用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的設(shè)備和方法
【專利摘要】包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，該方法包括使用切向流過(guò)濾系統(tǒng)從增殖培養(yǎng)基中濃縮細(xì)胞的步驟。將濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基混合，形成細(xì)胞包囊混合物。對(duì)細(xì)胞包囊混合物進(jìn)行聚合、膠凝或交聯(lián)，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
【專利說(shuō)明】用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的設(shè)備和方法
[0001]領(lǐng)域
[0002]本專利文件涉及用于包囊在包囊培養(yǎng)基如聚合物基質(zhì)中的細(xì)胞的設(shè)備和方法。
[0003]背景
[0004]盡管已知可以將細(xì)胞包囊在聚合物基質(zhì)中，但是幾乎不了解試圖以工業(yè)化水平生產(chǎn)包囊細(xì)胞。任何方法的按比例放大通常呈現(xiàn)大量障礙且包囊細(xì)胞的縮放生產(chǎn)是不同的。盡管燒杯和離心機(jī)足以在實(shí)驗(yàn)室中生成少量俘獲的細(xì)胞，但是實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和設(shè)備不能按比例放大以有效地生產(chǎn)大量用于大規(guī)模工業(yè)化生物反應(yīng)器的包囊細(xì)胞。
[0005]盡管通過(guò)使用包囊的細(xì)胞獲得的優(yōu)點(diǎn)，但是尚無(wú)為大規(guī)模生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物設(shè)計(jì)的設(shè)備或方法。例如，有益的是能夠生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物以提供20，000L (或75, OOOgal.)規(guī)模反應(yīng)器或一系列這種反應(yīng)器。
[0006] Nagashima 等人在 1984 年出版的 Biotechnology 和 Bioengineering 第 26 卷第 992-997 頁(yè)上的 Continuous Ethanol Fermentation UsingTmmobi lized Yeast Cells中描述了將酵母包囊在藻酸鈣中的生產(chǎn)方法，但僅是提供相對(duì)少量(1000L)的研究反應(yīng)器。在其描述中，制備包囊在藻酸鈣珠中的酵母“通過(guò)將來(lái)自頂部噴嘴的包含活酵母細(xì)胞的藻酸鈉溶液滴噴淋入反應(yīng)器中的氯化鈣溶液中來(lái)進(jìn)行。制備細(xì)胞珠在幾小時(shí)內(nèi)完成?！盢agashima等人描述的設(shè)備和方法不適合于生產(chǎn)較大量的珠。
[0007]類似地,用于任何大小的珠生產(chǎn)的商購(gòu)系統(tǒng)有限。LentiKat的Biotechnologies宣傳了用于珠生產(chǎn)的商購(gòu)系統(tǒng)，然而，LentiKat的系統(tǒng)僅提供了適合于小型實(shí)驗(yàn)的小規(guī)模的生產(chǎn)，而無(wú)法用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008]此外，用于將細(xì)胞包囊在聚合物基質(zhì)中的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的許多方法因其用于細(xì)胞的包囊化的產(chǎn)物消耗而在大規(guī)模情況下不切實(shí)可行。包囊培養(yǎng)基和其他輔助材料的無(wú)效利用在小規(guī)模進(jìn)行時(shí)并不令人擔(dān)憂。然而，這種資源的無(wú)效利用在按比例放大規(guī)模時(shí)極其昂貴。為此，需要可以有效地生產(chǎn)包囊的細(xì)胞的方法和設(shè)備。此外，需要可以按比例放大且有效地生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的方法和設(shè)備。
[0009]發(fā)明概述
[0010]鑒于上述描述，本專利文件的一個(gè)方面的目的在于提供用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的改進(jìn)的設(shè)備和方法。該設(shè)備和方法可以用于以大規(guī)?；蛐∫?guī)模生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述設(shè)備和方法解決或至少改善了一種或多種上述問題。為此，提供了用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的方法。該方法包括下列步驟:使用切向流過(guò)濾系統(tǒng)從增殖培養(yǎng)基中濃縮細(xì)胞；混合濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物；和聚合細(xì)胞包囊混合物，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
[0011]在本文所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞濃縮在切向流過(guò)濾系統(tǒng)的截留物中。在將細(xì)胞濃縮在切向流過(guò)濾系統(tǒng)的截留物中的實(shí)施方案中，部分截留物可以用作隨后生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的接種物。在包括應(yīng)用截留物的實(shí)施方案中，可以使截留物在截留物貯存容器與切向流過(guò)濾系統(tǒng)之間循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，可以使截留物連續(xù)循環(huán)直至截留物達(dá)到大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升的細(xì)胞濃度為止。[0012]在其他實(shí)施方案中，使用有助于保護(hù)細(xì)胞存活力的裝置進(jìn)行混合步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用往復(fù)震動(dòng)器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用往復(fù)盤。
[0013]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)方法。該方法包括:使用切向流過(guò)濾系統(tǒng)從增殖培養(yǎng)基中濃縮細(xì)胞，其中將細(xì)胞濃縮在截留物中；并且使截留物通過(guò)切向流過(guò)濾系統(tǒng)循環(huán)直到期望的細(xì)胞濃度為止；混合濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物；和聚合細(xì)胞包囊混合物，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
[0014]在一些實(shí)施方案中，可以將來(lái)自增殖培養(yǎng)基的細(xì)胞用作隨后生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的接種物。在一些實(shí)施方案中，使截留物在截留物貯存容器與切向流過(guò)濾系統(tǒng)之間循環(huán)。在特定的實(shí)施方案中，使截留物通過(guò)切向流過(guò)濾系統(tǒng)循環(huán)直到大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升的細(xì)胞濃度為止。
[0015]在本文所述的實(shí)施方案中，可以在所述方法過(guò)程中添加大量物質(zhì)，包括:營(yíng)養(yǎng)物、微生物和抗生素等。在一些實(shí)施方案中，這些物質(zhì)如營(yíng)養(yǎng)物可以通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器添加。
[0016]在生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含:生物反應(yīng)器；與所述生物反應(yīng)器互通的細(xì)胞濃縮裝置；和可操作地安排以將來(lái)自細(xì)胞濃縮裝置的細(xì)胞懸液與包囊培養(yǎng)基混合的往復(fù)震動(dòng)器。在一些實(shí)施方案中，這種系統(tǒng)的濃縮裝置可以是切向流過(guò)濾系統(tǒng)。在該系統(tǒng)的其他實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器是恒化生物反應(yīng)器。
[0017]在另一個(gè)方面中，提供了包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)方法的實(shí)施方案。該方法包括:使細(xì)胞在一次性容器中增殖，形成第一批細(xì)胞；從第一批細(xì)胞中濃縮細(xì)胞；混合濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物；聚合細(xì)胞包囊混合物，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物；和使用來(lái)自第一批細(xì)胞的細(xì)胞作為接種物在一次性容器中使細(xì)胞增殖，形成第二批細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在2 — 10批細(xì)胞之間再利用一次性容器。在其他實(shí)施方案中，在2 — 4批細(xì)胞之間再利用一次性容器。在一些實(shí)施方案中，一次性容器可以是一次性袋。在那些實(shí)施方案的一些中，一次性袋可以由塑料聚合物制成。
[0018]在并入一次性容器的系統(tǒng)中，一次性容器可以適合于使批量細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)可以包括用于混合批量細(xì)胞的裝置和用于混合濃縮的批量細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基的裝置。
[0019]在另一個(gè)方面中，提供了用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含:生物反應(yīng)器；與所述生物反應(yīng)器互通的切向流過(guò)濾系統(tǒng)；和與切向流過(guò)濾系統(tǒng)互通的截留物貯存容器。
[0020]在該系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)還包括可操作地安排以將來(lái)自截留物貯存容器的細(xì)胞懸液與包囊培養(yǎng)基混合的往復(fù)震動(dòng)器。
[0021]在該系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器是恒化生物反應(yīng)器。恒化生物反應(yīng)器是一類允許該系統(tǒng)的實(shí)施方案連續(xù)操作的生物反應(yīng)器。
[0022]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)方法。該方法包括下列步驟:從增殖培養(yǎng)基中濃縮細(xì)胞；使用往復(fù)震動(dòng)器混合濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物；和聚合細(xì)胞包囊混合物，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
[0023]在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞濃縮至大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包囊培養(yǎng)基具有約1000 - 3500厘沲(cSt.)或更優(yōu)選2000 — 3000厘沲(cSt.)的粘度。在又一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞包囊混合物具有約1000 - 3500cSt.或更優(yōu)選1500 —2500cSt的粘度。[0024]在另一個(gè)方面中，提供了包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的批量生產(chǎn)方法。該方法包括下列步驟:使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖，形成第一批細(xì)胞；從第一批細(xì)胞中濃縮細(xì)胞；混合濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物；聚合細(xì)胞包囊混合物，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物；和使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖，使用來(lái)自第一批細(xì)胞的細(xì)胞作為接種物形成第二批細(xì)胞。
[0025]在又一個(gè)實(shí)施方案中，在使第一批細(xì)胞增殖與使第二批細(xì)胞增殖之間不對(duì)所述生物反應(yīng)器滅菌。
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，用切向流過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮步驟，并且將細(xì)胞濃縮在截留物中。在包括切向流過(guò)濾系統(tǒng)的實(shí)施方案中，部分截留物可以用作接種物。在其他實(shí)施方案中，使截留物在截留物貯存容器與切向流過(guò)濾系統(tǒng)之間循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，將循環(huán)步驟進(jìn)行至截留物達(dá)到大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升的細(xì)胞濃度為止。
[0027]在又一個(gè)實(shí)施方案中，接種物包含約5% - 10%體積的第一批細(xì)胞。
[0028]在另一個(gè)方面中，提供了包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)方法。該方法包括下列步驟:混合水溶液與濃縮的包囊培養(yǎng)基，形成包囊培養(yǎng)基，其中混合在不添加足以對(duì)包囊培養(yǎng)基滅菌的熱的情況下進(jìn)行；在不加熱的情況下混合細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物；和聚合細(xì)胞包囊混合物，以生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，向水溶液中加入滅菌劑。然后將濃縮的包囊培養(yǎng)基經(jīng)由水溶液當(dāng)兩者混合在一起時(shí)滅菌。在那些實(shí)施方案的一些中，滅菌劑是次氯酸鈉。
[0030]在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)包含不同的另外的添加劑改變所述方法。例如，一些實(shí)施方案包括將抗生素添加到包囊培養(yǎng)基中的附加步驟。在其他實(shí)施方案中，將營(yíng)養(yǎng)物加入到包囊培養(yǎng)基中。在其他實(shí)施方案中，將維生素加入到包囊培養(yǎng)基中。
[0031]在又一個(gè)實(shí)施方 案中，進(jìn)行照射濃縮的包囊培養(yǎng)基的附加步驟。代替照射濃縮的包囊培養(yǎng)基或除此之外，可以照射包囊培養(yǎng)基。
[0032]在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃縮的包囊培養(yǎng)基包含藻酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中濃縮的包囊培養(yǎng)基包含藻酸鈉，將藻酸鈉與水溶液混合，產(chǎn)生具有約1000 - 3500厘沲或更優(yōu)選2000-3000厘沲的粘度的包囊培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包囊培養(yǎng)基具有3.0%或更低重量/體積，優(yōu)選2.5%或更低，且甚至更優(yōu)選約2.0%重量/體積的藻酸鹽濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞包囊混合物具有約1000 - 3500厘沲或更優(yōu)選1500 — 2500厘沲的粘度。
[0033]在另一個(gè)方面中，提供了用于細(xì)胞的包囊化的藻酸鹽珠。該珠包含:濃度為3%或更低重量/體積的聚合物的藻酸鹽；和包囊的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度優(yōu)選為
2.5%或更低重量/體積，且更優(yōu)選約2.0%重量/體積。在一些實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度在約1.0% - 3.0%重量/體積的范圍。在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度在約1.0% - 2.5%重量/體積的范圍。在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度在約1.0% - 2.0%重量/體積的范圍。
[0034]在各種不同的實(shí)施方案中，包囊的細(xì)胞可以是不同的細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，包囊的細(xì)胞是選自酵母、細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，包囊的細(xì)胞是基本上高濃度的細(xì)胞中的一種細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，包囊的細(xì)胞是酵母或優(yōu)選是選自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、管囊酵母屬(Pachysolen)、畢赤酵母屬(Pichia)和糖酵母屬(Saccharomyces)的酵母。在藻酸鹽珠的其他實(shí)施方案中，包囊的細(xì)胞是細(xì)菌且優(yōu)選是選自大腸桿菌(Escherichia coli)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的細(xì)菌。
[0035]在不同的實(shí)施方案中，可以使用不同的細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞可以是多個(gè)酵母細(xì)胞之一，其中酵母細(xì)胞占藻酸鹽珠質(zhì)量的25%或以上。在其他實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞是多個(gè)酵母細(xì)胞之一，其濃度為5克細(xì)胞/100毫升藻酸鹽。
[0036]在一些實(shí)施方案中，藻酸鹽珠還包括抗生素且優(yōu)選選自青霉素和維吉霉素的抗生素。
[0037]在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽珠還包括維生素且優(yōu)選所述維生素是生物素。在一些實(shí)施方案中，藻酸鹽珠可以包含營(yíng)養(yǎng)物。該營(yíng)養(yǎng)物可以是玉米漿液體。營(yíng)養(yǎng)物可以具有不同濃度。在一些使用玉米漿液體的實(shí)施方案中，玉米漿液體占藻酸鹽珠的1% — 5%體積。
[0038]在另一個(gè)方面中，提供了用于細(xì)胞的包囊化的藻酸鹽珠。該藻酸鹽珠包含:聚合的藻酸鹽；和占至少25%的藻酸鹽珠質(zhì)量的包囊的細(xì)胞。在這些實(shí)施方案的一些中，藻酸鹽濃度為2.5%或更低重量/體積。在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度為約2.0%重量/體積。在一些實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度在約1.0% - 3.0%重量/體積的范圍。在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度在約1.0% - 2.5%重量/體積的范圍。在其他實(shí)施方案中，藻酸鹽濃度在約1.0% -
2.0%重量/體積的范圍。
[0039]用于生產(chǎn)本文所述的俘獲的細(xì)胞的設(shè)備和方法提供了可以用于大量生產(chǎn)的規(guī)?？勺兊慕鉀Q方案。本文公開的裝置和方法的其他方面、目的、期望的特征和優(yōu)點(diǎn)可以從后面的詳細(xì)描述和附圖中更好地理解，其中不同的實(shí)施方案作為實(shí)施例示例。然而，特別應(yīng)理解，附圖僅用于示例目的，而不指定為對(duì)請(qǐng)求保護(hù)的實(shí)施方案的邊界做出定義。
[0040]附圖簡(jiǎn)述
[0041]圖1示例包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的一般生產(chǎn)方法。
[0042]圖2示例由干燥的包囊聚合物生產(chǎn)包囊培養(yǎng)基的方法。
[0043]圖3A示例用于生產(chǎn)濃縮的細(xì)胞懸液的方法的實(shí)施方案。
[0044]圖3B示例如圖3A中所示的用于生產(chǎn)濃縮的細(xì)胞懸液的系統(tǒng)的實(shí)施方案。
[0045]圖4是用于使細(xì)胞增殖的典型生物反應(yīng)器的部分剖示圖。
[0046]優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0047]與其普通生物學(xué)含義一致，本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”是指屬于活生命的最小生命單位。“細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。作為實(shí)例，“細(xì)胞”包括、但不限于細(xì)菌、酵母、真菌、藻、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。
[0048]可以包囊的細(xì)胞包括單細(xì)胞，包括所有來(lái)源于植物、動(dòng)物、真菌、原生生物、真細(xì)菌或古細(xì)菌生命領(lǐng)域的任何成員的細(xì)胞。單細(xì)胞可以是來(lái)源于活植物、動(dòng)物或真菌或從其中取出的細(xì)胞，否則稱作初級(jí)細(xì)胞。初級(jí)細(xì)胞可以來(lái)源于例如哺乳動(dòng)物組織、昆蟲組織、線蟲組織、擬南芥屬(Arabidopsis)組織、番爺植物組織或馬鈴薯植物組織。初級(jí)細(xì)胞還可以分離自真菌或原生生物。
[0049]用于包囊的單細(xì)胞還可以來(lái)源于建立的細(xì)胞培養(yǎng)物品系。例如，細(xì)胞可以來(lái)源于培養(yǎng)的細(xì)胞系，諸如HeLa哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、植物細(xì)胞系、藻類細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系例如Sf9細(xì)胞和來(lái)源于線蟲、昆蟲、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和其他動(dòng)物和植物的細(xì)胞系。
[0050]還可以制備細(xì)胞。例如，細(xì)胞來(lái)源于兩種不同細(xì)胞的融合體，諸如雜交瘤細(xì)胞。
[0051]除單細(xì)胞外，還可以通過(guò)包囊使功能性細(xì)胞或細(xì)胞組織簇固定化。細(xì)胞組織可以包括來(lái)源于植物、原生生物、真菌或動(dòng)物的任何組織。例如，可以包囊來(lái)自人體胰腺或間隙連接的或者功能相關(guān)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組的細(xì)胞簇如腺泡(組織)。
[0052]本文所用的術(shù)語(yǔ)“微生物”是指為單細(xì)胞的生物體的一般含義。作為非限制性實(shí)例，“微生物”包括酵母、細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、原生生物、浮游生物和渦蟲等。術(shù)語(yǔ)“微生物”完全被術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”所包括。
[0053]本文所用的術(shù)語(yǔ)“包囊”是指漿細(xì)胞包封在包囊培養(yǎng)基中。細(xì)胞的“包囊”在包囊培養(yǎng)基中進(jìn)行，該培養(yǎng)基是多孔的，足以允許細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物和其他產(chǎn)物流入和細(xì)胞產(chǎn)生的副產(chǎn)物流出，同時(shí)防止細(xì)胞逸出。本文所用的“包囊”包括一般作為細(xì)胞固定公知的方法，不過(guò)，可以通過(guò)非包囊的方式固定細(xì)胞，例如通過(guò)吸附在基底上。更一般地，“包囊”包括任何類型的方法，其在細(xì)胞周圍形成外殼或囊殼，包括細(xì)胞固定技術(shù)。
[0054]用于細(xì)胞的包囊化的包囊培養(yǎng)基可以包括天然和合成材料。作為非限制性實(shí)例，包囊培養(yǎng)基包括大量天然和合成聚合物。天然材料包括藻酸鹽、來(lái)自褐藻(海藻)的天然產(chǎn)物、角叉菜膠、黃原膠、脫乙酰殼多糖、瓊脂糖、瓊脂、膠原蛋白、纖維素及其衍生物、透明質(zhì)酸鹽、果膠、纖維蛋白、蛋白質(zhì)、核酸和明膠。用于包囊的合成材料包括環(huán)氧樹脂、光交聯(lián)樹脂、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚(丙烯酸)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚磷腈和聚氨基甲酸酯。[0055]在一些應(yīng)用中，兩種或更多種材料可以用作包囊培養(yǎng)基，例如，藻酸鹽和聚乙烯醇或聚(環(huán)氧乙烷)和聚(氧化丙烯)或聚(環(huán)氧乙烷)和聚(乳酸)的共聚物可以用作包
囊基質(zhì)。
[0056]包囊在聚合物基質(zhì)中的細(xì)胞可以用于許多不同的工業(yè)化方法，包括，例如發(fā)酵和廢水處理。細(xì)胞的基質(zhì)包囊包括優(yōu)于使用’游離’細(xì)胞的益處?！坞x’細(xì)胞是未包囊的或以任何方式固定的細(xì)胞。包囊細(xì)胞系統(tǒng)優(yōu)于’游離’細(xì)胞系統(tǒng)的最大優(yōu)點(diǎn)之一在于可以獲得包囊細(xì)胞系統(tǒng)的高細(xì)胞密度。高細(xì)胞密度是大量不同發(fā)酵方法中期望的，如生產(chǎn)基于生物的化學(xué)品，諸如3-羥基丙酸、葡糖二酸、乙酰丙酸、木糖醇、乙酸、檸檬酸、乳酸、乙醇等。通過(guò)基質(zhì)包囊的細(xì)胞系統(tǒng)獲得的高細(xì)胞密度有益于獲得高容量生產(chǎn)力，而游離細(xì)胞系統(tǒng)不能獲得這種高細(xì)胞密度。
[0057]細(xì)胞的基質(zhì)包囊的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于包囊有利于生化方法，諸如發(fā)酵方法的連續(xù)而不是分批操作，無(wú)需洗滌掉細(xì)胞生物催化劑。連續(xù)發(fā)酵方法經(jīng)歷的故障時(shí)間少于分批方法。故障時(shí)間少給連續(xù)系統(tǒng)增加了經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。除故障時(shí)間少外，連續(xù)系統(tǒng)中防止細(xì)胞洗滌掉還代表著巨大的成本節(jié)約，因?yàn)橛糜诠I(yè)化方法的細(xì)胞增殖是昂貴的。
[0058]在一些應(yīng)用中，包囊細(xì)胞系統(tǒng)的應(yīng)用還提供了除提供高細(xì)胞密度和防止洗滌掉外的優(yōu)勢(shì)。在其中接觸細(xì)胞的培養(yǎng)基包含對(duì)細(xì)胞有害的化合物的應(yīng)用中，將細(xì)胞包囊在基質(zhì)中賦于了對(duì)有害化合物的抗性增加。例如，發(fā)酵植物生物質(zhì)水解產(chǎn)物產(chǎn)生生物燃料通常因存在幾種不同的對(duì)發(fā)酵過(guò)程有害的化合物而復(fù)雜化。將微生物細(xì)胞包囊在聚合物基質(zhì)例如藻酸鈣中賦于了對(duì)所述化合物的抗性增加且由此改善了發(fā)酵方法。
[0059]本專利文件教導(dǎo)了用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的新的和改進(jìn)的方法和設(shè)備。在先，用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞的方法為特定的最終應(yīng)用定制或以相對(duì)小的規(guī)模進(jìn)行或它們兩者。本專利文件教導(dǎo)了提高包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)能力的新方法。
[0060]圖1示例包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106的一般生產(chǎn)方法。在圖1中所示的方法100的實(shí)施方案中，將細(xì)胞101與包囊培養(yǎng)基102在混合步驟103中合并，產(chǎn)生細(xì)胞包囊混合物104。優(yōu)選以為包囊制備的懸浮液形式提供細(xì)胞101。將包囊培養(yǎng)基溶液102與懸浮的細(xì)胞101彼此混合，產(chǎn)生細(xì)胞包囊混合物104。一旦生產(chǎn)了細(xì)胞包囊混合物，則在步驟105中聚合、膠凝或交聯(lián)，產(chǎn)生包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106。
[0061]細(xì)胞101可以是細(xì)菌、酵母、真菌、藻類、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或如上所述的任何其他細(xì)胞類型。細(xì)胞101還可以包含這種細(xì)胞組合。細(xì)胞101還可以是一組功能性細(xì)胞或組織的組成部分或細(xì)胞融合體的產(chǎn)物，諸如雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞101還可以是共生生長(zhǎng)的細(xì)胞的混合物，例如藻類細(xì)胞的混合物或酵母或真菌細(xì)胞的混合物。細(xì)胞101的類型、組合和密度取決于最終包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106的期望的應(yīng)用。
[0062]還可以以許多不同形式向方法100提供細(xì)胞101，這取決于待產(chǎn)生的期望的包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106。如果期望具有高細(xì)胞密度的包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106，則優(yōu)選以濃縮細(xì)胞懸液的形式提供細(xì)胞101。當(dāng)細(xì)胞101是濃縮細(xì)胞懸液形式時(shí)，可以進(jìn)行混合步驟103，以便在得到的包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106中維持高細(xì)胞密度。包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106中的高細(xì)胞濃度對(duì)許多生化方法而言是有利的，包括，例如，發(fā)酵應(yīng)用。例如，可能需要高濃度的酵母或細(xì)菌細(xì)胞以便在反應(yīng)器中產(chǎn)生高發(fā)酵速率。
[0063]在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞101可以是相對(duì)稀懸浮液的形式。以稀懸浮液的形式提供細(xì)胞101，使得混合步驟103和聚合步驟105能夠?qū)渭?xì)胞包囊在包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106中?？梢院喜⑵渌M合的細(xì)胞懸液101和混合步驟103，以提供不同的包囊細(xì)胞產(chǎn)物106的變化形式。
[0064]在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞101可以是一組功能性細(xì)胞或組織，諸如來(lái)自人體胰腺的單一人腺泡。細(xì)胞101還可以包括間隙連接或者功能相關(guān)組的神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞。可以以稀懸浮液形式提供組織，使得混合步驟103和聚合步驟105能夠包囊單一組織切片，諸如將單一腺泡包囊在包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106中。
`[0065]包囊培養(yǎng)基102可以是許多不同的材料。例如，可以使用藻酸鈣，即褐藻(海藻)的天然產(chǎn)物來(lái)包囊細(xì)胞?？梢允褂闷渌烊缓秃铣傻牟牧希ň酆系幕衔?，諸如藻酸鈉、角叉菜膠、黃原膠、瓊脂糖、瓊脂、纖維素及其衍生物、膠原蛋白、透明質(zhì)酸鹽、果膠、明膠、環(huán)氧樹脂、光交聯(lián)樹脂、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚(醋酸乙烯酯)和聚氨基甲酸酯等。在一些實(shí)施方案中，可以合并一種以上包囊培養(yǎng)基102。例如，可以將藻酸鹽和聚(乙烯醇)合并為包囊培養(yǎng)基102。
[0066]一旦制備包囊培養(yǎng)基102的水溶液和濃縮的細(xì)胞懸液101，則將它們彼此在容器中混合103?？梢允褂蒙a(chǎn)期望的細(xì)胞包囊混合物104的任何方法進(jìn)行混合步驟103。重要的是以對(duì)細(xì)胞101和包囊培養(yǎng)基102最小的損害進(jìn)行混合步驟103。為此，混合步驟103應(yīng)將對(duì)細(xì)胞101和包囊培養(yǎng)基102的剪切力減小到最低限度。此外，包囊培養(yǎng)基102可以具有高度粘性，從而使混合進(jìn)一步復(fù)雜化。在典型的實(shí)施方案中，混合步驟103使用往復(fù)震動(dòng)器或往復(fù)盤進(jìn)行以混合細(xì)胞101與包囊培養(yǎng)基102。標(biāo)準(zhǔn)葉輪混合器對(duì)細(xì)胞101施加剪切力，不適合于在高粘性溶液中混合。
[0067]混合步驟103還優(yōu)選混合細(xì)胞101和包囊培養(yǎng)基102，以便將細(xì)胞101分配于整個(gè)包囊培養(yǎng)基中并且達(dá)到優(yōu)選的粘度。在一些實(shí)施方案中，可能期望混合至得到基本上均勻的分散體。然而，在其他實(shí)施方案中，可以不將細(xì)胞101和包囊培養(yǎng)基102混合至均勻。[0068]一旦將細(xì)胞101和包囊培養(yǎng)基混合至期望的量，優(yōu)選混合至均勻，則可以在步驟105中聚合、膠凝或交聯(lián)細(xì)胞包囊混合物104，生成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106。在聚合步驟105之前，細(xì)胞包囊混合物104可以形成任何數(shù)量的結(jié)構(gòu)不同的產(chǎn)物。例如,細(xì)胞包囊混合物104可以形成球形珠或線狀物，將其施加于支持結(jié)構(gòu)上，諸如開放的篩網(wǎng)、蜂窩狀物或絲瓜狀物上，施加于反應(yīng)器壁上；或形成另一種三維形狀，然后進(jìn)行膠凝、交聯(lián)或聚合105，產(chǎn)生終產(chǎn)物 106。
[0069]聚合、膠凝或交聯(lián)劑的性質(zhì)對(duì)用作包囊劑的聚合物具有特異性。就藻酸鈉而言，通過(guò)接觸不同二價(jià)或三鉀陽(yáng)離子實(shí)現(xiàn)藻酸鹽聚合物的交聯(lián)。
[0070]存在許多改善包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106效率的技術(shù)。一種改善效率的方式在于通過(guò)提供高表面積與體積比實(shí)現(xiàn)。聚合細(xì)胞包囊混合物104增加其暴露的表面積且由此可以提高包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106的效率。例如，為了有助于生化過(guò)程，例如發(fā)酵過(guò)程，可以將藻酸鈉中的酵母細(xì)胞聚合成小球形珠形式，它提供高表面積與體積比?；蛘撸梢詫⒃逅徕c中的酵母細(xì)胞聚合成細(xì)絲狀物或線狀物的形式。
[0071]可以使用滴落-成形法使細(xì)胞包囊混合物104形成珠。得到的珠可以具有不同大小并且具有不同孔徑。存在許多生產(chǎn)珠的裝置?？梢酝ㄟ^(guò)使用靜電引力產(chǎn)生液滴、使用震動(dòng)產(chǎn)生液滴、使用空氣產(chǎn)生液滴和使用旋轉(zhuǎn)盤噴霧器等由連續(xù)氣流生產(chǎn)珠。例如，如果基質(zhì)是藻酸鈉，則易于通過(guò)使珠與氯化鈣溶液接觸來(lái)聚合所述珠。
[0072]在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞包囊混合物104可以形成細(xì)絲狀物或線狀物。在這種情況中，所述的絲狀物或線狀物適度地比俘獲的細(xì)胞直徑大。所述的絲狀物或線狀物可以隨機(jī)地存放以形成可以用于生物反應(yīng)器的多孔結(jié)構(gòu)。存在許多方式，通過(guò)它們產(chǎn)生細(xì)絲狀物或線狀物，例如通過(guò)經(jīng)窄計(jì)量注射針擠出、然后接觸聚合試劑或通過(guò)電紡絲。在擠出的情況下，可以在壓力下通過(guò)一個(gè)或優(yōu)選大量窄計(jì)量中空針頭將細(xì)胞在藻酸鹽基質(zhì)溶液中的懸浮液擠入氯化鈣溶液，產(chǎn)生大量絲狀物或線狀物。
[0073]在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞包囊混合物104可以作為涂層涂布于天然或合成、高表面積支持結(jié)構(gòu)上。在該實(shí)施方案的一種實(shí)施方式中，僅要求支持結(jié)構(gòu)能夠支持細(xì)胞包囊混合物104及其自身。例如，支持結(jié)構(gòu)可以包含陶瓷海綿、蜂窩狀物、反應(yīng)器包裝材料或其他在涂布時(shí)增加每塊細(xì)胞包囊混合物104的表面積的支持結(jié)構(gòu)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞包囊混合物104還可以或在可選方式中可以涂布于部分反應(yīng)器表面，諸如混合裝置的壁或表面上。
[0074]最終的包囊細(xì)胞產(chǎn)物106的一個(gè)重要方面在于得到的聚合基質(zhì)不溶于水性介質(zhì)或其中使用該產(chǎn)物的介質(zhì)。在一些情況下，介質(zhì)中包含的化學(xué)試劑可以減弱或破壞包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106中的聚合物或交聯(lián)劑。例如，幾種陰離子，例如檸檬酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽可以螯合來(lái)自藻酸鈣的鈣離子，由此消除交聯(lián)且賦于藻酸鹽可溶性。因此，檸檬酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽陰離子應(yīng)為低濃度或從與藻酸鈣包囊的細(xì)胞產(chǎn)物接觸的介質(zhì)中消除。
[0075]包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106的另一個(gè)重要方面在于得到的聚合基質(zhì)包含孔，其保留包囊的細(xì)胞，但可滲透該細(xì)胞用于維持或發(fā)酵所需的不同的分子。例如，在用于將酵母包囊在糖發(fā)酵成乙醇的藻酸鈣珠中的情況下，包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106的孔徑必須足夠小以保留酵母細(xì)胞，同時(shí)能夠使糖不受限制地進(jìn)入珠和乙醇流出。
[0076]可以使用許多方法將細(xì)胞101包囊在包囊培養(yǎng)基102中。細(xì)胞包囊的所有方法都包括混合步驟103，其中將細(xì)胞101與包囊培養(yǎng)基102以液體形式混合，然后是膠凝、交聯(lián)或聚合步驟105，其完成了將細(xì)胞包囊在包囊基質(zhì)中。
[0077]藻酸鹽對(duì)用作包囊培養(yǎng)基102而言是理想的。藻酸鹽可溶于高于pH4的水性介質(zhì)，但在PH低于約pH4下時(shí)轉(zhuǎn)化成藻酸。水不溶性藻酸鹽凝膠在適合濃度的凝膠形成離子例如鈣、鋇、鍶、鋅、銅(II)、鋁及其混合物的存在下形成。藻酸鹽凝膠是水凝膠，即包含大量水而不溶解的交聯(lián)藻酸鹽聚合物。這些特性使得藻酸鹽凝膠作為包囊培養(yǎng)基102是理想的。
[0078]許多聚合物基質(zhì)本來(lái)是干固體，一般在使用前懸浮于水溶液中。一些聚合物可能需要在使用前懸浮于有機(jī)溶劑中。因?yàn)榫酆?、膠凝或交聯(lián)度是聚合物長(zhǎng)度或在溶液中的濃度的函數(shù)，所以一些聚合物用作包囊基質(zhì)比其他聚合物更常規(guī)。對(duì)聚合物選擇的其他考量包括:膠凝、聚合或交聯(lián)基質(zhì)以產(chǎn)生終產(chǎn)物的相對(duì)便利性；和聚合物自身和交聯(lián)劑或聚合試劑的相對(duì)細(xì)胞毒性。更多考量包括基質(zhì)在特定應(yīng)用中的熱穩(wěn)定性。更多考量包括應(yīng)用的便利性和成本和商業(yè)化可用性。
[0079]由于許多上述原因，所以藻酸鹽常用于細(xì)胞包囊。藻酸鹽是親水性海產(chǎn)生物聚合物，其具有形成可以在低溫和中溫下展開和固定的熱穩(wěn)定性凝膠的能力。藻酸鹽是無(wú)支鏈聚合物家族，即通過(guò)1-4糖苷鍵連接的β-D-甘露糖醛酸和a-L-古羅糖醛酸殘基。藻酸基本上不溶于水，但與堿金屬諸如鈉、鉀和鋰形成水溶性鹽。藻酸鈉制品是可商購(gòu)的。
[0080]在制備用作包囊培養(yǎng)基的藻酸鈉的過(guò)程中，應(yīng)考慮許多因素。例如，鏈長(zhǎng)、粘度和濃度都可以影響最終包囊產(chǎn)物的有效性。此外，不同的藻酸鈉產(chǎn)品具有不同的天然存在于不同藻酸鹽中的甘露糖醛酸和古羅糖醛酸比例。具有特定甘露糖醛酸和古羅糖醛酸比例的藻酸鹽可能是特定應(yīng)用所期望的。
[0081]作為用于將糖發(fā)酵成乙醇的方法100的非限制性實(shí)例，啤酒糖酵母細(xì)胞的濃稠漿液可以用作細(xì)胞101，且藻酸鈉即來(lái)自褐藻類的天然聚合物溶液可以用于包囊培養(yǎng)基102。在其他實(shí)施方案中，可以使用其他酵母細(xì)胞，例如來(lái)自假絲酵母屬、克魯維酵母菌屬、管囊酵母屬、糖酵母屬等的酵母。當(dāng) 將酵母與包囊培養(yǎng)基102混合時(shí)，濃縮后酵母細(xì)胞濃度優(yōu)選為約10 - 200克濕細(xì)胞團(tuán)/升或約25%濕質(zhì)量細(xì)胞/升。
[0082]優(yōu)選地，將藻酸鈉在包囊培養(yǎng)基102中混合至I 一 6克/升的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，藻酸鈉的濃度在水中可以低于3%w/v。優(yōu)選在加工步驟103中將酵母漿液和藻酸鹽溶液彼此混合至均勻，形成細(xì)胞包囊混合物104。優(yōu)選地，當(dāng)包囊培養(yǎng)基102是藻酸鈉時(shí)，包囊培養(yǎng)基102的粘度為約1500 - 3500cSt且更優(yōu)選2000 — 3000cSt。細(xì)胞包囊混合物104的粘度優(yōu)選為1000 - 3500cSt且更優(yōu)選1500-2500cSt。一旦生成細(xì)胞包囊混合物104，則可以將其聚合105。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合通過(guò)使細(xì)胞包囊混合物104通過(guò)96-中空針頭裝置進(jìn)行，產(chǎn)生滴入氯化鈣溶液中的液滴。
[0083]在另一個(gè)實(shí)施方案中，與包囊培養(yǎng)基混合的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，包括細(xì)菌大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等。當(dāng)將細(xì)菌與基質(zhì)溶液混合時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞的濃度為約80 - 625克濕細(xì)胞
團(tuán)/升。
[0084]圖2示例由濃縮的包囊產(chǎn)物201生產(chǎn)包囊培養(yǎng)基102的方法。濃縮的包囊產(chǎn)物201以固態(tài)或液態(tài)開始并且可以具有在中間的全范圍粘度。在一個(gè)實(shí)施方案中，濃縮的包囊產(chǎn)物201是干粉。該方法的其他實(shí)施方案可以從聚合物或其他為液體形式的介質(zhì)開始。以干粉形式或盡可能濃縮和脫水形式貯存濃縮的包囊產(chǎn)物201是有利的，因?yàn)槲镔|(zhì)典型地在干燥形式下具有增加的貯存期限。此外，干燥濃縮形式可減小貯存體積并且便于更容易和更低廉的運(yùn)輸。然而，在其他實(shí)施方案中，圖2中所示的方法可以開始于以從固體到液體的任何粘性狀態(tài)存在的濃縮的包囊產(chǎn)物201。
[0085]在圖2中所示的實(shí)施方案中，提供濃縮的包囊產(chǎn)物201，并且在混合步驟202中用水溶液208增溶?；旌喜襟E形成增溶的包囊培養(yǎng)基，其可以作為包囊培養(yǎng)基102起作用。然而，在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)其他如下所述的可選步驟進(jìn)一步加工增溶的溶液。一旦生成包囊培養(yǎng)基102，則可以如圖1中所示與細(xì)胞101混合。
[0086]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮的包囊產(chǎn)物201是聚合物。更優(yōu)選地，濃縮的包囊產(chǎn)物201可以是藻酸鈉。藻酸鈉可以以不同形式從許多來(lái)源得到，包括:WEG0 Chemicaland Mineral C0.,239Great Neck Road GreatNeck, NYl1021 (www.wegochem.com)；Sigma-Aldrich, 3050Spruce St.St.Louis,M063103(www.sigmaaldrich.com)；和 MPBiomedicals, 29525Fountain Pkwy.Solon, 0H44139(www.mpbi0.com)。
[0087]圖2中所示的實(shí)施方案示例添加水溶液208以便在混合步驟202中增溶濃縮的包囊產(chǎn)物201。在方法200的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用混合噴射器將濃縮的包囊產(chǎn)物201以干燥狀態(tài)導(dǎo)入包含液體的混合容器。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，水溶液是水。然而，在其他實(shí)施方案中，水溶液可以是水與其他可以增強(qiáng)最終包囊培養(yǎng)基102性能的添加劑的組合。
[0088]進(jìn)行混合步驟202以產(chǎn)生具有期望濃度的包囊培養(yǎng)基102。在方法200的一個(gè)典型的實(shí)施方案中，將藻酸鈉粉用作濃縮的包囊培養(yǎng)基201?？梢詫⒃逅徕c粉加入到水溶液208中，達(dá)到約l%w/v — 6%w/V的濃度。優(yōu)選地，所用的藻酸鈉是約320mPa — 1400mPa的顆?；a(chǎn)物，其中用于包囊的藻酸鈉水溶液的粘度為1500 - 3500厘沲(cSt)。優(yōu)選顆?；逅徕c，因?yàn)轭w?；a(chǎn)物更易溶于約15 - 30°C的水中。
[0089]濃縮的包囊產(chǎn)物201可能包含微生物污染物，例如細(xì)菌。為了降低濃縮的包囊產(chǎn)物201的污染水平，使用方法200的不同實(shí)施方案能夠任選許多不同的滅菌方法205、210和213。此外，其他實(shí)施方案可`以在混合202前添加抗生素207和211。
[0090]在方法200的一個(gè)實(shí)施方案中，任選Y射線照射210可以用于對(duì)濃縮的包囊培養(yǎng)基201滅菌。Y射線照射可以以8 - 20千戈瑞(kGy)使用以照射濃縮的包囊培養(yǎng)基。
[0091]在其他實(shí)施方案中，滅菌的水溶液208可以用作混合步驟202過(guò)程中對(duì)濃縮的包囊培養(yǎng)基201滅菌的媒介物。水溶液208可以具有在混合202與濃縮的包囊產(chǎn)物201前添加的化學(xué)滅菌劑203或抗生素212，以降低得到的混合物中微生物的污染水平。在這樣的實(shí)施方案中，在混合步驟202前將滅菌劑203與水溶液208混合205。在一些實(shí)施方案中，在混合步驟202前還可以將抗生素212添加到水溶液208中。在混合步驟202過(guò)程中水溶液208將滅菌劑203和/或抗生素212分配入濃縮的包囊培養(yǎng)基201。通過(guò)首先混合滅菌劑203和/或抗生素212與水溶液208，滅菌劑203和/或抗生素212可以更有效地均勻地分布至濃縮的包囊培養(yǎng)基201中。
[0092]在方法200的其他實(shí)施方案中，在混合202后通過(guò)使用紫外線照射213對(duì)包囊培養(yǎng)基滅菌，以減少最終混合物102的微生物污染。
[0093]盡管始終優(yōu)選即時(shí)應(yīng)用包囊培養(yǎng)基，但是可能需要任選的滅菌步驟205、210和213以增加用于貯存的增溶的包囊培養(yǎng)基的貯存期限。此外，一些實(shí)施方案可以在混合步驟202之前或之后添加抗生素。因?yàn)闈饪s的包囊產(chǎn)物常常是無(wú)菌的且增溶后其貯存期限因不期望的微生物生長(zhǎng)而縮短，所以可能需要用一些所述的任選步驟處理濃縮的包囊培養(yǎng)基。此外，因?yàn)槿芤褐胁恍枰奈⑸锷L(zhǎng)可能降低包囊培養(yǎng)基102的粘度，所以不同的滅菌步驟可以有助于預(yù)防不需要的粘度改變。[0094]盡管上述單獨(dú)地描述了任選的滅菌步驟205、210和213，但是在不同的實(shí)施方案中，滅菌步驟可以以任何組合的方式使用。此外，滅菌步驟205、210和213可以以與任選的添加抗生素任何組合的方式使用。
[0095]本專利文件教導(dǎo)了使用非熱滅菌法205和混合方法202的新的構(gòu)思。為了使一些濃縮的包囊產(chǎn)物201進(jìn)入溶液，加熱混合物并且在攪拌板上攪拌，或更常見的是在實(shí)驗(yàn)室滅菌器中在121°C下加熱15-45分鐘。然而，加熱藻酸鹽聚合物可能導(dǎo)致一定量的藻酸鹽水解且由此改變?cè)逅猁}溶液的特性，包括其粘度。
[0096]熱法也常用于對(duì)溶液滅菌。如果使用非熱法進(jìn)行混合步驟202和滅菌步驟205、210和213，則在最終包囊培養(yǎng)基中需要基本上較低濃度的濃縮的包囊產(chǎn)物201。例如，如果使用熱法諸如高壓滅菌進(jìn)行滅菌步驟205，則需要藻酸鈉與水相比藻酸鈉濃度為約
3.5%(w/v)，以便使得到的包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的乙醇收率最大化。然而，如果混合步驟202和滅菌步驟205、210和213使用非熱法，諸如化學(xué)滅菌，則需要藻酸鈉與水相比低于3%的藻酸鈉且優(yōu)選低于2.5%且更優(yōu)選約2%的藻酸鈉(w/v)，以便使得到的包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的乙醇收率最大化。盡管在最終包囊的細(xì)胞產(chǎn)物中藻酸鈉的濃度較低，但是沒有降低包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的性能。
[0097]通過(guò)降低產(chǎn)生包囊培養(yǎng)基102所需的包囊產(chǎn)物201的濃度，而不影響包囊的細(xì)胞產(chǎn)物106的收率，使用非熱法進(jìn)行滅菌步驟205、210和213提供了明顯優(yōu)于熱法的成本節(jié)約，當(dāng)將圖2的方法按比例放大至工業(yè)化規(guī)模時(shí)，生成包囊培養(yǎng)基102所需的包囊產(chǎn)物201濃度的降低可以提供顯著的成本節(jié)約。
[0098]各種化學(xué)滅菌產(chǎn)品可以用作滅菌劑203。例如，在一些實(shí)施方案中，滅菌劑 203 可以選自 Lactrol (PhibroChem) > 乳糖昔(Lallemand EthanolTechnologies)；FermaSure(DuPont) ；FermGuard(Ferm Solutions) ；FermGuard Xtreme(Ferm Solutions)；亞氯酸鈉；和氯霉素。此外，可以彼此合并一種以上滅菌劑203。
[0099]在一個(gè)使用次氯酸鈉作為滅菌劑203的實(shí)施方案中，次氯酸鈉的濃度可以為約I — 2000份/百萬(wàn)(ppm)。次氯酸鈉溶液可以是商購(gòu)產(chǎn)品FermaSure。
[0100]在為保持包囊培養(yǎng)基102中無(wú)菌性而設(shè)計(jì)的另一個(gè)實(shí)施方案中，在滅菌后可以加入抗生素青霉素和維吉霉素。優(yōu)選地，可以以約I 一 5ppm的濃度添加商購(gòu)產(chǎn)品乳糖苷。在其他實(shí)施方案中，可以使用其他抗生素，包括工業(yè)化生產(chǎn)的抗生素，例如FermGuard Xtreme,濃度為I — 5ppm。
[0101]如上所述，如果不添加滅菌劑203或除添加滅菌劑203外，方法200的一些實(shí)施方案可以使用紫外線照射213對(duì)濃縮的包囊培養(yǎng)基201滅菌。優(yōu)選地，用紫外光以10 -50mffs/cm2或10 — 50mJ/cm2照射包囊的培養(yǎng)基混合物102以達(dá)到滅菌。
[0102]除任選的滅菌205和任選地混合抗生素外，還可以在營(yíng)養(yǎng)物/維生素混合步驟207中進(jìn)一步加工包囊培養(yǎng)基102。如圖1中所示，可以在用于與細(xì)胞101混合的制備中將維生素和營(yíng)養(yǎng)物204加入包囊培養(yǎng)基102。通過(guò)生成已經(jīng)包含作為細(xì)胞生長(zhǎng)必需的維生素和營(yíng)養(yǎng)物的包囊培養(yǎng)基102，可以在促進(jìn)細(xì)胞101生長(zhǎng)、產(chǎn)量和效率的環(huán)境中包囊細(xì)胞101。[0103]在一個(gè)實(shí)施方案中，維生素和營(yíng)養(yǎng)物204可以是玉米漿粉或玉米漿液體?？梢砸?- 5%重量/體積的濃度使用玉米漿粉?？梢砸訧 一 5%體積/體積的濃度使用玉米漿液體。
[0104]在其他實(shí)施方案中，還可以加入各種維生素或維生素的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在混合步驟中以2ng/L - 2微克/L的濃度加入維生素生物素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在混合步驟中以4ng/升一 400微克/升的濃度加入維生素生物素和硫胺。
[0105]圖2顯示滅菌205、抗生素混合211和營(yíng)養(yǎng)物/維生素混合207作為任選的附加步驟。然而，在其他實(shí)施方案中，滅菌205、抗生素混合211和營(yíng)養(yǎng)物/維生素混合207可以在單一混合步驟202和/或相同混合容器中進(jìn)行。例如，可以將濃縮的包囊產(chǎn)物溶于生長(zhǎng)培養(yǎng)基、溶于維生素包括生物素或硫胺的混合物或溶于補(bǔ)充了維生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基或溶于包含生物素和或硫胺的天然溶液?；旌喜襟E202可以在相同容器或單獨(dú)容器中進(jìn)行。
[0106]用于制備包囊培養(yǎng)基102的方法200和用于混合包囊培養(yǎng)基102與細(xì)胞101以制備包囊的細(xì)胞產(chǎn)物104的方法100都分別需要混合步驟202和103。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，混合步驟202和103可以在相同容器中發(fā)生。優(yōu)選地，包囊培養(yǎng)基102和細(xì)胞101的混合103可以在相同的一次性容器中進(jìn)行，其中增溶和滅菌包囊聚合物。
[0107]下列實(shí)施例稱作實(shí)施例1且顯示圖2方法的一個(gè)實(shí)施方案在由藻酸鈉生產(chǎn)包囊培養(yǎng)基102中的應(yīng)用。在實(shí)施例1中，圖2中所示的方法用于生產(chǎn)五個(gè)(5)不同批次的包囊培養(yǎng)基。五個(gè)(5)不同批次各自從不同的藻酸鈉產(chǎn)品開始于濃縮的包囊培養(yǎng)基201。五個(gè)
(5)不同批次的藻酸鈉產(chǎn)品各自具有不同的聚合物長(zhǎng)度。藻酸鈉的粘度與聚合物的長(zhǎng)度成正比，因此，提供實(shí)施例1是為了示例改變濃縮的包囊產(chǎn)物201 (諸如藻酸鈉)的粘度對(duì)聚合的包囊細(xì)胞產(chǎn)物106的乙醇生產(chǎn)效率的影響。正如實(shí)施例1中所示，改變濃縮的包囊產(chǎn)物的粘度可以影響生產(chǎn)乙醇的生物反應(yīng)器中包囊的微生物的乙醇生產(chǎn)效率。
[0108]在實(shí)施例1中，如圖1中所示將所有的不同批次與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Sb混合，聚合成珠，并且用于發(fā)酵甘蔗渣水解產(chǎn)物。五個(gè)(5)不同批次各自使用具有不同粘度的藻酸鈉產(chǎn)品作為濃縮的包囊產(chǎn)物201。然后通過(guò)在混合步驟202中經(jīng)將3.5%(重量(W)/體積(V))藻酸鈉添加到水中與水混合來(lái)增溶具有改變粘度的藻酸鈉產(chǎn)品。在所有情況下，發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的生物質(zhì)載量為3%且以0.2g珠/ml水解液接種。給水解液補(bǔ)充1.2g/L磷酸氫二銨和0.5w/v酵母提取物。在30°C使用旋轉(zhuǎn)振蕩器以50rpm溫育71小時(shí)。
[0109]表1顯示包囊在5種不同的藻酸鹽產(chǎn)品中的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Sb在甘蔗渣水解產(chǎn)物中溫育后的乙醇濃度。將數(shù)據(jù)以一式三份測(cè)定的平均值顯示。不同藻酸鈉產(chǎn)品的粘度(1%，在1%乙酸中，在20°C )在100或200mPa —甚至高達(dá)1236mPa。數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)生最高乙醇濃度的兩種藻酸鹽是由Wego Chemical和Mineral C0.生產(chǎn)的324mPa和620mPa的藻酸鈉產(chǎn)品。因此，用于發(fā)酵甘蔗渣水解產(chǎn)物的優(yōu)選實(shí)施方案包括具有約324mPa — 620mPa的中至低粘度的藻酸鹽。
[0110]
【權(quán)利要求】
1.用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的方法，該方法包括下列步驟: a.使用切向流過(guò)濾系統(tǒng)從增殖培養(yǎng)基中濃縮細(xì)胞，其中將細(xì)胞濃縮在截留物中，且使該截留物通過(guò)切向流過(guò)濾系統(tǒng)再循環(huán)直到達(dá)到期望的細(xì)胞濃度為止； b.將濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基混合，形成細(xì)胞包囊混合物；和 c.聚合細(xì)胞包囊混合物,形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括使用來(lái)自增殖培養(yǎng)基的細(xì)胞作為隨后生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的接種物的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，其中使截留物在截留物貯存容器與切向流過(guò)濾系統(tǒng)之間再循環(huán)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中使截留物通過(guò)切向流過(guò)濾系統(tǒng)再循環(huán)直到達(dá)到大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升的細(xì)胞濃度為止。
5.權(quán)利要求1的方法，其中使用往復(fù)震動(dòng)器進(jìn)行混合步驟。
6.權(quán)利要求1的方法，其中使用往復(fù)圓盤進(jìn)行混合步驟。
7.用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含: 生物反應(yīng)器； 與所述生物反應(yīng)器互通的切向流過(guò)濾系統(tǒng)；和 與切向流過(guò)濾系統(tǒng)互通的截留物貯存容器。
8.權(quán)利要求7的系統(tǒng)，還包括可操作地安排以將來(lái)自截留物貯存容器的細(xì)胞懸液與包囊培養(yǎng)基混合的往復(fù)震動(dòng)器。
9.權(quán)利要求7的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器是恒化生物反應(yīng)器。
10.用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的方法，該方法包括下列步驟: a.從增殖培養(yǎng)基中濃縮細(xì)胞； b.使用往復(fù)震動(dòng)器將濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基混合，形成細(xì)胞包囊混合物；和 c.聚合細(xì)胞包囊混合物,形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述生物反應(yīng)器是恒化生物反應(yīng)器。
12.權(quán)利要求10的方法，其中將細(xì)胞濃縮至大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升。
13.權(quán)利要求11的方法，其中包囊培養(yǎng)基具有約1000- 3500厘沲的粘度。
14.權(quán)利要求11的方法，其中細(xì)胞包囊混合物具有約1000- 3500厘沲的粘度。
15.用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的方法，該方法包括下列步驟: a.在生物反應(yīng)器中使細(xì)胞增殖，形成第一批細(xì)胞； b.濃縮來(lái)自第一批細(xì)胞的細(xì)胞； c.混合濃縮的細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基，形成細(xì)胞包囊混合物； d.聚合細(xì)胞包囊混合物，形成包囊的細(xì)胞產(chǎn)物；和 e.使用來(lái)自第一批細(xì)胞的細(xì)胞作為接種物在生物反應(yīng)器中使細(xì)胞增殖，形成第二批細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中在使第一批細(xì)胞增殖與使第二批細(xì)胞增殖之間不對(duì)生物反應(yīng)器滅菌。
17.權(quán)利要求15的方法，其中濃縮步驟通過(guò)切向流過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行并且將細(xì)胞濃縮在截留物中。
18.權(quán)利要求17的方法，還包括使用一部分所述截留物作為接種物的步驟。
19.權(quán)利要求17的方法，還包括使截留物在截留物貯存容器與切向流過(guò)濾系統(tǒng)之間循環(huán)的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中將循環(huán)步驟進(jìn)行至截留物達(dá)到大于180克濕細(xì)胞團(tuán)/升的細(xì)胞濃度為止。
21.權(quán)利要求16的方法，其中接種物包含約5%- 10%體積的第一批細(xì)胞。
22.用于生產(chǎn)包囊的細(xì)胞產(chǎn)物的方法，該方法包括下列步驟: a.將水溶液與濃縮的包囊培養(yǎng)基混合，形成包囊培養(yǎng)基，其中混合在不添加足以對(duì)所述包囊培養(yǎng)基滅菌的熱的情況下進(jìn)行； b.在不加熱的情況下將細(xì)胞與包囊培養(yǎng)基混合，形成細(xì)胞包囊混合物；和 c.聚合細(xì)胞包囊混合物，產(chǎn)生包囊的細(xì)胞產(chǎn)物；且 其中用如下技術(shù)中至少一種對(duì)細(xì)胞包囊培養(yǎng)基滅菌:在混合水溶液步驟前將滅菌劑添加到水溶液中；在混合水溶液步驟過(guò)程中將滅菌劑添加到包囊培養(yǎng)基中；在混合水溶液步驟前對(duì)水溶液和濃縮包囊產(chǎn)物兩者進(jìn)行滅菌；和照射包囊培養(yǎng)基。
23.權(quán)利要求22的方法，其中將滅菌劑添加到水溶液中。
24.權(quán)利要求23的方法，其中亞氯酸鈉是滅菌劑。
25.權(quán)利要求22的方法，還包括將 抗生素添加到包囊培養(yǎng)基中的步驟。
26.權(quán)利要求22的方法，還包括將營(yíng)養(yǎng)物添加到包囊培養(yǎng)基中的步驟。
27.權(quán)利要求22的方法，還包括將維生素添加到包囊培養(yǎng)基中的步驟。
28.權(quán)利要求22的方法，還包括照射濃縮的包囊培養(yǎng)基的步驟。
29.權(quán)利要求22的方法，還包括照射包囊培養(yǎng)基的步驟。。
30.權(quán)利要求22的方法，其中混合細(xì)胞步驟使用往復(fù)震動(dòng)器進(jìn)行。
31.權(quán)利要求22的方法，其中混合細(xì)胞步驟使用往復(fù)圓盤進(jìn)行。
32.權(quán)利要求22的方法，其中濃縮的包囊培養(yǎng)基包含藻酸鈉。
33.權(quán)利要求32的方法，其中將藻酸鈉與水溶液混合，產(chǎn)生具有約1000- 3500厘沲的粘度的包囊培養(yǎng)基。
34.權(quán)利要求32的方法，其中細(xì)胞包囊混合物具有約1000- 3500厘沲粘的粘度。
35.權(quán)利要求32的方法，其中包囊培養(yǎng)基具有3.0%或更低重量/體積的藻酸鈉濃度。
36.權(quán)利要求32的方法，其中包囊培養(yǎng)基具有2.5%或更低重量/體積的藻酸鈉濃度。
37.權(quán)利要求32的方法，其中包囊培養(yǎng)基具有約2.0%重量/體積的藻酸鈉濃度。
38.用于細(xì)胞的包囊化的藻酸鹽珠，該藻酸鹽珠包含: a.3%或更低重量/體積濃度的聚合藻酸鹽；和 b.包囊的細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的藻酸鹽珠，其中藻酸鹽濃度為2.5%或更低重量/體積。
40.權(quán)利要求38的藻酸鹽珠，其中藻酸鹽濃度為約2.0%重量/體積。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK103492563SQ201280017536
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月14日
【發(fā)明者】A·L·貝克勒, J·H·埃文斯四世, C·A·辛格 申請(qǐng)人:地理合成燃料有限責(zé)任公司