專利名稱：基于足細胞粘附的抗早期糖尿病腎病藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選藥物的方法，尤其涉及一種基于足細胞粘附性的實時動態(tài)高通量篩選抗早期糖尿病腎病藥物的方法。
背景技術(shù)：
藥物的應用是十分復雜的研究，提高藥物的準確應用在醫(yī)藥研究中具有重要意義。藥物篩選是指對投入應用的藥物需要篩選并對藥物價值的評價，篩選的樣品越多，發(fā)現(xiàn)針對性強、合適的藥物的可能性越大，因此高通量藥物篩選技術(shù)成為目前藥物篩選的重要
Tno高通量篩選技術(shù)(High-throughput Screening, HTS)是20世紀80年代后期形 成的尋找藥物的高新技術(shù)，是應用先進的分子生物學、細胞生物學、計算機、自動化控制等高新技術(shù)，建立的一套更適合于藥物篩選的技術(shù)系統(tǒng)。高通量篩選技術(shù)以分子和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微孔板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程，以計算機對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行分析外理，在同一時間內(nèi)可以對數(shù)以萬計的樣品進行快速檢測。高通量藥物篩選采用的篩選模型是體外微量實驗方法，主要是分子和細胞水平的評價方法，而不是傳統(tǒng)的動物實驗或組織器官實驗方法，這種微量實驗方法減少了樣品試劑材料的消耗，減低了篩選成本，但需要檢測方法具有較高的特異性和靈敏性。糖尿病腎病是臨床常見和多發(fā)的糖尿病并發(fā)癥。是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，糖尿病腎病為糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，主要指糖尿病性腎小球硬化癥，一種以血管損害為主的腎小球病變，隨著糖尿病患者數(shù)量的不斷增加，對抗早期糖尿病腎病的藥物的研究和尋找越發(fā)重要。尤其對于中藥來講，雖然具有毒副作用小等優(yōu)勢，但是中藥種類繁多，而且對其功能研究不夠充分，因此如何在眾多中草藥中選擇出能夠抗早期糖尿病腎病的藥物并不容易，因此找出一種能夠快速篩選抗糖尿病腎病藥物的方法不僅對糖尿病腎病的治療非常關(guān)鍵，同時也對中藥開發(fā)和利用有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種基于細胞粘附性的抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法，所述篩選藥物的方法為采用xCELLigence系統(tǒng)聯(lián)合流式細胞儀檢測技術(shù)、建立基于足細胞粘附的實時動態(tài)高通量藥物篩選方法，在細胞及分子水平篩選抗早期糖尿病腎病藥物，并能夠通過動態(tài)檢測足細胞粘附，達到實時觀測細胞生長、藥物效應起始時間點與最大作用時間點的目的。本發(fā)明抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法包括以下步驟
步驟1，將足細胞種植于培養(yǎng)板中，建立高糖刺激下的足細胞病理模型，將待篩選藥物加入到已種植所述足細胞的培養(yǎng)板中；優(yōu)選地，所述高糖刺激下的足細胞病理模型中，含有D-葡萄糖 30mmol/L。
步驟2，采用xCELLigence系統(tǒng)對加入待篩選藥物的足細胞粘附性進行實時動態(tài)監(jiān)測，并設(shè)立不加任何藥物的高糖對照組和正常糖對照組；優(yōu)選地，所述高糖對照組中，含有甘露醇25mmol/L，D-葡萄糖5mmol/L。步驟3，選出能夠增加足細胞粘附性的藥物。步驟4，采用流式細胞儀對加入步驟3中所選出藥物的樣品細胞a j I整合素表達進行檢測；
步驟5，選出能增加a 整合素表達的藥物。上述篩選藥物的方法中，所述待篩選藥物包括天然藥物以及中藥單體。
上述篩選藥物的方法中，步驟2中所述足細胞置于鋪有基底復合膜的96孔板中，所述樣品細胞密度為3X IO4個/孔。所述基底復合膜為能夠模擬人體腎小球基底膜的物質(zhì)。上述篩選藥物的方法中，步驟4中所述足細胞置于鋪有基底復合膜的96孔板中，所述樣品細胞密度為3 X IO4個/孔。上述篩選藥物的方法中，步驟2中所述實施動態(tài)檢測為每隔6分鐘對足細胞粘附性進行檢測。上述篩選藥物的方法中，步驟2中所述實施動態(tài)檢測還包半數(shù)有效濃度的計算，以及藥物效應起始時間點、最佳作用時間、藥物最佳劑量、有效劑量的檢測。其中，所述最佳作用時間指的是足細胞粘附性增至最大時的時間，最佳劑量指的是能夠增加足細胞粘附性的最小毒性劑量。本發(fā)明基于細胞粘附性的抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法，優(yōu)點在于
I)本發(fā)明抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法可以在分子水平上對單細胞進行定量分析和分選，高速分析上萬個細胞，并能同時測得細胞中多個參數(shù)，進行快速的高通量篩選，適用于高通量篩選抗早期糖尿病腎病藥物，極大加速抗早期糖尿病腎病新藥的發(fā)現(xiàn)進程。2)本發(fā)明抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法無需標記和破壞細胞，因此不需要費力且成本高的細胞標記及細胞裂解或固定。3)本發(fā)明抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法可實時觀測足細胞生長、藥物效應起始時間點與最大作用時間點，并提供不同時刻足細胞粘附半數(shù)有效濃度(EC50)，實現(xiàn)實時動態(tài)、準確高效篩選增加足細胞粘附的化合物，改變了傳統(tǒng)細胞分析只能僅僅提供最終結(jié)果的終端形式。4)本發(fā)明抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法，經(jīng)動物實驗和Z’因子分析證明具有穩(wěn)定性和可靠性。綜上，本發(fā)明提供的基于細胞粘附性的抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法具有無損傷、實時動態(tài)檢測、信息量大，而且過程簡潔、重復性好的特點，適用于抗早期糖尿病腎病藥物的高通量篩選。


圖I為采用本發(fā)明方法篩選所得藥物黃芪甲苷減輕足細胞脫落的治療效果；
圖2為采用本發(fā)明方法篩選所得藥物黃芪甲苷降低尿白蛋白的治療效果。
具體實施例方式本發(fā)明所公開的是一種抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法，通過采用xCELLigence系統(tǒng)的技術(shù)建立基于足細胞粘附的實時動態(tài)高通量藥物篩選方法，在細胞水平初篩增加足細胞粘附的化合物，動態(tài)檢測足細胞粘附，實時觀測細胞生長、藥物效應起始時間點與最大作用時間點；而使用流式細胞儀在分子水平上對單細胞進行定量分析和分選，高速分析上萬個細胞并同時監(jiān)測細胞中的多個參數(shù)。所述xCELLigence系統(tǒng)采用羅氏與ACEA Biosciences公司聯(lián)合開發(fā)的細胞分析儀。流式細胞儀則是對細胞進行自動分析和分選的裝置，它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量，并可以根據(jù)預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。本發(fā)明所提供的基于細胞粘附性的抗早期糖尿病腎病藥物的篩選方法，操作步驟 如下
步驟1，將足細胞種植于培養(yǎng)板中，建立高糖刺激下的足細胞病理模型，將待篩選藥物加入到已種植所述足細胞的培養(yǎng)板中；
步驟2，采用xCELLigence系統(tǒng)對加入待篩選藥物的足細胞粘附性進行實時動態(tài)監(jiān)測，并設(shè)立不加任何藥物的高糖對照組和正常糖對照組；
步驟3，選出能夠增加足細胞粘附性的藥物；
步驟4，采用流式細胞儀對加入步驟3中所選出藥物的樣品細胞a j i整合素表達進行檢測；
步驟5，選出能增加a 整合素表達的藥物。下面通過具體實施例，對本發(fā)明篩選方法進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述具體實施例并不限制本發(fā)明范圍。步驟1，培養(yǎng)瓶預先經(jīng)0. lmg/ml膠原I在37°C處理I小時，足細胞生長在含IOU/ml Y-干擾素、10%胎牛血清、100U/ml青鏈霉素、lOOl^g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5%C02、33°C培養(yǎng)孵箱傳代培養(yǎng)；然后轉(zhuǎn)入37°C、5%C02培養(yǎng)孵箱分化后進行實驗。生長狀態(tài)良好的足細胞種植于經(jīng)膠原I處理的培養(yǎng)板中，然后建立高糖(30mmol/L D-葡萄糖)刺激下的足細胞病理模型，同時設(shè)立正常糖對照組(5mmol/L D-葡萄糖)及高滲對照組(25mmol/L 甘露醇 + Smmol /T, D-葡萄糖)。采用基底膜復合物(BMC)模擬人體腎小球基底膜(GBM)成分，將生長狀態(tài)良好且已分化的足細胞種植于鋪有BMC的培養(yǎng)板中。BMC是從小鼠組織中提取的一種可溶性基底膜蛋白復合物，主要成分為層粘連蛋白、IV型膠原及硫酸肝素蛋白聚糖，它與人體GBM的成分基本類似，為研究足細胞粘附功能提供了模擬人體內(nèi)的生理環(huán)境。步驟2，將liig/ml BMC鋪于96孔板在4 °C過夜，用PBS輕輕沖洗，加入各實驗組足細胞，平均細胞密度為3X IO4ceIls/孔，然后加入不同中草藥及其單體，采用xCELLigence系統(tǒng)檢測足細胞粘附，該系統(tǒng)可以每6分鐘一次實時動態(tài)監(jiān)測足細胞粘附，還可最后計算半數(shù)有效濃度(EC50)，利用該系統(tǒng)實時動態(tài)、準確高效篩選增加足細胞粘附的化合物。步驟3，篩選出能夠增加足細胞粘附性的有效成分，從而通過細胞水平進行初步篩選得到部分藥物。步驟4，將生長狀態(tài)良好的貼壁生長的足細胞用0. 25%胰酶消化，室溫，IOOOrpm離心5 min，將細胞懸浮，密度為IX 105/ml，種植于鋪有I y g/ml基底膜復合物的96孔板中，平均細胞密度為3X IO4ceIls/孔，加入步驟3中篩選出的藥物，然后分別加入含5 u g/mL一抗anti-a j i整合素的PBS100W，陰性對照孔中則加入相應同型匹配的對照抗體,37°C放置45min ;細胞用PBS輕輕沖洗3次，然后加入10 u g/mL FITC標記二抗，室溫培養(yǎng)30分鐘，標記的細胞再用PBS沖洗，最后用流式細胞儀進行分析
步驟5，最后篩選出能夠增加a i整合素表達的藥物，從而通過分子水平檢測得到符合要求的a 3 P工整合素受體激動劑。同時本發(fā)明還可以對篩選條件進行優(yōu)化，如適當?shù)募毎麛?shù)目、藥物效應起始時間點與最大作用時間點、藥物最佳作用濃度及最小毒性劑量的選擇等，均可通過實時檢測得到。篩選方法的評估為了確認篩選系統(tǒng)是否符合高通量篩選的要求，采用V因子 分析法來進行評估高通量篩選系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可靠性，其計算公式如下
權(quán)利要求
1.一種基于足細胞粘附的抗早期糖尿病腎病藥物篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，將足細胞種植于培養(yǎng)板中，建立高糖刺激下的足細胞病理模型，將待篩選藥物加入到已種植所述足細胞的培養(yǎng)板中； 步驟2，采用xCELLigence系統(tǒng)對加入待篩選藥物的足細胞粘附性進行實時動態(tài)監(jiān)測，并設(shè)立不加任何藥物的高糖對照組和正常糖對照組； 步驟3，選出能夠增加足細胞粘附性的藥物； 步驟4，采用流式細胞儀對加入步驟3中所選出藥物的足細胞a i整合素表達進行檢測； 步驟5，選出能增加a 整合素表達的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟4中所述足細胞置于96孔板中，所述樣品細胞密度為3 X IO4個/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述足細胞置于96孔板中，所述樣品細胞密度為3 X IO4個/孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述實施動態(tài)檢測為每隔6分鐘對足細胞粘附性進行檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述實施動態(tài)檢測還包括半數(shù)有效濃度的計算。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述實施動態(tài)檢測還包括藥物起效時間和/或有效劑量的檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述實時動態(tài)檢測還包括藥物最佳作用時間和/或最佳劑量的檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2所述高糖對照組中，含有甘露醇25mmol/L, D-葡萄糖 5mmol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I所述高糖刺激下的足細胞病理模型中，含有D-葡萄糖30mmol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述待篩選藥物包括天然藥物和中藥單體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于足細胞粘附的抗早期糖尿病腎病藥物篩選方法，通過采用xCELLigence系統(tǒng)在細胞水平初篩增加足細胞粘附的化合物；進一步結(jié)合流式細胞儀在分子水平上對單細胞進行定量分析和分選，進一步保證篩選的準確性。所述實時動態(tài)高通量篩選抗早期糖尿病腎病藥物的方法具有無損傷、實時動態(tài)檢測、信息量大且過程簡潔、重復性好的特點。
文檔編號C12Q1/06GK102798588SQ20111013267
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者汪年松, 桂定坤, 王筱霞, 王 鋒, 范瑛 申請人:上海市第六人民醫(yī)院