專利名稱：一種基于dna水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應用。
背景技術(shù)：
RNA復制子是將RNA病毒基因組中的結(jié)構(gòu)基因刪除，而保留其非結(jié)構(gòu)基因和非編碼區(qū)的順式作用元件，復制子利用正鏈RNA病毒的自主復制特性，能夠在細胞中表達病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白和外源蛋白。以正鏈RNA病毒為基礎(chǔ)的RNA復制子表達系統(tǒng)，已廣泛地應用于新型疫苗、導向載體制備和基因治療等領(lǐng)域。申請?zhí)枮?00910236832.2的中國發(fā)明專利申請公開了一種日本腦炎病毒JEV復制子載體及其應用，以及用于該復制子載體包裝的細胞系及包裝系統(tǒng)。但其中在結(jié)構(gòu)基因缺失方面并不相同，另外在插入外源基因的多克隆位點區(qū)域的限制性內(nèi)切酶識別位點并不相同，本研究選擇的限制性內(nèi)切酶為較為常用的同尾酶，可以避免外源基因插入一些特異 DNA片段帶來很多困難。另外，在保留結(jié)構(gòu)基因的序列和其它真核表達原件也不相同，這方面對載體本身的復制和表達效率有重要的決定作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)。本發(fā)明另一目的在于提供上述基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，是利用RT-PCR和融合PCR的方法，以改造過的低拷貝質(zhì)粒POKM為骨架，在缺失絕大部分結(jié)構(gòu)基因(第165-M02核苷酸) 的情況下，構(gòu)建包括CMV啟動子、5’ UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的 NS1蛋白的信號肽(E25 )、所有非結(jié)構(gòu)蛋白、3，UTR、核酶(HDVr )和poIyA序列的基于DNA水平的JEV復制子載體系統(tǒng)。上述基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟 設(shè)計引物，其序列如SEQ ID NO:廣18所示，從質(zhì)粒pWF-GFP中擴增片段A，再從JEV的基因
組RNA中擴增出片段B、C、D和片段II ,再以片段A和B為模板，通過融合PCR的方法擴增出片段I ；以片段C和D為模板，融合PCR擴增出片段III,將片段I JI和III定向克隆到低拷貝質(zhì)粒中，得到基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)。作為一種優(yōu)選方案，上述構(gòu)建方法中，所述低拷貝質(zhì)粒為pOKM。通過本發(fā)明的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，還可進一步構(gòu)建出含報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)是在權(quán)利要求1所述
的系統(tǒng)的缺失結(jié)構(gòu)基因的位置引入了 SpeI和SalI兩個酶切位點。 通過上述含報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，還可以進一步構(gòu)建出含IRES元件和報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，該系
統(tǒng)是在含報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)中Mll酶切位點的3’
端插入IRES元件，通過插入IRES元件，從而允許在NSl信號序列的起點能夠開始內(nèi)部的翻譯，可以提高翻譯后的蛋白切割及加工效率。另外，這種情況下外源蛋白的表達不僅僅是依靠JEV亞基因組的表達，它同時獲得CMV啟動子賦予的瞬時表達的能力，從而更好地表達外源蛋白。作為一種優(yōu)選方案，上述IRES元件為腦心肌炎病毒的翻譯調(diào)控元件。本發(fā)明上述兩種乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)中可以插入外源基因，得到重組表達載體，再轉(zhuǎn)染真核細胞后，表達外源蛋白。IRES 序列如 SEQ ID NO: 19 所示。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
申請?zhí)枮?00910236832. 2的中國發(fā)明專利申請公開了一種日本腦炎病毒JEV復制子載體及其應用。該專利涉及的復制子載體在缺失結(jié)構(gòu)基因PrM和E基因，并且保留了 C基因的編碼區(qū)和NSl的信號肽編碼區(qū)；而本發(fā)明缺失全部結(jié)構(gòu)基因包括(C、prM和E基因)只保留了 C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)，和E蛋白C端的25個氨基酸(E25)。而Sang-Ln Yun 在 Journal of Neurovirology 雜志上發(fā)表的文章(Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: Implications for packaging capacity and RNA replication efficiency)己經(jīng)表明JEV復制子在轉(zhuǎn)染細胞48小時后，實時定量RT-PCRR的結(jié)果表明缺失三個結(jié)構(gòu)基因的JEV復制子產(chǎn)生的復制子RNA是保留C基因6倍多，而在熒光素酶的表達量則高出大約6 倍。因此，JEV復制子在缺失全部結(jié)構(gòu)基因(C、prM和E基因)在JEV復制子RNA的產(chǎn)量和外源蛋白表達量在JEV復制子RNA的產(chǎn)量和外源蛋白表達量明顯效率更高，更優(yōu)越。同時， 本發(fā)明還在NSl的信號肽編碼區(qū)前加入IRES (內(nèi)部核糖體進入位點)，在表達外源基因方面不僅擁有復制子的功能，同時具備瞬時表達的功能，可增能外源蛋白的表達量。本發(fā)明主要是針對基于DNA水平的JEV復制子與SangHm Yun等人發(fā)表的JEV復制子在傳遞方面有本質(zhì)的不同；另外，本發(fā)明立足研發(fā)一種基于DNAI水平的疫苗載體，而DNA在保存和傳遞方面比RNA更穩(wěn)定，操作也更方面。


圖1為PCR擴增產(chǎn)物，其中，1為DL2，OOODNA Marker ;2為A片段；3為B片段；4為片段I ；5為片段Π ；6為片段III ；7為D片段；8為C片段；9為DL15, 000 DNA Marker ；
圖2為JEV復制子構(gòu)建的酶切鑒定，其中，1為DL15，000 DNA Marker ;2為pOK-JEV-REP 酶切產(chǎn)物(Notl/BamHI) ；3 為 pOK-JEV-REP 酶切產(chǎn)物(BamHI/ XbaI) ；4 為 pOK-JEV-REP 酶切產(chǎn)物(Xbal/Kpnl) ；5 為 λ-EcoT14 I digest Marker ；
圖3為GFP和GFP-IRES的PCR擴增產(chǎn)物,其中，1為GFP-IRES片段PCR產(chǎn)物；2為EGFP 片段的PCR產(chǎn)物；3為以水為模板的PCR產(chǎn)物；4為以水為模板的PCR產(chǎn)物；5為DL2，000 DNA Marker ；
圖 4 為 pJEV-REP-GFP-IRES 和 pJEV-REP-GFP 的酶切鑒定，其中，1 為 DL2, 000DNA Marker ；2 為 pJEV-REP-GFP 酶切產(chǎn)物；3 為 pJEV-REP-GFP-IRES 酶切產(chǎn)物； 圖5為RT-PCR鑒定JEV復制子復制能力；
圖6為RT-PCR鑒定JEV復制子正、負義鏈的合成，其中，1-4.為反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作10 倍稀釋；5-8為反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作20倍稀釋；9為DL2，000 DNA Marker ；
圖7為含報告基因JEV-REP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(Χ400)，其中，A 為 pJEV-REP-GFP 轉(zhuǎn)染細胞；B 為 pJEV-REP-GFP-IRES 轉(zhuǎn)染細胞；C 為細胞；
圖 8 為 pJEV-REP-GFP-IRES 與 pJEV-REP-GFP 轉(zhuǎn)染細胞 48h 的結(jié)果(X 200)，其中， A 為 pJEV-REP-GFP 轉(zhuǎn)染 BHK-21 細胞；B 為 pJEV-REP-GFP-IRES 轉(zhuǎn)染 BHK-21 細胞；C 為 pJEV-REP-GFP 轉(zhuǎn)染 293T 細胞；D 為 pJEV-REP-GFP-IRES 轉(zhuǎn)染 293T 細胞。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1 JEV復制子各片段的擴增及鑒定
從質(zhì)粒PWF-GFP中擴增片段A，大小約0. 7Kb ；然后以日本乙型腦炎病毒疫苗株
SA14-14-2基因組RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板分別擴增出B、C和片段II ,大小分別為 3. 3Kb，1.8 Kb和3. 6Kb ；接著以質(zhì)粒pWF_GFP為模板，擴增出D片段，大小0. 8Kb ；再以A與 B片段為模板，通過融合PCR的方法擴增出片段I，大小約為4KB，而以C和D片段為模板融
合PCR擴增出片段III,大小約為2. 7Kb (見圖1)。全長JEV復制子cDNA的克隆與鑒定
片段I、II、III三個片段定向克隆到載體P0KM，得到的JEV復制子質(zhì)粒命名為
ρJEV-REPο然后用限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI、BamHI和XbaI、XbaI和KpnI分別進行酶切鑒定，結(jié)果表明PJEV-REP酶切后得到的片段分別約為4 Kb和7 Kb,3. 6 Kb和7. 4 Kb、以及 2.7 Kb和8. 3 Kb (見圖2)，片段大小與預期相符合。接著進行序列測定，確定構(gòu)建的質(zhì)粒無發(fā)生突變，表明片段I >11、III插入到低拷貝質(zhì)粒pOKM中，這說明JEV復制子cDNA的克隆構(gòu)建成功。實施例2含報告基因的JEV復制子的載體的構(gòu)建。從質(zhì)粒pWF-GFP通過PCR的方法擴增出EGFP片段，大小約為720bp。另外，以質(zhì)粒pIRESl-neo為模板通過PCR的方法擴增IRES序列，再與片段EGFP通過融合PCR的方法擴增出EGFP-IRES片段，大小約為l，300bp，然后分別插入到pJEV-REP質(zhì)粒中。通過限制性內(nèi)切酶SpeI和MlI進行酶切鑒定，結(jié)果表明質(zhì)粒pJEV-REP-GFP酶切后得到的片段約為 720bp 和 11，OOObp，而 pJEV-REP-GFP-IRES 酶切后得到約 1310bp 和 11，OOObp (見圖 3)，與預期相符合，經(jīng)測序證明無誤，這表明含報告基因GFP的JEV復制子構(gòu)建成功(結(jié)構(gòu)圖如4)。實施例3 基于DNA水平的JEV復制子pJEV_REP-GFP_IRES與pJEV-REP-GFP均能在細胞中實現(xiàn)自我復制
將pJEV-REP-GFP-IRES與pJEV-REP-GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，48h后收集細胞進行總RNA提取，再利用不同的反轉(zhuǎn)引物來檢測其復制情況。RT-PCR結(jié)果表明(如圖5)，兩組含 EGFP報告基因的JEV復制子與JEV —樣，正鏈與負鏈均能擴增出約300bp的特異性片段，而未經(jīng)反轉(zhuǎn)的RNA無法擴增出特異性片段，表明反轉(zhuǎn)的RNA里沒有質(zhì)粒的污染；而且當cDNA 作10倍和20倍稀釋后，結(jié)果顯示正鏈合成的量比負鏈合成的量多(如圖6)。實施例4可檢測到JEV-REP非結(jié)構(gòu)蛋白的表達
pJEV-REP-GFP-IRES與pJEV-REP-GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞4 后用間接免疫熒光的方法檢測到兩種JEV-REP均有JEV NSl蛋白的表達(見圖7)。實施例5高效表達外源基因EGFP的表達
在轉(zhuǎn)染pJEV-REP-GFP-IRES質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染BHK細胞和細胞后的結(jié)果，隨著時間的增加熒光的表達量逐漸增加(見圖8)。
權(quán)利要求
1.一種基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)包括CMV啟動子、5’ UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽、所有非結(jié)構(gòu)蛋白、3’ UTR、核酶和polyA序列。
2.權(quán)利要求1所述基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟設(shè)計引物，其序列如SEQ ID NO:廣18所示，從質(zhì)粒pWF-GFP中擴增片段A，再從JEV的基因組RNA中擴增出片段B、C、D和片段 II,再以片段A和B為模板，通過融合PCR的方法擴增出片段I ;以片段C和D為模板，融合 PCR擴增出片段III,將片段I、Π和!Π定向克隆到低拷貝質(zhì)粒中，得到基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法， 其特征在于所述低拷貝質(zhì)粒為Ρ0ΚΜ。
4.一種含報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)是在權(quán)利要求1所述系統(tǒng)的缺失結(jié)構(gòu)基因位置引入了 Spe I和Ml I兩個酶切位點。
5.一種含IRES元件和報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，其特征在于IRES元件位于權(quán)利要求4所述乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)中酶切位點的 3，端。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含IRES元件和報告基因的基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)，其特征在于所述IRES元件為腦心肌炎病毒的翻譯調(diào)控元件。
7.—種重組表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求廣6中任意一條權(quán)利要求所述的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)。
8.權(quán)利要求7所述重組表達載體在蛋白表達中的應用。
9.權(quán)利要求7所述重組表達載體在真核細胞中表達報告基因中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應用。本發(fā)明是利用RT-PCR和融合PCR的方法，以改造過的低拷貝質(zhì)粒pOKM為骨架，在缺失絕大部分結(jié)構(gòu)基因(第165-2402核苷酸)的情況下，構(gòu)建包括CMV啟動子、5’UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的25個氨基酸(E25)、所有非結(jié)構(gòu)蛋白、3’UTR、核酶(HDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV復制子載體系統(tǒng)。為了檢測構(gòu)建的JEV復制子能否表達外源基因，構(gòu)建含有報告基因EGFP的質(zhì)粒pJEV-REP-GFP-IRES與pJEV-REP-GFP。
文檔編號C12N15/85GK102250950SQ201110135709
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者亓文寶, 劉國乾, 廖明, 臧富玉, 陳孝明 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學