專利名稱：一種提高工程大腸桿菌間苯三酚合成能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)間苯三酚的工程大腸桿菌。本發(fā)明還涉及用上述工程大腸桿菌制備間苯三酚的方法。
背景技術(shù)：
間苯三酚又名1，3，5-三羥基苯、均苯三酚，是重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，可以用作藥物合成的中間體、燃料耦合劑、輪胎增粘劑以及偶氮復(fù)合油墨等原料，在紡織品及皮革染色工藝、生產(chǎn)塑料膠囊、替代碘化銀用于人工降雨等方面有廣泛應(yīng)用。除此之外，間苯三酚本身還是一種優(yōu)良的醫(yī)藥產(chǎn)品，性能優(yōu)越的抗養(yǎng)護(hù)劑，早已廣泛用于抗菌、防腐等。早在20世紀(jì)50年代，間苯三酚的化學(xué)合成工藝就已經(jīng)建立起來(lái)并應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，包括2，4，6_三硝基甲苯(TNT)途徑、1，3，5-三異丙基苯途徑等。但傳統(tǒng)的化學(xué)合成
工藝后處理較難、污染環(huán)境且原料存在安全隱患，同時(shí)副產(chǎn)物的存在使得間苯三酚的分離精制比較困難。生物催化是以酶為催化劑來(lái)完成的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好；以可再生資源為底物的生物催化合成，是解決全球能源危機(jī)的有效途徑，近年來(lái)研究非?；钴S。間苯三酚及其衍生物的生物催化合成途徑主要是在對(duì)熒光假單胞菌PhlACBDE基因簇的功能分析的基礎(chǔ)形成的。通過(guò)反向遺傳學(xué)的手段，研究者發(fā)現(xiàn)了間苯三酚合成的關(guān)鍵基因phlD，PhlD蛋白可催化小分子底物丙二酸單酰輔酶A聚酮縮合及環(huán)化等一系列反應(yīng)，最終生成間苯三酚，這一研究使生物法合成間苯三酚成為可能。中國(guó)發(fā)明專利200810225401進(jìn)一步證實(shí)了在工程大腸桿菌中異源表達(dá)PhlD基因可以導(dǎo)致間苯三酚在培養(yǎng)基中的積累。然而，間苯三酚作為一種酚類物質(zhì)，本身就是一種優(yōu)良的殺菌劑，對(duì)大腸桿菌的正常生長(zhǎng)具有嚴(yán)重的抑制作用。另一方面，間苯三酚不是大腸桿菌的正常代謝產(chǎn)物，野生型大腸桿菌的代謝流并不適用于間苯三酚的高效合成。因此，上述間苯三酚合成工程菌的產(chǎn)量還比較低，離實(shí)際應(yīng)用的要求尚有一定差距。

發(fā)明內(nèi)容
為了進(jìn)一步提高大腸桿菌工程菌的間苯三酚合成能力，我們采用代謝工程的手段對(duì)該工程菌株進(jìn)行了改造。為了提高大腸桿菌對(duì)間苯三酚的耐受性，我們?cè)诖竽c桿菌中過(guò)量表達(dá)了多重抗性激活因子marA基因。MarA是的一個(gè)正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，能參與調(diào)控大腸桿菌60多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，所激活轉(zhuǎn)錄的基因中包括acrAB、TolC等，是大腸桿菌最主要的主動(dòng)外排系統(tǒng)，可使大腸桿菌對(duì)抗生素、有毒物質(zhì)和有機(jī)溶劑的耐受性顯著增加。另外，我們對(duì)大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行改造，使代謝流重定向到間苯三酚合成的分支。本發(fā)明的目的在于提供一種提高工程大腸桿菌間苯三酚合成能力的方法。為了增強(qiáng)大腸桿菌流向間苯三酚的代謝流，我們?cè)诖竽c桿菌中過(guò)量表達(dá)了自身的乙酰輔酶A羧化酶基因(ACCase)。ACCase屬于生物素包含酶的類型，在絕大多數(shù)細(xì)胞中均有分布。ACCase催化脂肪酸從頭合成的第一步，是生物體內(nèi)脂肪酸合成的限速酶，在脂肪酸代謝過(guò)程中起著重要的作用。大腸桿菌ACCase，屬于異質(zhì)型ACCase，由四個(gè)亞基組成生物素羧基載體蛋白亞基，生物素羧化酶亞基和轉(zhuǎn)羧酶的兩個(gè)亞基。ACCase能夠催化乙酰輔酶A與二氧化碳羧化生成丙二酸單酰輔酶A，而丙二酸單酰輔酶A則是合成間苯三酚的直接前體。因此，過(guò)量表達(dá)ACCase對(duì)于提高間苯三酚產(chǎn)量具有重要作用。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，本發(fā)明提供的工程大腸桿菌制備間苯三酚的步驟為構(gòu)建酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞，所述酶系統(tǒng)包括聚烯酮酐合成酶(PhlD) (GenBank登錄號(hào)6060688)、多重抗性因子(MarA) (GenBank登錄號(hào)6060688)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase) (GenBank 登錄號(hào)6062185、6058890、6058863 或 6059083);所述重組細(xì)胞整合了編碼聚烯酮酐合成酶的基因PhlD、編碼多重抗性因子的基因marA和編碼乙酰輔酶A羧化酶的ACCase基因。使用上述重組細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)間苯三酚的方法包括以下步驟將重組細(xì)胞按體積比1-5 %的接種量接種到添加50 μ g · ml/1卡那霉素·和30μ8 mL—1氯霉素的M9發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度30-37 °C、攪拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. O和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至OD6tltl約為8-12，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度O. I-Immol · L—1，繼續(xù)補(bǔ)料40-80重量％的葡萄糖發(fā)酵12-24小時(shí)；將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離細(xì)胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取1-3次；合并萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末即為間苯三酚。更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)I. 一種提高細(xì)胞合成間苯三酚的能力的方法，所述方法包括在所述細(xì)胞中表達(dá)多重抗性因子(MarA)。2.根據(jù)以上I所述的方法，所述方法還包括在所述細(xì)胞中表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)。3.根據(jù)以上I或2所述的方法，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)聚烯酮酐合成酶(PhlD)。4.根據(jù)以上3所述的方法，其中所述細(xì)胞是突光假單胞菌(Psendomonasfluorescens)或?qū)肓四軌虮磉_(dá)聚烯酮酐合成酶(PhlD)的表達(dá)載體的重組大腸桿菌細(xì)胞(Escherichia coli)。5.根據(jù)以上4所述的方法，其中在所述重組大腸桿菌細(xì)胞中共表達(dá)編碼聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD、編碼多重抗性因子(MarA)的基因marA和編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因，優(yōu)選所述共表達(dá)是通過(guò)一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)用于共表達(dá)這些基因的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的。6.根據(jù)以上5所述的方法，其中所述phlD基因是來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選來(lái)源于熒光假單胞菌，或是和PhlD基因同源性超過(guò)70%的核酸序列，或來(lái)源于其它生物體，和phlD基因沒(méi)有明顯的同源性，但和PhlD具有相同或相似功能的核酸序列； 所述marA基因是來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌，或是和marA同源性超過(guò)70 %的核酸序列，或來(lái)源于其它生物體，和marA基因沒(méi)有明顯的同源性，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；和所述ACCase基因是來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌，或是和ACCase基因同源性超過(guò)70%的核酸序列，或來(lái)源于其它生物體，和ACCase基因沒(méi)有明顯的同源性，但和ACCase具有相同或相似功能的核酸序列。
7. 一種用于合成間苯三酚的重組細(xì)胞，其中該細(xì)胞共表達(dá)編碼聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD ;以及編碼多重抗性因子(MarA)的基因marA和編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因中的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè),更優(yōu)選所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞,還更優(yōu)選所述共表達(dá)是通過(guò)一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)用于共表達(dá)這些基因的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的。8. 一種利用以上7所述的重組細(xì)胞生產(chǎn)間苯三酚的方法，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，其中所述方法包括(I)將以上7所述的大腸桿菌重組細(xì)胞按體積比1-5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度30-37°C、攪拌速度400-800rpm、pH6. 0-8. O和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至OD6tltl約為8-12，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度O. I-Immol · L—1，繼續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵12-24小時(shí)；(2)將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離大腸桿菌菌體和上清，上清采用等體積的萃取劑萃取1-3 次； (3)合并(2)中所述萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末即為間苯三酚。9.根據(jù)以上8所述的方法，其中所述方法適用于搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)。10.根據(jù)以上8所述的方法，其中I)所述培養(yǎng)基為M9發(fā)酵培養(yǎng)基，并向其中添加了 SOygiL-1卡那霉素和30 μ g · ml/1 氯霉素；2)所述方法采用分批補(bǔ)料發(fā)酵，補(bǔ)料底物為40-80重量％的葡萄糖；和/或3)所述萃取劑為乙酸乙酯。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明中的酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞其間苯三酚合成能力大大提高，每升發(fā)酵液間苯三酚產(chǎn)量可達(dá)到3. 5-5克，而僅表達(dá)PhlD蛋白的重組細(xì)胞每升發(fā)酵液間苯三酚產(chǎn)量為2-2. 3克，經(jīng)改造后的菌株間苯三酚產(chǎn)量提高了 I. 5-2. 5倍，該方法為間苯三酚生物合成的工業(yè)化應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖I是聚烯酮酐合成酶(phlD)、多重抗性因子(marA)共表達(dá)載體pET-phlDmarA的不意圖；圖2是乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)表達(dá)載體pA-accADBC的示意圖。圖3是間苯三酚的核磁共振氫譜。圖4是間苯三酚的核磁共振碳譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :構(gòu)建聚烯酮酐合成酶(phlD)和多重抗性因子(marA)共表達(dá)的載體，具體過(guò)程如下以寡核苷酸5’ -CAT GCC ATG GTA GAT AAA CGC GAA TC-3’ 和 5’ -ACG CGT CGACTC AGAAGG CAG ACG TAT CC-3’為引物，以熒光假單胞菌 Pf_5 [Psendomonas fluorescensPf_5(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC BAA-477)]基因組DNA為模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增出聚烯酮酐合成酶(phlD)基因，并在5’端和3’端分別引入NdeI和BamHI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用NdeI和BamHI酶切的pET30a (Novagen)載體上，得到重組質(zhì)粒pET-phlD;以寡核苷酸5’-CAT GCC ATG GGC ATG TCC AGA CGC AATACT GAC GC-3’ 和 5’ -GGA GGA TCC TAG CTG TTG TAA TGA TTT AAT GGA TG-3’ 為引物，以大腸桿菌BL21 [Escherichia coli BL21 (購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC 41842)]基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出多重抗性基因(marA)基因，并在5’端和3’端分別引入NcoI和BamHI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用NcoI和BamHI酶切的pACYCduet-1 (Novagen)載體上，得到重組質(zhì)粒 pA-marA ;以寡核苷酸 5’ -CCG GAA TTC TTAATA CGA CTC ACT ATA GGG G-3’ 和 5’ -ACG CGT CGA CCT AGC TGT TGT AAT GAT TTA ATGGAT G-3’為引物，以重組質(zhì)粒pA-marA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出T7marA片段，并在5’端和3’端分別引入EcoRI和SalI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用EcoRI和SalI酶切的pET-phlD載體上，得到重組質(zhì)粒pET-phlDmarA(參見(jiàn)圖I)。構(gòu)建乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的表達(dá)載體，具體過(guò)程如下
以寡核苷酸5’-CGCGGA TCC GAT GAG TCT GAA TTT CCT TGA TTT TG-3’和5’_ATGCGA GCT CTT ACG CGT AAC CGT AGC TCA TC-3’為引物，以大腸桿菌BL21基因組為模板，用PCR方法擴(kuò)增出乙酰輔酶A羧化酶亞基A基因，并在5’端和3’端分別引入BamHI和SacI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用BamHI和SacI酶切的pACYCduet-Ι載體上，得到重組質(zhì)粒 pA-accA ;以寡核苷酸 5’ -CGC GGA TCC GAT GAG CTG GAT TGA ACG AATTAA AAG-3’ 和 5’ -ATG CGAGCT CTC AGG CCT CAG GTT CCT GAT C-3’ 為引物，以大腸桿菌BL21基因組為模板，用PCR方法擴(kuò)增出乙酰輔酶A羧化酶亞基D基因，并在5’端和3’端分別引入BamHI和SacI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用BamHI和SacI酶切的pACYCduet-Ι載體上，得到重組質(zhì)粒pA-accD;以寡核苷酸5’-ATG CGA GCT CTT AATACG ACT CAC TAT AGG GG-3，和 5，-ACG CGT CGA CTC AGG CCT CAG GTT CCT GAT C-3，為引物，以重組質(zhì)粒pA-accD為模板，用PCR方法擴(kuò)增出T7accD片段，并在5’端和3’端分別引入SacI和SalI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用SacI和SalI酶切的pA-accA載體上，得到重組質(zhì)粒pA-accAD ;以寡核苷酸5’ -GGA ATT CCA TAT GGA TAT TCGTAA GAT TAA AAA AC-3’ 和 5’ -CCG CTC GAG TTA TTT TTC CTG AAG ACC GAG-3’ 為引物，以大腸桿菌BL21基因組為模板，用PCR方法擴(kuò)增出乙酰輔酶A羧化酶亞基BC基因，并在5’端和3’端分別引入NdeI和XhoI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到同樣用NdeI和XhoI酶切的pA-accAD載體上，得到重組質(zhì)粒pA_accADBC(參見(jiàn)圖2)。實(shí)施例2 將實(shí)施例I中構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pET-phlDmarA和pA_accADBC采用熱擊轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，然后涂布于帶有卡那霉素和氯霉素兩種抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選陽(yáng)性克隆，得到重組大腸桿菌BL21/phlDACCaSemarA。實(shí)施例3 采用實(shí)施例2中構(gòu)建得到的重組大腸桿菌BL21/phlDACCasemarA發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，其步驟如下將重組細(xì)胞按體積比I %的接種量接種到添加50 μ g ι Γ1卡那霉素和30 μ g πιΓ1氯霉素的Μ9發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度30°C、攪拌速度400rpm、pH 6. O和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至OD6tltl約為8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度O. Immol · L—1，繼續(xù)補(bǔ)料40重量％的葡萄糖發(fā)酵12小時(shí)；將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離細(xì)胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取I次；合并萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末經(jīng)核磁共振氫譜(參見(jiàn)附圖3)和碳譜(參見(jiàn)附圖4)鑒定為間苯三酚，每升培養(yǎng)基的產(chǎn)量達(dá)到3. 5克。實(shí)施例4: 采用實(shí)施例2中構(gòu)建得到的重組大腸桿菌BL21/phlDACCasemarA發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，其步驟如下將重組細(xì)胞按體積比3%的接種量接種到添加50 μ g ι Γ1卡那霉素和30 μ g πιΓ1氯霉素的Μ9發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度33°C、攪拌速度600rpm、pH 7. O和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至0D_約為10，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度O. 5mmol ·Ι^，繼續(xù)補(bǔ)料60重量％的葡萄糖發(fā)酵18小時(shí)；將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離細(xì)胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取2次；合并萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末經(jīng)質(zhì)譜鑒定即為間苯三酚，每升培養(yǎng)基的產(chǎn)量達(dá)到4. 3克。實(shí)施例5 采用實(shí)施例2中構(gòu)建得到的重組大腸桿菌BL21/phlDACCasemarA發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，其步驟如下將重組細(xì)胞按體積比5%的接種量接種到添加50 μ g ι Γ1卡那霉素和30 μ g πιΓ1氯霉素的Μ9發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度37°C、攪拌速度800rpm、pH 8. O和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至OD6tltl約為12，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度Immol噸―1，繼續(xù)補(bǔ)料80重量％的葡萄糖發(fā)酵24小時(shí)；將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離細(xì)胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取3次；合并萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末經(jīng)質(zhì)譜鑒定即為間苯三酚，每升培養(yǎng)基的產(chǎn)量達(dá)到5克。
權(quán)利要求
1.一種提高細(xì)胞合成間苯三酚的能力的方法，所述方法包括在所述細(xì)胞中表達(dá)多重抗性因子(MarA) (GenBank 登錄號(hào)6060688)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括在所述細(xì)胞中表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶(ACCase) (GenBank 登錄號(hào)6062185、6058890、6058863 或 6059083)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)聚烯酮酐合成酶(PhlD)(GenBank 登錄號(hào)EU554263)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞是突光假單胞菌(Psendomonasfluorescens)或?qū)肓四軌虮磉_(dá)聚烯酮酐合成酶(PhlD)的表達(dá)載體的重組大腸桿菌細(xì)胞(Escherichia coli)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在所述重組大腸桿菌細(xì)胞中共表達(dá)編碼聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD、編碼多重抗性因子(MarA)的基因marA和編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因，優(yōu)選所述共表達(dá)是通過(guò)一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)用于共表達(dá)這些基因的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述phlD基因是來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選來(lái)源于熒光假單胞菌，或是和PhlD基因同源性超過(guò)70%的核酸序列，或來(lái)源于其它生物體，和phlD基因沒(méi)有明顯的同源性，但和PhlD具有相同或相似功能的核酸序列； 所述marA基因是來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌，或是和marA同源性超過(guò)70 %的核酸序列，或來(lái)源于其它生物體，和marA基因沒(méi)有明顯的同源性,但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；和 所述ACCase基因是來(lái)源于細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌，或是和ACCase基因同源性超過(guò)70 %的核酸序列，或來(lái)源于其它生物體，和ACCase基因沒(méi)有明顯的同源性，但和ACCase具有相同或相似功能的核酸序列。
7.一種用于合成間苯三酚的重組細(xì)胞，其中該細(xì)胞共表達(dá)編碼聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD ;以及編碼多重抗性因子(MarA)的基因marA和編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因中的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè),更優(yōu)選所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞,還更優(yōu)選所述共表達(dá)是通過(guò)一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)用于共表達(dá)這些基因的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
8.一種利用權(quán)利要求7所述的重組細(xì)胞生產(chǎn)間苯三酚的方法，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，其中所述方法包括 (1)將權(quán)利要求7所述的大腸桿菌重組細(xì)胞按體積比1-5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度30-37°C、攪拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. O和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至0D_約為8-12，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度O. I-Immol ·Ι^，繼續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵12-24小時(shí)； (2)將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，分離大腸桿菌菌體和上清，上清采用等體積的萃取劑萃取1-3次； (3)合并(2)中所述萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末即為間苯三酚。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述方法適用于搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中 I)所述培養(yǎng)基為Μ9發(fā)酵培養(yǎng)基,并向其中添加了 50 μ g *mL_1卡那霉素和30 μ g *mL_1氣霉素;2)所述方法采用分批補(bǔ)料發(fā)酵，補(bǔ)料底物為40-80重量％的葡萄糖；和/或 3)所述萃取劑為乙酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高重組細(xì)胞間苯三酚合成能力的方法，具體說(shuō)涉及一種通過(guò)代謝工程手段改造重組細(xì)胞，提高生物法合成間苯三酚產(chǎn)量的方法。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102787135SQ20111013303
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者咸漠, 張海波, 曹玉錦, 趙國(guó)明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所