè)；圖8(b)是用rhRANKL所致骨鈣釋放后各組小鼠的血鈣水平測(cè)定。圖9顯示的是RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎 (Collagen-Induced Arthritis, CIA)小鼠的保護(hù)作用評(píng)估，其中圖9 (a)是各組小鼠的發(fā)病率；圖9(b)是各組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定；圖9(c)是各組小鼠的關(guān)節(jié)評(píng)分；圖9(d)是各組小鼠Micro-CT的骨侵蝕程度變化。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1 RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)RANKL-TNF 樣區(qū)重組片段(RANKL P171-234、P246-309，HIV-I 的 BRU 株逆轉(zhuǎn)錄酶RI^414-424aa))基因序列和pET-28a(+)表達(dá)載體的特征設(shè)計(jì)引物(見下表)， 以 RANKL 全長(zhǎng) cDNA 為模板(Gen Bank NO :BC117^6，1097bp ;pD0NR223，5004bp)，保留了 pET-28a自帶的His標(biāo)簽，采用重組PCR的方法連接三者的基因片段，其中將HIV-I的BRU 株逆轉(zhuǎn)錄酶RI^414-4Maa)的基因序列插在兩個(gè)RANKL-TNF樣區(qū)基因片段的中間，構(gòu)建得到表達(dá)載體為pET48a(+)-RTFP-I ；將HIV-I的BRU株逆轉(zhuǎn)錄酶RI^414_4Maa)的基因序列插在兩個(gè)RANKL-TNF樣區(qū)基因片段的末端，構(gòu)建得到表達(dá)載體為pET48a (+)-RTFP-2，并將上述兩個(gè)RANKL-TNF樣區(qū)基因片段直接拼接的野生型突變體作為對(duì)照得到的表達(dá)載體為pET-28a(+)-RTFP-3。相應(yīng)的融合基因序列如SEQ ID No. 1或3、5所示。PCR反應(yīng)條件: 98°C預(yù)變性30s，按下述參數(shù)循環(huán)30次96°C變性k，55_65°C退火15s，72°C延伸15s，最后 72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察其大小，通過重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定和雙酶切鑒定，見圖2，PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶，且雙酶切鑒定重組質(zhì)粒含有的目的基因片段為預(yù)期大小，說明本發(fā)明成功構(gòu)建了 RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白的原核表達(dá)載體。表1相關(guān)引物
權(quán)利要求
1.RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，其為RANKL-TNF樣區(qū)蛋白與具有泛宿主性的Th2細(xì)胞表位片段的融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為1)由SEQID No.2或 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2)SEQ ID No. 2或4所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并具有與1)所述蛋白具有同等功能的蛋白質(zhì)。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1或3所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述融合蛋白的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述融合蛋白的宿主細(xì)胞。
7.一種制備權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的方法，其包括如下步驟將權(quán)利要求3或4 所述的基因克隆到表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)菌體培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，分離純化得到該融合蛋白。
8.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疫苗中的應(yīng)用。
9.一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疫苗，其為有效劑量的權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白與生物制劑/疫苗學(xué)上可接受的載體制成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，其為RANKL-TNF樣區(qū)蛋白與具有泛宿主性的Th2細(xì)胞表位片段的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗體具有結(jié)合RANKL和TNF-α的功效，可以用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病，發(fā)揮拮抗骨破壞和抑制炎癥作用。本發(fā)明RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白可以作為治療性疫苗使用，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病提供一種新的治療途徑和思路。本發(fā)明通過體外表達(dá)RANKL-TNF樣區(qū)融合蛋白，該方法表達(dá)量高，可控性強(qiáng)，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，且產(chǎn)物具有良好的免疫原性，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102241776SQ201110135019
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者余丹, 袁慧慧, 趙文明 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)