專利名稱：一種基于熵驅(qū)動(dòng)的dna雜交反應(yīng)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行單分子檢測(cè)的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單分子檢測(cè)的方法，利用溶液中DNA分子不同結(jié)構(gòu)熵的不同。在有目標(biāo)DNA鏈存在的情況下，利用熵驅(qū)動(dòng)引發(fā)延伸反應(yīng)，小的核酸分子彼此延伸，形成長(zhǎng)的雙鏈核酸分子，長(zhǎng)的核酸分子在溶液中隨機(jī)卷曲，形成一團(tuán)。利用小分子和長(zhǎng)鏈分子結(jié)構(gòu)的差異，熒光強(qiáng)度的不同，可以在顯微鏡下顯示出明顯的區(qū)別，進(jìn)而可以進(jìn)行溶液中單分子的檢測(cè)。此方法靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，不涉及到酶的放大等一系列復(fù)雜因素。不需要分離，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的均相檢測(cè)。通過(guò)核酸適體識(shí)別的轉(zhuǎn)換作用，也可以進(jìn)行蛋白或者其它分子的單分子定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
熵驅(qū)動(dòng)的DNA 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization Chain Reaction (HCR))是一種新的無(wú)需酶的參與并能將DNA信號(hào)轉(zhuǎn)換和放大的方法。該方法的基本原理為在堿基對(duì)形成的自由能的驅(qū)使下，不需要酶或者其他的輔助因素，通過(guò)目標(biāo)鏈的引發(fā)，小的單鏈DNA可以自組織聚合成為較長(zhǎng)的 DNA 結(jié)構(gòu)。Dirks 等(R. M. Dirks, N. A. Pierce, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004，101，15275)同時(shí)也提出了利用ATP適體可以特異性的結(jié)合溶液中的ATP，從而打開(kāi)引發(fā)鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后再進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其后，2007年 Zhang 等(D. Y. Zhang，A. J. Turberfield，B. Yurke，E. Winfree， Science 2007，318，1121)通過(guò)設(shè)計(jì)目標(biāo)鏈為特定的嵌入寡核苷酸序列，它作為催化劑參與反應(yīng)，釋放另一特定的寡核苷酸鏈，而這條鏈又可以作為下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的催化劑，并依次循環(huán)下去，最后目標(biāo)鏈又被釋放出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)鏈的循環(huán)放大。這也是利用熵驅(qū)動(dòng)原理來(lái)進(jìn)行DNA鏈的檢測(cè)，并最終建立了一種簡(jiǎn)單、快速的DNA檢測(cè)方法。2008年Yin課題組 (P. Yin, H. Μ. Choi, C. R. Calvert, N. A. Pierce, Nature 2008，451，318)也利用類似的方法， 對(duì)DNA進(jìn)行了檢測(cè)。近年來(lái)，利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行的分析檢測(cè)得到了較快的發(fā)展。我們也曾利用熵驅(qū)動(dòng)的DNA開(kāi)關(guān)分子進(jìn)行了單堿基突變的檢測(cè)，在目標(biāo)DNA的驅(qū)使下，通過(guò)開(kāi)關(guān)分子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單核苷酸多態(tài)性的靈敏檢測(cè)(C. Shi, C. H. Zhao, Q. J. Guo，C. P. Ma, Chem. Commun. 2011，47，2895)。熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是通過(guò)對(duì)溶液中單個(gè)分子進(jìn)行清點(diǎn)、統(tǒng)計(jì)和計(jì)數(shù)，根據(jù)溶液中檢測(cè)到的單個(gè)分子的數(shù)量來(lái)對(duì)溶液濃度進(jìn)行檢測(cè)的一種定量方法。這種方法具有靈敏度高、所需樣品量少、快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)菌、真菌等病害菌的檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)用廣泛。鄢慶枇等(鄢慶枇、鄒文政、紀(jì)榮興、莊峙廈、王小如.海洋科學(xué)2006，30，18)結(jié)合熒光抗體技術(shù)(FAT)的反應(yīng)特異性和敏感性與熒光顯微鏡的精確性相結(jié)合，對(duì)河流弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)° Jarvius 等(J. Jarvius, J. Melin, J. Goransson, J. Stenberg, S. Fredriksson, C. Gonzalez-Rey, S. Bertilsson, M. Nilssonl, Nat. Methods. 2006，3，725)利用目標(biāo)分子特異性識(shí)別引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增放大，在標(biāo)記熒光后利用熒光顯微鏡對(duì)擴(kuò)增的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)。由于擴(kuò)增后的分子其體積和熒光都遠(yuǎn)高于原有的DNA分子，利用軟件設(shè)置熒光的閾值，可以在均相溶液中對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行靈敏的檢測(cè)，得到較好的檢測(cè)效果。 2008 年，Li 等(L. Li，X. Z. Tian, G. Z. Zou，Z. K. Shi, X. L. Zhang, W. R. Jin, Anal. Chem. 2008， 80，3999)利用電化學(xué)方法將溶液中的熒光分子或熒光標(biāo)記的抗體分子和DNA分子沉積在蓋玻片的表面，利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡對(duì)單個(gè)分子成像，通過(guò)清點(diǎn)單個(gè)分子的的個(gè)數(shù)檢測(cè)溶液濃度。基于熒光顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)方式以及熵驅(qū)動(dòng)DNA雜交增長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明建立一種熵驅(qū)動(dòng)的、操作簡(jiǎn)便的熒光顯微鏡單分子檢測(cè)方法。它不需要聚合酶或者切刻酶對(duì)DNA分子的復(fù)制、切刻或置換，僅僅利用不同堿基互補(bǔ)自由能的不同，實(shí)現(xiàn)DNA鏈的互補(bǔ)、置換、增長(zhǎng)。在熒光顯微鏡下，由于聚合后鏈的體積以及熒光的亮度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原有反應(yīng)前的單鏈， 從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA鏈或其它分子的均相靈敏檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單分子檢測(cè)的新方法。本發(fā)明所提供的方法，稱為一種基于熵驅(qū)動(dòng)的DNA雜交反應(yīng)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行單分子檢測(cè)的新方法，包括以下步驟1如檢測(cè)的目標(biāo)是核酸，根據(jù)目標(biāo)鏈的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)序列的Hl鏈和H2鏈。如果是用核酸適體的特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)或者小的化合物分子。首先設(shè)計(jì)引發(fā)鏈1，1 鏈包括兩個(gè)功能部分一部分是可以和檢測(cè)目標(biāo)結(jié)合的核酸適體部分，一部分是和Hl鏈互補(bǔ)結(jié)合的部分。Hl鏈和H2鏈有互補(bǔ)部分，但在低于雜交反應(yīng)的溫度條件下，Hl鏈和H2鏈單獨(dú)混合，不會(huì)自身打開(kāi)彼此互補(bǔ)并延伸。2在有目標(biāo)核酸(T)存在的情況下，T鏈結(jié)合Hl鏈并互補(bǔ)，和T鏈互補(bǔ)后的Hl鏈
和H2鏈互補(bǔ)，H2鏈再和Hl鏈互補(bǔ)，于是形成一條序列為TH1H2 H1H2 H1H2......的長(zhǎng)鏈
(L)。3在Hl鏈和H2鏈的一端或者兩端進(jìn)行標(biāo)記，以便于熒光檢測(cè)。4利用顯微鏡，如熒光顯微鏡，熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行長(zhǎng)鏈(L)的檢測(cè)。本發(fā)明的原理如圖1所示檢測(cè)的目標(biāo)T以DNA為例。Hl與H2鏈單獨(dú)存在時(shí)，由于其有穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 因此可以穩(wěn)定存在。當(dāng)加入目標(biāo)鏈T時(shí)，T可以與Hl鏈結(jié)合，然后延伸，最后完全打開(kāi)Hl 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。被打開(kāi)的Hl鏈的成環(huán)部分又可以與H2鏈的突出末端結(jié)合從而打開(kāi)H2鏈， 而H2鏈的成環(huán)部分又可以與Hl鏈的突出末端結(jié)合打開(kāi)Hl鏈，依次循環(huán)下去，最終形成了 TH1H2H1H2......形式的DNA長(zhǎng)鏈L。由于Hl與H2鏈的末端標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM，因此最終形成的DNA長(zhǎng)鏈L在溶液中隨機(jī)卷曲，其體積可達(dá)到直徑為1_2μπι左右的小球。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，然后選擇合適的軟件對(duì)視野中的熒光信號(hào)進(jìn)行處理，對(duì)熒光DNA球統(tǒng)計(jì)、計(jì)數(shù)。根據(jù)目標(biāo)DNA的濃度與熒光DNA球個(gè)數(shù)的關(guān)系，得到線性方程，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的均相靈敏檢測(cè)。本發(fā)明一種基于熵驅(qū)動(dòng)的DNA雜交反應(yīng)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行單分子檢測(cè)的新方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1本發(fā)明首次將熵驅(qū)動(dòng)的DNA鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)與熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法聯(lián)系起來(lái)。
2本發(fā)明利用DNA鏈的增長(zhǎng)，將標(biāo)有熒光基團(tuán)的單鏈聚集起來(lái)，從而使熒光信號(hào)得到放大，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)DNA鏈擴(kuò)增的單分子檢測(cè)。3本發(fā)明反應(yīng)過(guò)程沒(méi)有酶的參與，且反應(yīng)溫度適用范圍廣，沒(méi)有嚴(yán)格的反應(yīng)緩沖液的要求，并且在復(fù)雜緩沖液中也可以快捷、方便的對(duì)目標(biāo)鏈進(jìn)行檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單易行，結(jié)果穩(wěn)定。4應(yīng)用熒光顯微鏡結(jié)合DNA的熵驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增對(duì)致病菌進(jìn)行靈敏診斷，無(wú)需用酶，操作簡(jiǎn)便?？梢钥朔鹘y(tǒng)PCR等檢測(cè)過(guò)程中對(duì)操作要求較高，培養(yǎng)檢測(cè)法時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，準(zhǔn)確性又大大高于一般鏡檢結(jié)果。因此，該方法可以用于多種分子診斷和分子檢測(cè)的快速進(jìn)行。


圖1為一種基于熵驅(qū)動(dòng)的DNA雜交反應(yīng)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行單分子檢測(cè)的新方法的原理圖。圖2為不同目標(biāo)DNA鏈⑴引發(fā)形成的核酸長(zhǎng)鏈產(chǎn)物電泳圖(其中M:2000bp DNA Marker.泳道 1-5 :T 濃度分別為0、10. 0、1. 0、0. 5、0. 1 μ M，Hl 與 Η2 的濃度為 Ι.ΟμΜ)。圖3為熒光共聚焦顯微鏡下目標(biāo)DNA鏈引發(fā)的長(zhǎng)鏈產(chǎn)物熒光檢測(cè)計(jì)數(shù)示意圖(其中Hl與Η2的濃度為0. 3 μ Μ，目標(biāo)鏈T的濃度為10 Μ)。圖4為熒光共聚焦檢測(cè)所得線性曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1 一種基于熵驅(qū)動(dòng)的DNA雜交反應(yīng)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行單分子檢測(cè)的新方法實(shí)驗(yàn)步驟一、序列設(shè)計(jì)以弧菌中的霍亂弧菌(Vibrio cholerae non-01)作為檢測(cè)的對(duì)象，從霍亂弧菌基因組中的16S rDNA中選擇能夠代表霍亂弧菌特征的DNA序列作為檢測(cè)的目標(biāo)分子(目標(biāo)鏈T)，依據(jù)此DNA序列進(jìn)行雜交鏈Hl和H2的設(shè)計(jì)。Hl和H2設(shè)計(jì)的原則為在沒(méi)有目標(biāo)鏈 T存在的情況下，Hl和H2在溶液中是穩(wěn)定存在的，不會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化和DNA鏈的雜交生長(zhǎng)；但當(dāng)目標(biāo)鏈T存在時(shí)，由于目標(biāo)鏈的引發(fā)，DNA鏈會(huì)發(fā)生T-H1-H2-H1-H2……的交替延伸與生長(zhǎng)。因此設(shè)計(jì)DNA鏈Hl和H2為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其莖(stem)為18個(gè)堿基，環(huán)(loop)為 12個(gè)堿基。Hl和H2的5'和3'突出末端作為雜交落腳點(diǎn)序列(toehold)，設(shè)計(jì)為6個(gè)堿基。利用！"he UNAFold Web krver分析工具對(duì)設(shè)計(jì)好的DNA鏈進(jìn)行退火溫度(Tm)、熵值 (AS)、自由能(AG)及鏈之間雜交情況等的評(píng)估。為了進(jìn)行熒光檢測(cè)，分別在Hl和H2的 3'和5'突出末端標(biāo)記6-羧基熒光素(6-FAM)(見(jiàn)原理圖和表1)。表1本實(shí)驗(yàn)所用的DNA序列
權(quán)利要求
1.一種基于熵驅(qū)動(dòng)的DNA雜交反應(yīng)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行單分子檢測(cè)的新方法。步驟包括(a)如檢測(cè)的目標(biāo)是核酸，根據(jù)目標(biāo)鏈的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)序列的Hl鏈和H2鏈。如果是用核酸適體的特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)或者小的化合物分子。首先設(shè)計(jì)引發(fā)鏈T，T鏈包括兩個(gè)功能部分一部分是可以和檢測(cè)目標(biāo)結(jié)合的核酸適體部分，一部分是和Hl鏈互補(bǔ)結(jié)合的部分。Hl鏈和Η2鏈有互補(bǔ)部分，但在低于雜交反應(yīng)的溫度條件下，Hl鏈和Η2鏈單獨(dú)混合，不會(huì)自身打開(kāi)彼此互補(bǔ)并延伸。(b)在有目標(biāo)核酸(T)存在的情況下，T鏈結(jié)合Hl鏈并互補(bǔ)，和T鏈互補(bǔ)后的Hl鏈和 H2鏈互補(bǔ)，H2鏈再和Hl鏈互補(bǔ)，于是形成一條序列為TH1H2 H1H2 H1H2......的長(zhǎng)鏈(L)。(c)在Hl鏈和H2鏈的一端或者兩端進(jìn)行標(biāo)記，以便于熒光檢測(cè)。(d)利用顯微鏡，如熒光顯微鏡，熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行長(zhǎng)鏈(L)的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中的Hl鏈和H2鏈，其結(jié)構(gòu)為 一小段單鏈，互補(bǔ)的雙鏈和單鏈環(huán)(loop)部分。其中一小段單鏈的序列長(zhǎng)度范圍為4-18 個(gè)堿基；單鏈環(huán)(loop)部分序列長(zhǎng)度范圍為4- 個(gè)堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)中形成的長(zhǎng)鏈(L)，無(wú)需利用酶等生物學(xué)放大手段，而是利用不同堿基互補(bǔ)自由能的不同，通過(guò)目標(biāo)鏈的引發(fā)，利用溶液中的自由能的驅(qū)動(dòng)自發(fā)形成一條雙鏈(中間有小部分單鏈)的長(zhǎng)鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用熵驅(qū)動(dòng)，通過(guò)目標(biāo)鏈的引發(fā)，形成溶液中的核酸長(zhǎng)鏈。長(zhǎng)鏈的組成部分，不限于兩種核酸，如H1鏈和H2鏈，也可以為多種(3-9 種)核酸分子彼此引發(fā)。其中一種引發(fā)形式為T引發(fā)Hl后，Hl引發(fā)Η2鏈，Η2引發(fā)Η3鏈， Η3再引發(fā)Hl鏈，形成T Hl Η2 Η3 Hl Η2 Η3 Hl Η2 Η3......的結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(c)中對(duì)Hl鏈和Η2鏈的一端或者兩端直接進(jìn)行熒光標(biāo)記，方便以后的熒光檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(c)中對(duì)Hl鏈和Η2鏈的一端或者兩端進(jìn)行化合物或者蛋白質(zhì)的標(biāo)記，方便以后和熒光物質(zhì)連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)中利用顯微鏡的手段對(duì)步驟(b) 中形成的長(zhǎng)鏈(L)進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)中利用顯微鏡的手段對(duì)步驟(b) 中形成的長(zhǎng)鏈(L)進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)時(shí)，不利用標(biāo)記的手段，而是利用熒光物質(zhì)和雙鏈核酸相互作用，如嵌插入雙鏈之間等作用，長(zhǎng)鏈(L)和Hl鏈、H2鏈熒光強(qiáng)度的不同，實(shí)現(xiàn)熒光檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)中利用顯微鏡的手段對(duì)步驟(b) 中形成的長(zhǎng)鏈(L)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，利用軟件進(jìn)行熒光閾值的判斷并進(jìn)行長(zhǎng)鏈(L)的計(jì)數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增的單分子檢測(cè)方法，利用溶液中不同結(jié)構(gòu)的寡核苷酸分子互補(bǔ)時(shí)自由能的不同，當(dāng)目標(biāo)核酸鏈存在時(shí)，小的核酸分子(雜交單體)通過(guò)互補(bǔ)延伸，形成一條長(zhǎng)的雙鏈核酸分子，長(zhǎng)的核酸分子在溶液中隨機(jī)卷曲，形成直徑為1-2μm左右的小球，實(shí)現(xiàn)引發(fā)信號(hào)從納米到微米級(jí)的轉(zhuǎn)換。如果在小核酸分子上標(biāo)記熒光，利用小核酸分子和長(zhǎng)鏈核酸分子體積和熒光的差異，可以在顯微鏡下顯示出明顯的區(qū)別。由于目標(biāo)鏈的引發(fā)和鏈的生長(zhǎng)延伸是嚴(yán)格對(duì)應(yīng)的，因此可以進(jìn)行單分子的檢測(cè)。此方法簡(jiǎn)單，不涉及到生物酶放大等復(fù)雜因素和操作程序；無(wú)需分離，靈敏度高；本發(fā)明將在基礎(chǔ)科學(xué)、臨床和診斷研究中蛋自質(zhì)和核酸的單分子定量檢測(cè)方面具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12R1/63GK102229984SQ20111013298
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者石超, 葛玉潔, 馬翠萍 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)