細(xì)胞粘附性光控制基材的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)時，可以更簡便地進(jìn)行實(shí)時操作，可以在使不要細(xì)胞從培養(yǎng)細(xì)胞除去并純化的同時進(jìn)行培養(yǎng)，此外，從培養(yǎng)細(xì)胞解析所希望的細(xì)胞，進(jìn)行區(qū)分，提高該細(xì)胞的純度、回收率、生存力。通過使用細(xì)胞粘附性光控制基材，從而可以對細(xì)胞圖像進(jìn)行檢測、解析，獲得所希望的細(xì)胞的位置信息，所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而包含香豆素基甲基骨架的光解離性基結(jié)合解離，細(xì)胞粘附性材料脫離，殘留細(xì)胞非粘附性材料。此外，基于這樣獲得的位置信息，能夠在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分。
【專利說明】細(xì)胞粘附性光控制基材
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及再生醫(yī)療、干細(xì)胞研究領(lǐng)域，特別是涉及細(xì)胞的解析區(qū)分、培養(yǎng)技術(shù)?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在再生醫(yī)療領(lǐng)域中，進(jìn)行下述操作:對體細(xì)胞中所含的極少的成體干細(xì)胞、前體細(xì)胞進(jìn)行鑒定、離析，對成體干細(xì)胞、前體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并分化誘導(dǎo)而制作體細(xì)胞。此外，嘗試將iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞分化誘導(dǎo)成成體干細(xì)胞、體細(xì)胞。然而，這些iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞不是均一的，此外，由其分化誘導(dǎo)而得的細(xì)胞也不是均一的，產(chǎn)生出各種細(xì)胞。此外，多能性干細(xì)胞往往與通常被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞共培養(yǎng)，因此有在培養(yǎng)的結(jié)果所得的產(chǎn)物中，不僅混入多能性干細(xì)胞、由其分化誘導(dǎo)出的細(xì)胞，而且混入飼養(yǎng)細(xì)胞的可能性。在供于再生醫(yī)療的細(xì)胞或組織中，要求作為體細(xì)胞的均一性，包含成體干細(xì)胞，而且不含癌細(xì)胞、癌干細(xì)胞、iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞、以及飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0003]這樣，在再生醫(yī)療領(lǐng)域中，對細(xì)胞進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)的技術(shù)的重要性日益增加。為了區(qū)分包含多個種類的細(xì)胞群，識別它們的解析技術(shù)是必要的。此外，需要由識別出的包含多個種類的細(xì)胞群區(qū)分成單一種類的細(xì)胞。只有可以區(qū)分成單一種類的細(xì)胞，才能夠解析其分子生物學(xué)的性質(zhì)、細(xì)胞生物學(xué)的性質(zhì)。此外，只有可以進(jìn)行單一種類的細(xì)胞的區(qū)分、解析，才能夠開發(fā)嚴(yán)密地控制分化誘導(dǎo)的技術(shù)。在研究開發(fā)的中途階段，只要可以除去不要的細(xì)胞，則可高純度地獲得單一種類的細(xì)胞，因此可以達(dá)到100%的分化誘導(dǎo)效率和構(gòu)建等效的實(shí)驗(yàn)體系，對于加速研究開發(fā)是極其有效的。
[0004]作為在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析的裝置，光學(xué)顯微鏡、對進(jìn)行了熒光標(biāo)識的細(xì)胞進(jìn)行觀察的熒光顯微鏡、熒光成像裝置等是周知的，但這些裝置不能區(qū)分細(xì)胞。另一方面，作為在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行區(qū)分的裝置，有通過細(xì)胞表面的抗原與對磁珠賦與的抗體的抗原抗體反應(yīng)而區(qū)分收集目的的細(xì)胞的裝置，但該裝置不能解析細(xì)胞，此外，在純度、回收率等方面存在課題。作為區(qū)分細(xì)胞的裝置，也有激光顯微切割裝置，但其主要用于從進(jìn)行了石蠟包埋的組織切片離析死細(xì)胞。
[0005]作為在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分的裝置，應(yīng)用了流式細(xì)胞光度術(shù)的原理的分選裝置是周知的。該裝置是使乘載于鞘流的樣品流中的細(xì)胞I個I個地接觸激光，通過觀察散射光、熒光來對細(xì)胞進(jìn)行解析、識別，基于該信息，使包含一個一個細(xì)胞的液滴帶電荷，施加電場而進(jìn)行區(qū)分的裝置?？梢酝ㄟ^照射多色的激光來解析多個熒光標(biāo)記，但熒光校正、光軸調(diào)整、液滴的穩(wěn)定形成、帶電荷的時機(jī)的調(diào)整復(fù)雜。為了對在培養(yǎng)基材上進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞光度術(shù)，必須暫時從培養(yǎng)基材取出細(xì)胞。此外需要將細(xì)胞預(yù)先分離成各個細(xì)胞。如果為此而進(jìn)行胰蛋白酶處理等，則會對細(xì)胞帶來不小破壞。此外由于通過胰蛋白酶處理來分解細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，因此可能會在解析細(xì)胞表面抗原之后帶來障礙。進(jìn)一步存在分選出的細(xì)胞由于分選時的沖擊而生存力降低等課題。
[0006]作為在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)的技術(shù)，有專利文獻(xiàn)I所記載的方法(以下第I現(xiàn)有例)。該技術(shù)涉及使用將通過光照射而其物性變化的光響應(yīng)性材料成膜而成的細(xì)胞培養(yǎng)基材，在細(xì)胞粘附性表面粘附細(xì)胞。通過監(jiān)測器識別進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞，特定所希望的細(xì)胞的位置，對所希望的細(xì)胞位置進(jìn)行光圖案照射，用于將所希望的細(xì)胞從培養(yǎng)基材剝離的裝置。這里記載的“通過光照射而其物性變化的光響應(yīng)性材料”，可舉出具有通過光照射而結(jié)構(gòu)異構(gòu)化，其極化率、親水一疏水性變化，從而將細(xì)胞從培養(yǎng)基材剝離的功能的材料，特別優(yōu)選這些物性變化是可逆的。
[0007]作為在細(xì)胞培養(yǎng)下能夠進(jìn)行細(xì)胞粘附圖案的形成和尺寸變更的、將細(xì)胞固定化了的基板的制成方法，有專利文獻(xiàn)5所記載的方法(以下第2現(xiàn)有例)。該技術(shù)的第I形態(tài)是，將通過光分解性保護(hù)基而保護(hù)了末端官能團(tuán)的化合物在基板上固定化，通過光照射將光分解性保護(hù)基的一部分脫離而使末端官能團(tuán)露出，使細(xì)胞吸附于露出的末端官能團(tuán)。第2形態(tài)與第I形態(tài)類似，但使細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)吸附于光解離性保護(hù)基，通過光照射將細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)吸附了的光分解性保護(hù)基的一部分脫離而使末端官能團(tuán)露出，使細(xì)胞吸附于露出的末端官能團(tuán)。第3形態(tài)與第2形態(tài)類似，但使細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)吸附于露出的末端官能團(tuán)，使細(xì)胞吸附于細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)。
[0008]第2現(xiàn)有例中的通過光分解性保護(hù)基而保護(hù)了末端官能團(tuán)的化合物是，通過光照射而光分解性保護(hù)基脫離，末端官能團(tuán)露出的化合物。光分解性保護(hù)基被認(rèn)為是細(xì)胞不吸附、或細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)不吸附的保護(hù)基，作為那樣的保護(hù)基的例子，言及了親水性高的保護(hù)基、具有帶有氫結(jié)合受體的基團(tuán)的中性化合物。作為細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)的具體例，例示了血清白蛋白等。末端官能團(tuán)被認(rèn)為是易于吸附細(xì)胞的官能團(tuán)，作為具體例，例示了羧基、氨基等帶電了的官能團(tuán)。作為細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)的具體例，例示了纖連蛋白等。
[0009]第2現(xiàn)有例中的任一形態(tài)，都為了在固定于基板上的化合物上粘附細(xì)胞而需要2~3小時左右的時間。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)
[0012]專利文獻(xiàn)1:日本專利第3975266號公報
[0013]專利文獻(xiàn)2:日本專利第3472723號公報
[0014]專利文獻(xiàn)3:日本特開2004 - 170930號公報
[0015]專利文獻(xiàn)4:日本特開2008 - 167695號公報
[0016]專利文獻(xiàn)5:日本特開2006 - 6214號公報
[0017]非專利文獻(xiàn)
[0018]非專利文獻(xiàn)1:石原一彥，生體材料，18 (I)、33 (2000).[0019]非專利文獻(xiàn)2:Y.Arima et al., J.Meter.Chem.，17，4079 (2007).[0020]非專利文獻(xiàn)3:Y.Arima et al., Biomaterials28, 3074 (2007).[0021]非專利文獻(xiàn)4:Μ.N.Yousaf et al.，PNAS98 (11)、5992 (2001).[0022]非專利文獻(xiàn)5:古田壽昭，光學(xué)，34 (4)、213 (2005).[0023]非專利文獻(xiàn)6:J.Eahiro et al., Biomacromolecules, 6 (2) >970 (2005).[0024]非專利文獻(xiàn)7:J.Nakanishi et al., Analytical Sciences, 24,67 (2008).
【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]發(fā)明所要解決的課題[0026]作為上述的第I現(xiàn)有例(日本專利第3975266號公報)所記載的通過光照射而其物性變化的光響應(yīng)性材料，通過光而可逆地結(jié)構(gòu)變化的材料難以100%保持為2個異構(gòu)體中的一個，這導(dǎo)致細(xì)胞粘附性的選擇性降低。此外，實(shí)施例中那樣的通過長波長的光而反應(yīng)的材料，例如，進(jìn)行熒光觀察時與激發(fā)光反應(yīng)，粘附性變化，因此不能兼有熒光觀察和粘附性維持。此外，該技術(shù)中，未考慮到即使可以將細(xì)胞從培養(yǎng)基材剝離，也會剝離細(xì)胞間的粘附。因此，存在將培養(yǎng)基材中存在的孤立的細(xì)胞或細(xì)胞塊整個剝離，而不能將粘附的包含多個種類的細(xì)胞的細(xì)胞塊區(qū)分成單一細(xì)胞這樣的課題。
[0027]此外第I現(xiàn)有例的說明書中，用于使細(xì)胞粘附于材料的具體條件沒有記載。此外在實(shí)施例中使細(xì)胞粘附于材料的實(shí)驗(yàn)本身沒有記載。即該技術(shù)中并未考慮與細(xì)胞粘附有關(guān)的具體情況。
[0028]上述的第2現(xiàn)有例(日本特開2006 — 6214號公報)，在第I形態(tài)中，光分解性保護(hù)基完全不吸附細(xì)胞，需要其脫離而露出的末端官能團(tuán)極其良好地吸附細(xì)胞。細(xì)胞粘附性象那樣地顯示戲劇性變化的光分解性保護(hù)基是未知的，實(shí)際上，并未記載與該第I形態(tài)對應(yīng)的實(shí)施例。因此存在實(shí)施該第I形態(tài)是困難的這樣的課題。第2形態(tài)中需要使細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)吸附于光解離性保護(hù)基的工序。此外需要細(xì)胞極其良好地吸附于光分解性保護(hù)基脫離而露出的末端官能團(tuán)。細(xì)胞粘附性象那樣地極其高的末端官能團(tuán)是未知的，實(shí)際上，也并未記載與該第2形態(tài)對應(yīng)的實(shí)施例。因此存在該第2形態(tài)的工序非常復(fù)雜，實(shí)施也困難這樣的課題。第3形態(tài)中，需要使細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)吸附于光解離性保護(hù)基的工序和使細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)吸附于露出的末端官能團(tuán)的工序。此外細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)由于是僅吸附于光解離性保護(hù)基的不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此在使細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)吸附時，有根據(jù)條件而吸附于光解離性保護(hù)基的細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)脫附，發(fā)生置換成細(xì)胞粘附促進(jìn)物質(zhì)這樣的目的外的副反應(yīng)的可能性。如果發(fā)生該副反應(yīng)，則目的外的區(qū)域變化為細(xì)胞粘附性區(qū)域，細(xì)胞粘附的選擇性可能會降低。因此存在該第3形態(tài)的工序非常復(fù)雜，根據(jù)條件而細(xì)胞粘附的選擇性低這樣的課題。此外在任一形態(tài)中，都會為了在固定于基板上的化合物上粘附細(xì)胞而花費(fèi)2~3小時左右的時間。一般而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為為了使細(xì)胞粘附于基材而需要該程度的時間。然而在為了解析而對細(xì)胞區(qū)分、離析的用途中，需要迅速簡便地進(jìn)行不過是工序的一部分的細(xì)胞粘附，不能容許花費(fèi)2~3小時。換言之，存在現(xiàn)有例的細(xì)胞粘附時間過長這樣的課題。
[0029]本發(fā)明是鑒于以上的現(xiàn)有技術(shù)，而提供用于在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)的細(xì)胞粘附性光控制基材。
[0030]本發(fā)明所要解決的課題是，在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)時，可以更簡便地進(jìn)行實(shí)時操作，可以在從培養(yǎng)細(xì)胞除去不要細(xì)胞并純化的同時進(jìn)行培養(yǎng)，此外，從培養(yǎng)細(xì)胞解析區(qū)分所希望的細(xì)胞，將該細(xì)胞的純度、回收率、生存力提高到以往以上。
[0031]此外本發(fā)明所要解決的第2課題是，在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)時，確實(shí)并且短時間地進(jìn)行細(xì)胞粘附。
[0032]用于解決課題的方法
[0033]本發(fā)明中為了解決上述以往技術(shù)的課題而采取以下的方法。
[0034]即，本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材是將細(xì)胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，所述細(xì)胞粘附性光控制材料是從基材側(cè)順次地在細(xì)胞非粘附性材料上介由光解離性基而結(jié)合細(xì)胞粘附性材料而成的。
[0035]此外，本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，細(xì)胞粘附性材料脫離，殘留細(xì)胞非粘附性材料。
[0036]此外，本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，被照射后的部分的表面從細(xì)胞粘附性材料向細(xì)胞非粘附性材料不可逆地變化。
[0037]此外，本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材，是將細(xì)胞結(jié)合性光控制材料在基材上成膜而成的，所述細(xì)胞結(jié)合性光控制材料是從基材側(cè)順次地在細(xì)胞非粘附性材料上介由光解離性基而結(jié)合細(xì)胞結(jié)合性材料而成的。這里所謂細(xì)胞結(jié)合性材料，是通過共價結(jié)合等而與細(xì)胞牢固地結(jié)合的材料，或?qū)游锓N特異性的抗體。
[0038]此外，使用了本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材的細(xì)胞的解析區(qū)分方法包含以下的工序。
[0039]對細(xì)胞粘附性光控制基材接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)的工序，所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，是將細(xì)胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，所述細(xì)胞粘附性光控制材料是從基材側(cè)順次地在細(xì)胞非粘附性材料上介由光解離性基而結(jié)合細(xì)胞粘附性材料或細(xì)胞結(jié)合性材料而成的，或者所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，細(xì)胞粘附性材料脫離，殘留細(xì)胞非粘附性材料，或者所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，被照射后的部分的表面從細(xì)胞粘附性材料向細(xì)胞非粘附性材料不可逆地變化。
[0040]通過對所希望的細(xì)胞區(qū)域的第I光照射而將所希望的細(xì)胞從基材剝離回收的工序。
[0041]此外，使用了本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材的細(xì)胞的解析區(qū)分方法包含以下的工序。
[0042]對細(xì)胞粘附性光控制基材進(jìn)行第I光照射，而設(shè)置細(xì)胞粘附區(qū)域和細(xì)胞非粘附區(qū)域的工序，所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，是使介由光解離性基而從基材側(cè)順次在細(xì)胞非粘附性材料上結(jié)合有細(xì)胞粘附性材料或細(xì)胞結(jié)合性材料的細(xì)胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，或者所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，細(xì)胞粘附性材料脫離，殘留細(xì)胞非粘附性材料，或者所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，被照射后的部分的表面從細(xì)胞粘附性材料向細(xì)胞非粘附性材料不可逆地變化。
[0043]此外，使用了本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材的細(xì)胞的解析區(qū)分方法包含以下的工序。
[0044]在上述解析區(qū)分方法的工序中，在細(xì)胞粘附性光控制基材上接種細(xì)胞后，在細(xì)胞粘附性光控制基材的方向，特別優(yōu)選為相對于該基材表面垂直地使離心力作用的工序。
[0045]此外，使用了本發(fā)明的細(xì)胞粘附性光控制基材的細(xì)胞的解析區(qū)分裝置具備第I光照射單元，所述第I光照射單元用于使細(xì)胞粘附性光控制基材與基材上的細(xì)胞粘附性光控制材料進(jìn)行光反應(yīng)，所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，是將細(xì)胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，所述細(xì)胞粘附性光控制材料是從基材側(cè)順次地在細(xì)胞非粘附性材料上介由光解離性基而結(jié)合細(xì)胞粘附性材料或結(jié)合細(xì)胞結(jié)合性材料而成的，或者，所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，細(xì)胞粘附性材料脫離，殘留細(xì)胞非粘附性材料，或者，所述細(xì)胞粘附性光控制基材的特征在于，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，被照射后的部分的表面從細(xì)胞粘附性材料向細(xì)胞非粘附性材料不可逆地變化。
[0046]本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請2011 — 087647號的說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0047]發(fā)明的效果
[0048]在活細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行解析、區(qū)分、培養(yǎng)時，可以更簡便地進(jìn)行實(shí)時操作，可以在從培養(yǎng)細(xì)胞除去不要細(xì)胞并進(jìn)行純化的同時進(jìn)行培養(yǎng)。此外，可以從培養(yǎng)細(xì)胞解析區(qū)分所希望的細(xì)胞，提高該細(xì)胞的純度、回收率、生存力。此外可以更確實(shí)并且短時間地進(jìn)行解析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1是顯示對培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行解析，區(qū)分所希望的細(xì)胞的方法(實(shí)施例1、2)的概要的圖。
[0050]圖2是顯示對各個分離出的細(xì)胞進(jìn)行解析，區(qū)分所希望的細(xì)胞的方法(實(shí)施例3、
5、6、7)的概要的圖。
[0051]圖3是顯示對各個分離出的細(xì)胞進(jìn)行解析，區(qū)分所希望的細(xì)胞的方法(實(shí)施例4)的概要的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052]以下，顯示用于實(shí)施本發(fā)明的方式，但本發(fā)明不限定于此。
[0053]本發(fā)明的一實(shí)施方式是，將細(xì)胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的細(xì)胞粘附性光控制基材，所述細(xì)胞粘附性光控制材料是從基材側(cè)順次地在細(xì)胞非粘附性材料上介由光解離性基而結(jié)合細(xì)胞粘附性材料而成的。該細(xì)胞粘附性光控制材料，通過光照射而光解離性基結(jié)合解離，可以使細(xì)胞粘附性材料從基材脫離。光結(jié)合解離可以是細(xì)胞非粘附性材料與光解離性基之間或光解離性基與細(xì)胞粘附性材料之間的任一種。通過光照射，在基材上殘留細(xì)胞非粘附性材料。光反應(yīng)了的光解離性基的殘余部分作為細(xì)胞非粘附性基而起作用。通過該不可逆的光解離反應(yīng)而從細(xì)胞粘附性向細(xì)胞非粘附性高效率地并且確實(shí)地變化，可以使粘附選擇性良好。這里，細(xì)胞粘附性材料也包含通過共價結(jié)合等而與細(xì)胞牢固地結(jié)合的材料、或包含對動物種特異性的抗體等的細(xì)胞結(jié)合性材料。在本發(fā)明中，在稱為細(xì)胞粘附性材料的情況下，既包含通過共價結(jié)合等而與細(xì)胞牢固地結(jié)合的材料，也包含與抗體等細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞結(jié)合性材料。
[0054]通過使用上述的細(xì)胞粘附性光控制基材，可以進(jìn)行特定的細(xì)胞的解析區(qū)分。這里，所謂解析區(qū)分，是指對細(xì)胞進(jìn)行解析，與其它細(xì)胞區(qū)分。
[0055]作為細(xì)胞非粘附性材料，可舉出具有與細(xì)胞膜類似的結(jié)構(gòu)，具有具生物適應(yīng)性的磷酸膽堿基的材料。細(xì)胞非粘附性材料是，例如，下述通式(I)所示的具有磷酸膽堿基的(甲基)丙烯酸酯聚合物。
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，通過光照射而包含香豆素基甲基骨架的光解離性基結(jié)合解離，細(xì)胞粘附性材料脫離，細(xì)胞非粘附性材料殘留在基材上。
2.一種細(xì)胞粘附性光控制基材，是將細(xì)胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，所述細(xì)胞粘附性光控制材料是從基材側(cè)順次地在細(xì)胞非粘附性材料上介由包含香豆素基甲基骨架的光解離性基而結(jié)合細(xì)胞粘附性材料而成的。
3.一種細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，通過光照射而包含香豆素基甲基骨架的光解離性基結(jié)合解離，被照射后的部分的表面從細(xì)胞粘附性材料向細(xì)胞非粘附性材料不可逆地變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述光解離性基包含下述通式(5)所示的2價的香豆素基甲基骨架，
5.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料包含將通式(4)所示的細(xì)胞粘附性基與通式(5)所示的光解離性基在苯骨架的R6的位置或R7的位置、或香豆素基甲基的R9的位置直接或間接地結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)， -X(4) 式中，X表示選自由羧酸、單或多羧酸烷基、氨基、單或多氨基烷基、酰胺基、單或多酰胺烷基、酰肼基、單或多酰肼基烷基、氨基酸基、多肽基和核酸基所組成的組中的基團(tuán)，
6.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料包含下述通式(6)所示的光解離性基與細(xì)胞粘附性基在苯骨架上介由二價的連接基Rltl結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)、或下述通式(7)所示的光解離性基與細(xì)胞粘附性基在苯骨架上介由二價的連接基R11結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)、或下述通式(8)所示的光解離性基與細(xì)胞粘附性基在香豆素基甲基的位置介由二價的連接基R12結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)中的任一種，
7.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料包含下述通式(9)所示的光解離性基與細(xì)胞粘附性基在香豆素基甲基骨架的R4的位置介由二價的連接基R13結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)，.......R7 這里，式中X表示選自由羧酸、單或多羧酸烷基、氨基、單或多氨基烷基、酰胺基、單或多酰胺烷基、酰肼基、單或多酰肼基烷基、氨基酸基、多肽基和核酸基所組成的組中的基團(tuán)；R4 為 2 價且表示選自由 O、CO、CO2、0C0、OCO2、0C0NH、0C0NR、NHCO2、NH、SO3 和(0Ρ0 (OH) ι ~30P02所組成的組中的基團(tuán)；R5表不選自由氧、齒基和烷氧基所組成的組中的基團(tuán)；R6表不選自由氫、羥基、烷氧基和二烷基氨基所組成的組中的基團(tuán)，或不存在；R7表示氫或鹵基，或不存在；R8表示氫或鹵基；R9表示氫，或不存在；2價的連接基R13表示(CH2CH2O)m(CH2)m，、或(CH2)m(C2HN3) (CH2)m,的基團(tuán)，m、m’ 為 O ~20 的整數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料包含:將通式(4)所示的細(xì)胞粘附性基與通式(5)所示的光解離性基在苯骨架的R6或R7的位置或香豆素基甲基位的R9的位置、或在R4的位置直接或間接地結(jié)合而成的所述結(jié)構(gòu)，直接或間接地與所述細(xì)胞非粘附性材料結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)，
9.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材 料包含下述通式(10)、(11)或(12)的任一通式所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物結(jié)構(gòu)，
10.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料包含下述通式(13)、(14)和(15)所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物結(jié)構(gòu)，
11.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料包含下述通式⑴或⑵和(10);下述通式⑴或⑵和(11);下述通式(I)或(2)和(12);下述通式(I)或(2)和(13);下述通式(I)或(2)和(14);下述通式⑴或(2)和(15);下述通式(I)、(10)和(2);下述通式(I)、(11)和(2);下述通式(I)、(12)和(2);下述通式(I)、(13)和(2);下述通式(I)、(14)和(2);下述通式(I)、(15)和(2)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物中的任一種，
12.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料是將側(cè)鏈包含烷氧基硅烷的(甲基)丙烯酸酯共聚而成的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，對于所述細(xì)胞粘附性光控制材料，在將下述通式(16)、(17)或(18)所示的烷氧基硅烷在基材上成膜后，通過與下述通式(57)所示的包含細(xì)胞粘附性基X的疊氮基化合物的反應(yīng)，在末端形成細(xì)胞粘附性基X，.R+ ^SiiOR3),
14.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性光控制材料為下述通式(24)、(25)、(26)、或(27)所示的烷氧基硅烷，
15.一種所述細(xì)胞粘附性光控制材料的中間體材料，其以下述通式(22)和(23)表示，并用于權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，
16.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性材料是，使促進(jìn)與細(xì)胞的粘附的細(xì)胞外基質(zhì)、或與細(xì)胞的表面抗原結(jié)合的抗體、或用于使該抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合或粘附于所述細(xì)胞粘附性基而得的材料。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞外基質(zhì)為選自由膠原類；包含纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、馮維勒布蘭德氏因子、骨橋蛋白和血纖蛋白原的非膠原性糖蛋白類；彈性蛋白類；蛋白聚糖類所組成的組中的材料。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，所述使抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)為選自由抗生物素蛋白/生物素、蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G所組成的組中的材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述基材為玻璃制培養(yǎng)容器。
20.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述細(xì)胞粘附性材料包含下述通式(4)所示的細(xì)胞粘附性基，式中X包含共價官能團(tuán)，該共價官能團(tuán)為具有進(jìn)行共價結(jié)合反應(yīng)的特性的官能團(tuán)， -X⑷。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述共價官能團(tuán)為具有相對于氨基、羥基、醛基或酮基進(jìn)行共價結(jié)合反應(yīng)的特性的官能團(tuán)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述共價官能團(tuán)為下述官能團(tuán)，所述官能團(tuán)包含羧酸的活性酯基；活化了的羧酸；變形大的三元環(huán)官能團(tuán)；與羥基反應(yīng)的官能團(tuán)；或與醛基、酮基反應(yīng)的官能團(tuán)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，羧酸的活性酯基包含N —羥基琥珀酰亞胺酯和N —羥基磺基琥珀酰亞胺酯；活化了的羧酸包含羧酸鹵化物、羧酸酐和羧酸疊氮基；變形大的三元環(huán)官能團(tuán)包含環(huán)氧化物基、氮丙啶基、吖丙啶?基和環(huán)锍儀基;與羥基進(jìn)行反應(yīng)的官能團(tuán)包含對甲苯磺?；?；與醛基、酮基進(jìn)行反應(yīng)的官能團(tuán)包含1，3 —二醇、肼和羥基胺醚。
24.根據(jù)權(quán)利要求20~23的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述共價官能團(tuán)為具有相對于作為細(xì)胞表面所存在的化合物的構(gòu)成要素的細(xì)胞表面官能團(tuán)進(jìn)行共價結(jié)合反應(yīng)的特性的官能團(tuán)。
25.根據(jù)權(quán)利要求20~23的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述共價官能團(tuán)為相對于細(xì)胞外基質(zhì)、與細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體或用于使抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價結(jié)合反應(yīng)的特性的官能團(tuán) 。
26.根據(jù)權(quán)利要求16或25所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述抗體是針對包含主要組織相容性基因復(fù)合體(MHC)、人白血球型抗原(HLA)、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、ρ24 (⑶9)的細(xì)胞表面抗原的抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述抗體是針對包含作為人MHC類Ia分子的HLA-A、B、C分子、小鼠H-雙分子或CD9分子的動物種特異性的細(xì)胞表面抗原的抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的細(xì)胞粘附性光控制基材，其特征在于，所述抗體為克隆W6/32、克隆Β9.12.1、克隆ΜΖ3、克隆Μ1/42或克隆hrk29的抗體。
29.一種動物種特異性的細(xì)胞粘附性基材，在將細(xì)胞粘附性材料與基材結(jié)合而成的細(xì)胞粘附性基材中，作為所述細(xì)胞粘附性材料，使用針對包含作為人MHC類Ia分子的HLA-A、B、C分子、小鼠H-雙分子、CD9分子的動物種特異性的細(xì)胞表面抗原的抗體。
30.一種細(xì)胞粘附裝置，其特征在于，在權(quán)利要求1~14、16~29的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材中，通過具備將所述任一基材固定于旋轉(zhuǎn)體的構(gòu)件，旋轉(zhuǎn)所述旋轉(zhuǎn)體，從而具有在相對于所述任一基材的面大致垂直的方向使離心力作用的功能，并具有通過所述離心力而在所述任一基材的面上使細(xì)胞沉降并且或壓接的功能。
31.一種細(xì)胞粘附方法，其特征在于，在權(quán)利要求1~14、16~29的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材中，通過在相對于所述任一基材的面為大致垂直的方向使離心力作用，在所述任一基材的面上使細(xì)胞沉降并且或壓接。
32.一種細(xì)胞處置方法，其特征在于，在使用權(quán)利要求1~29的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞粘附性光控制基材對細(xì)胞進(jìn)行處置的工序中，作為緩沖液，使用不含氨基的緩沖液，特別優(yōu)選使用不含氨基并且包含Ca2+、M g2+的HBSS⑴。
【文檔編號】C12N1/02GK103502425SQ201280017709
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月11日
【發(fā)明者】古田壽昭, 鈴木商信, 杉山壽, 小澤理, 多田博子 申請人:學(xué)校法人東邦大學(xué), 株式會社日立高新技術(shù)