專利名稱：眼表潤滑的治療性補(bǔ)充和富集的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及眼部潤滑的處理(management)。具體地說，本發(fā)明涉及用于治療與角膜和結(jié)膜表面受損的(compromised)潤滑有關(guān)的疾病的藥物組合物及使用其的方法。
背景技術(shù)：
蛋白聚糖4(prg4)基因編碼稱作巨核細(xì)胞刺激因子(MSF)、潤滑素(Iubricin)和淺區(qū)蛋白(SZP)的高度糖基化的蛋白(1)。潤滑素最初是從滑液中分離出來的并且證實(shí)在軟骨-玻璃界面具有與滑液類似的體外潤滑能力( 。后來潤滑素被鑒定為滑液成纖維細(xì)胞的產(chǎn)物C3)并且Jay等人還表明其在膠乳-玻璃界面具有邊界潤滑能力(3 9)。隨后表明外顯子6編碼的940個(gè)氨基酸的大的粘蛋白樣(mucin like)結(jié)構(gòu)域內(nèi)0連接的β (1-3) fedGalNAc寡糖(10)部分介導(dǎo)(mediate)這種邊界潤滑能力(8)。SZP最初定位在來自淺區(qū)的外植體軟骨的表面處并從條件介質(zhì)中分離出來(11)。SZP也被證實(shí)在軟骨-玻璃界面具有潤滑能力(1 。這些分子共同稱作PRG4。還表明PRG4存在于滑膜(58)、腱(1 及半月板(14)的表面。此外，已表明PRG4在生理和病理生理濃度下均有助于對接(apposing) 關(guān)節(jié)軟骨表面的邊界潤滑(59)。通過引起人的屈曲指-關(guān)節(jié)病-髖內(nèi)翻-心包炎(CACP)疾病綜合征的突變表明了 prg4的功能重要性。CACP通過屈曲指、非炎性關(guān)節(jié)病和肥厚性滑膜炎，與髖內(nèi)翻畸形、心包炎和胸腔積液顯示(1 。而且，在無PRG4的小鼠中，觀察到軟骨退化和隨后的關(guān)節(jié)失效 (16)。因此，PRG4表達(dá)是健康滑液關(guān)節(jié)的必要組件。PRG4是粘蛋白家族的成員，粘蛋白家族通常大量存在于上皮層上并提供許多功能，包括潤滑和保護(hù)免受微生物的侵入(17)。粘蛋白的功能性質(zhì)通常通過專門的糖基化模式和它們通過分子間二硫鍵形成多聚體的能力來確定(18)，而專門的糖基化模式和它們通過分子間二硫鍵形成多聚體的能力均在慢性病(例如囊性纖維化、哮喘)中改變(17)。從滑液分離的PRG4的生物化學(xué)表征0、19)顯示在0-糖基化中的分子異質(zhì)性，這似乎影響潤滑性質(zhì)(8)。近來，已經(jīng)表明來自?；旱腜RG4除了單體形式之外還作為二硫鍵合的二聚體存在，如N端和C端兩者處保守的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域以及C端未配對的半胱氨酸所表明的(20)。在組織例如滑液關(guān)節(jié)中，潤滑的物理化學(xué)模式已經(jīng)被分為流體膜或邊界。實(shí)施潤滑的模式取決于關(guān)節(jié)組織上的法向力和切向力、這些表面之間切向運(yùn)動(dòng)的相對速率以及載荷和運(yùn)動(dòng)兩者的時(shí)間歷史。摩擦系數(shù)μ提供定量量度，并定義為切向摩擦力與法向力之比。一種類型的流體介導(dǎo)的潤滑模式是流體靜力性的。在開始加載時(shí)和通常長時(shí)間的持續(xù)期間，由于組織的雙相特性，軟骨內(nèi)的間質(zhì)液被加壓；液體也可能通過漏液機(jī)理(mopingmechanism)被迫進(jìn)入關(guān)節(jié)面之間的凹凸部分。因此加壓的間質(zhì)液和截留的潤滑劑池可明顯有助于承受法向載荷而對剪切力的阻力很小，促使μ非常低。而且，在開始加載和/或運(yùn)動(dòng)時(shí)，發(fā)生擠壓膜、流體動(dòng)力和彈性流體動(dòng)力類型的流體膜潤滑，其中加壓、運(yùn)動(dòng)和變形起到將粘性潤滑劑從相對運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)表面之間的間隙中驅(qū)趕出來和/或驅(qū)使粘性潤滑劑通過相對運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)表面之間的間隙的作用。流體壓力/膜與邊界潤滑發(fā)生的相關(guān)程度經(jīng)典地取決于許多因素(31)。當(dāng)潤滑膜可在可以彈性變形的一致(conforming)滑動(dòng)表面之間流動(dòng)時(shí)，發(fā)生彈性流體動(dòng)力潤滑。壓力、表面粗糙度和相對滑動(dòng)速度決定何時(shí)完全流體潤滑開始失效并且潤滑進(jìn)入新的機(jī)制。 隨著速度進(jìn)一步下降，粘附到關(guān)節(jié)表面的潤滑膜開始發(fā)揮作用并發(fā)生混合的潤滑機(jī)制。如果速度再進(jìn)一步下降，并僅保留由幾個(gè)分子組成的超薄潤滑劑層時(shí)，發(fā)生邊界潤滑。因此邊界模式的潤滑通過不隨影響流體膜的形成的因素(例如相對滑動(dòng)速度和軸向載荷)而變化的定常滑動(dòng)期間的摩擦系數(shù)(相對運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)接觸表面之間測得的摩擦力與所施加的法向力之比)來指示(35)。對于關(guān)節(jié)軟骨而言，已經(jīng)得出結(jié)論肯定會發(fā)生邊界潤滑，雖然由流體加壓和其它機(jī)理進(jìn)行補(bǔ)充(36 39)。在邊界潤滑中，通過表面與表面的接觸支撐載荷，并且相關(guān)的摩擦性質(zhì)由潤滑表面分子確定。已經(jīng)提出這種模式是重要的，因?yàn)橄鄬浌菍右钥偯娣e的 10%接觸，并且這可能是發(fā)生大部分摩擦的地方(30)。此外，隨著加載時(shí)間的增加和流體靜壓力的耗散，涂布有潤滑劑的表面相對于加壓流體承受比例越來越高的載荷，因此，這種模式可變得越來越占優(yōu)勢(31、32)。邊界潤滑本質(zhì)上減輕粘滑(31)，因此表現(xiàn)為對定常運(yùn)動(dòng)和開始運(yùn)動(dòng)兩者的阻力下降。后一種情況與長時(shí)間壓縮加載(例如，就坐或站立，體內(nèi))之后承受載荷的關(guān)節(jié)表面相關(guān)(33)。軟骨表面的典型磨損模式(34)也表明，關(guān)節(jié)軟骨的邊界潤滑對于保護(hù)和維持關(guān)節(jié)表面結(jié)構(gòu)而言是非常重要的。隨著加載時(shí)間的增加和流體靜壓力的耗散，涂布有潤滑劑的表面相對于加壓流體承受比例越來越高的載荷，因此，μ可通過這種潤滑模式變得越來越占優(yōu)勢。邊界模式的潤滑通過不隨影響流體膜的形成的因素(例如相對滑動(dòng)速度和軸向載荷)而變化的定?；瑒?dòng)期間的μ值來指示。邊界潤滑本質(zhì)上減輕粘滑，因此表現(xiàn)為對定常運(yùn)動(dòng)和開始運(yùn)動(dòng)兩者的阻力下降。PRG4在滑液中和關(guān)節(jié)表面處的積累很可能是PRG4邊界潤滑能力的關(guān)鍵的功能決定因素。近來，證實(shí)與自由溶脹或靜態(tài)壓縮的培養(yǎng)物相比，動(dòng)態(tài)剪切加載培養(yǎng)的軟骨外植體產(chǎn)生顯著的三倍分泌的PRG4(27)。在存在生理調(diào)節(jié)物的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的和病理疾病 (condition)下，這種軟骨細(xì)胞的PRG4合成和分泌可顯著有助于滑液內(nèi)PRG4的濃度(23)。 雖然結(jié)合到表面的PRG4的量似乎與分泌速率不相關(guān)，但是之前的研究表明表面結(jié)合的 PRG4可以與滑液中的內(nèi)源PRG4交換(25)，特別是在機(jī)械擾動(dòng)的影響下Q6、27)。對關(guān)節(jié)內(nèi)、特別是關(guān)節(jié)表面處PRG4代謝的空間和時(shí)間方面的說明將促進(jìn)理解PRG4對關(guān)節(jié)軟骨的低摩擦性質(zhì)的貢獻(xiàn)，并且可能導(dǎo)致治療以防止這種功能的喪失00、41)。有關(guān)不同分子量的各種PRG4分子的處理、以及潛在的額外功能或替代功能，更多是有待確定的(10、27、28、 61)。而且，刺激關(guān)節(jié)表面附近軟骨細(xì)胞中PRG4表達(dá)的化學(xué)和機(jī)械因素的組合對于由分離的具有潤滑功能和生物活性的表面的亞群09)產(chǎn)生組織工程改造的軟骨可能是有利的。目前不知道生物界面處邊界潤滑的確切機(jī)理。然而，蛋白聚糖4(PRG4)在關(guān)節(jié)連結(jié)中可作為邊界潤滑劑發(fā)揮關(guān)鍵作用。這種分泌的糖蛋白被認(rèn)為是保護(hù)軟骨表面免受摩擦力、細(xì)胞粘附和蛋白沉積。已經(jīng)分離和表征了各種天然和重組的潤滑素蛋白和同種型 (isoform)。例如，美國專利 No. 5，326，558 ；No. 6，433，142 ；No. 7，030223 和 No. 7，361，738 公開了人巨核細(xì)胞刺激因子(MSF)的家族以及含有一種或多種這種MSF的用于治療疾病狀態(tài)或病癥例如血小板缺乏癥的藥物組合物。美國專利No. 6，960，562和6，743，774也公開了包含基本上純的MSF片段的潤滑多肽tribonectin，以及通過全身施用或者直接向組織施用tribonectin來潤滑關(guān)節(jié)或其它組織的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在各種實(shí)施方式中提供用于處理眼部潤滑的藥物組合物及使用該藥物組合物處理眼部潤滑的方法，所述處理眼部潤滑包括眼表(ocular surface)處邊界潤滑分子的治療性補(bǔ)充和富集。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中描述的是以下研究結(jié)果，PRG4mRNA在人角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞以及小鼠淚腺和瞼板腺中表達(dá)，這表明PRG4蛋白存在于眼表上的這些組織中。在本發(fā)明的某些情況中描述的是以下研究結(jié)果，PRG4蛋白在眼表上所起的作用是保護(hù)角膜和結(jié)膜免受在眼瞼眨眼、接觸鏡佩戴和其它不良疾病期間產(chǎn)生的明顯剪切力。 淚膜的影響，包括炎癥、促炎細(xì)胞因子、性類固醇失調(diào)和蛋白酶對膜的組成和功能的影響顯示促進(jìn)邊界潤滑的眼部組織的治療過程。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供適合于局部施用至眼表的藥物組合物，其包含懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4蛋白。本發(fā)明的藥物組合物還可包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。本發(fā)明中考慮的示例性眼可接受的緩和劑包括，但不限于羧甲基纖維素鈉(例如約0. 2 2. 5% w/v)、羥乙基纖維素(例如約0. 2 2. 5% w/v)、羥丙甲纖維素(例如約 0. 2 2. 5% w/v)、甲基纖維素(例如約0. 2 2. 5% w/v)、右旋糖苷70 (例如約0. 1% w/ ν)、明膠(例如約0. 01% w/v)、甘油(例如約0. 2 1 % w/v)、聚乙二醇300 (例如約0. 2 1% w/v)、聚乙二醇400(例如約0. 2 w/v)、聚山梨醇酯80 (例如約0. 2 w/v)、 丙二醇(例如約0. 2 1 % w/v)、聚乙烯醇(例如約0. 1 4% w/v)、聚乙烯吡咯酮(例如約0. 1 2% w/v)。本發(fā)明中考慮的示例性眼可接受的賦形劑/軟化劑包括，但不限于無水羊毛脂(例如約1 10% w/v)、羊毛脂(例如約1 10% w/v)、輕質(zhì)礦物油(例如，( 約50% w/v)、礦物油(例如，彡約50% w/v)、石蠟(例如，彡約5% w/v)、凡士林(例如，( 約100% w/v)、白色軟膏(例如，彡約100% w/v)、白凡士林(例如，彡約100% w/v)、白蠟 (例如，彡約5% w/v)、黃蠟(例如，彡約5% w/v)。本發(fā)明中考慮的示例性眼可接受的收斂劑包括，但不限于硫酸鋅(例如約0. 25%W/v)。本發(fā)明中考慮的示例性眼可接受的血管收縮劑包括，但不限于鹽酸麻黃堿(例如約0. 123% w/v)、鹽酸萘唑啉(例如約0. 01 約 0. 03% w/v)、鹽酸脫羥腎上腺素(例如約0. 08 約0. 2% w/v)和鹽酸四氫唑啉(例如約 0. 01 約 0. 05% w/v)。在這些之中的一些實(shí)施方式中，緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑、軟化劑和電解質(zhì)提供以眼可接受的方式遞送PRG4蛋白的手段。如果眼可接受的組合物在施用時(shí)沒有不可接受的眼睛毒性、灼燒、搔癢、粘性、視力模糊等，則它們適合對眼表局部施用。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物還包含治療有效濃度的一種或多種其它治療劑，包括但不限于透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸和磷脂。示例性磷脂包括但不限于L-α - 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供適合對眼表局部施用的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在摩爾滲透壓濃度約300m0SmS/L的眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4蛋白，所述眼可接受的平衡鹽溶液包含至少三種電解質(zhì)，所述電解質(zhì)包括但不限于氯化鈉(NaCl)O. 64%、氯化鉀(KCl)O. 75%、氯化鈣二水合物(CaCl2 · 2Η20)0· 048%、氯化鎂六水合物(MgCl2 · 6Η20)0. 03%、醋酸鈉三水合物(C2H3NaA · 3Η20)0. 39%、脫水檸檬酸鈉 (C6H5Na3O7 · 2Η20) 0. 17%、氫氧化鈉和/或鹽酸(調(diào)節(jié)ρΗ至約7. 5)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供適合對眼表局部施用的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在摩爾滲透壓濃度約300m0SmS/L的眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4蛋白，所述眼可接受的平衡鹽溶液由約128mM的鈉(Na+)、約24mM的鉀(K+)、約113mM 的氯(CF)、約0. 4mM的鈣(Ca2+)、約0. 3mM的鎂(Mg2+)、約5mM的HCOf、約ImM的檸檬酸根、 約14mM的磷酸根、約15mM的醋酸根、以及氫氧化鈉和/或鹽酸(ρΗ調(diào)節(jié)為約7. 5)組成。本發(fā)明還提供在有需要的個(gè)體中治療眼部潤滑不足或與其有關(guān)的癥狀的方法。所述方法包括對所述有需要的個(gè)體的眼表局部施用包含治療有效濃度的PRG4蛋白的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，將包含PRG4蛋白的所述藥物組合物與眼可接受的配制物組合施用，所述眼可接受的配制物包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。在一些實(shí)施方式中，將包含PRG4蛋白的所述藥物組合物與以上討論的包含治療有效濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸、或者表面活性磷脂的眼可接受的溶液組合施用。而在某些實(shí)施方式中，將包含PRG4蛋白的所述藥物組合物與磷酸鹽緩沖鹽水溶液或以上討論的包含一種或多種電解質(zhì)的眼可接受的平衡鹽溶液組合施用。本發(fā)明提供治療由于眼部邊界環(huán)路中的淚液損失或不穩(wěn)定淚膜引起的眼部潤滑不足或與其有關(guān)的癥狀，例如雄激素缺乏癥、Sj0gren綜合征和干燥性角結(jié)膜炎(KCS)的方法。這樣的方法包括向有需要的患者的眼表局部施用本發(fā)明的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供用于解決和治療與不利的或不足的眼部潤滑有關(guān)的疾病的方法。示例性疾病包括，但不限于淚液生成不足或蒸發(fā)性干眼病(aqueous or evaporative dry eye disease)、Sj0gren綜合征、干燥性角結(jié)膜炎、雄激素缺乏癥、 瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術(shù)、變態(tài)反應(yīng)、減少的淚膜破裂時(shí)間、變態(tài)反應(yīng)、眼表病癥、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎癥、高摩爾滲透壓濃度 (hyperοsmo 1 arity)禾口老化。


圖1代表眼表邊界潤滑中的反饋環(huán)路。圖2說明人角膜上皮細(xì)胞中的PRG4mRNA表達(dá)。從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細(xì)胞。通過使用Agilent 2100BioanalyZer篩選存在PRG4產(chǎn)物的擴(kuò)增樣品。豎直欄含有L.麗階梯；1.沒有模板對照；2.來自33歲女性的角膜組織；4.來自70 歲女性的培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞；6.來自53歲男性的培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞。
圖3說明人結(jié)膜上皮細(xì)胞中的PRG4mRNA表達(dá)。從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細(xì)胞。通過使用瓊脂糖凝膠電泳篩選存在PRG4產(chǎn)物的擴(kuò)增樣品。豎直欄含有1. MW階梯；2.沒有模板對照；4.女性人結(jié)膜；5.男性人結(jié)膜。圖4說明人角鞏膜邊緣組織樣品中的PRG4mRNA表達(dá)。L.從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細(xì)胞。使用Agilent 2100BioanalyZer篩選存在PRG4產(chǎn)物的擴(kuò)增樣品。豎直欄含有MW階梯；1.人肝臟cDNA標(biāo)準(zhǔn)；2.來自M歲女性的角鞏膜邊緣組織； 3.來自51歲女性的角鞏膜邊緣組織；4.人結(jié)膜上皮細(xì)胞。圖5說明人結(jié)膜印記細(xì)胞樣品(impression cytology sample)中的PR(MmRNA表達(dá)。從男性和女性供體分離結(jié)膜印記細(xì)胞樣品。使用Agilent 2100BioanalyZer篩選存在 PRG4產(chǎn)物的擴(kuò)增樣品。豎直欄含有L. MW階梯；1-9.結(jié)膜印記細(xì)胞樣品；10.人結(jié)膜上皮細(xì)胞的重復(fù)(圖3中的欄4)。圖6說明摩擦試驗(yàn)示意圖。將角膜眼表(605)固定到惰性(inert)非滲透性半剛性橡膠塞式圓柱體(603)(半徑r = 6mm)的球面端。將該塞式圓柱體(603)附接于力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(Bose ELF 3200)的旋轉(zhuǎn)致動(dòng)器形成下關(guān)節(jié)面。環(huán)(601)(外徑=3. 2_，內(nèi)徑= 1. 5mm)從眼瞼(604)沖壓。將該環(huán)(601)附接于與軸向載荷(N)和扭轉(zhuǎn)(τ )載荷單元耦合的線性致動(dòng)器，形成上關(guān)節(jié)面。通過在塞式圓柱體(603)的周圍緊固惰性管形成潤滑劑浴(602)。ω是角頻率。圖7說明添加PRG4蛋白(潤滑素)時(shí)體外眼瞼/角膜動(dòng)摩擦的減少。圖8說明添加PRG4蛋白(潤滑素)之后1分鐘測量的體外眼瞼/角膜動(dòng)摩擦的減少。圖9說明添加PRG4蛋白(潤滑素)之后5分鐘測量的體外眼瞼/角膜動(dòng)摩擦的減少。圖10說明添加PRG4蛋白(潤滑素)之后體外眼瞼/角膜動(dòng)摩擦隨時(shí)間的減少。
具體實(shí)施例方式在本文的某些實(shí)施方式中提供，在需要治療的個(gè)體中治療眼部潤滑不足(例如， 眼部邊界潤滑不足)或與其有關(guān)的癥狀的方法，包括對所述個(gè)體的眼表局部施用包含治療有效量的PRG4蛋白的藥物組合物。在本文的一些實(shí)施方式中還提供包含在眼可接受的配制物中的PRG4蛋白的藥物組合物。在具體實(shí)施方式
中，本文提供適合對眼表局部施用的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效量的PRG4，并且該藥物組合物還可與一種或多種眼可接受的試劑組合，所述眼可接受的試劑選自眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。在本文的一些實(shí)施方式中提供用于治療眼表處眼部潤滑不足(例如眼部邊界潤滑不足，如降低的或不良的眼部邊界潤滑)的藥物組合物及使用該藥物組合物進(jìn)行所述治療的方法。本發(fā)明某些實(shí)施方式的藥物組合物包含與一種或多種眼科試劑組合的懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的分離或純化的PRG4蛋白，所述眼用試劑選自眼用緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑和軟化劑。在一些實(shí)施方式中，本文提供的任何藥物組合物均進(jìn)一步包含用于局部施用的藥物可接受載體中的一種或多種選自以下的額外治療劑透明質(zhì)酸鈉、表面活性磷脂和電解質(zhì)。本發(fā)明在某些實(shí)施方式中提供處理眼部潤滑的新途徑，包括眼表處邊界潤滑分子的治療性補(bǔ)充和富集。應(yīng)注意，在眼科界中迄今為止并沒有認(rèn)識到眼部邊界潤滑的重要性和機(jī)理。多年來，矯形外科研究界中的科學(xué)共識是流體動(dòng)力潤滑是到目前為止關(guān)節(jié)軟骨潤滑的最主要的模式，而邊界潤滑只是事后才有的想法。而且，研究軟骨表面邊界潤滑的那些研究者提出，邊界潤滑很可能只在“高載荷和低速”下是重要的，這與眼表的狀況相反，在眼表存在相對低的軸向載荷和相對快的滑動(dòng)速度。參見例如(54)。而且，迄今為止還沒有考慮涉及角膜多糖包被(glyocalyx)的邊界潤滑。Jay等人比較了來自牛滑液的純化潤滑因子與“來自人下頌下的唾液和經(jīng)刺激的淚液的粘質(zhì)糖蛋白”，并總結(jié)出“由淚腺分泌的粘蛋白不潤滑”，忽視了角膜上皮是潤滑劑的來源或者邊界潤滑在眼表是重要的貢獻(xiàn)者的可能性。參見例如(55)。最近的淚膜動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型也忽略了邊界潤滑的可能性，主張對于淚膜的高度進(jìn)行“潤滑近似”，從而“可以認(rèn)為角膜上的粘液層為水膜提供不滑移的表面”并且“應(yīng)注意該模型僅預(yù)測[淚膜]厚度達(dá)到該模型失效時(shí)的某一臨界薄的值之前的演化”。 參見例如(57)。需要處理眼部潤滑并保護(hù)角膜和結(jié)膜免受由本文所述的不良疾病所產(chǎn)生的顯著剪切力，所述不良疾病以非限制性實(shí)例的方式包括淚液生成不足或蒸發(fā)性干眼病、Sj0gren 綜合征、干燥性角結(jié)膜炎、雄激素缺乏癥、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術(shù)、變態(tài)反應(yīng)、減少的淚膜破裂時(shí)間、變態(tài)反應(yīng)、眼表病癥、淚膜中和眼表處的提高的蛋白酶水平、慢性炎癥、高摩爾滲透壓濃度和老化。在一些情況下，角膜和結(jié)膜的載荷很可能由剪切力支配。在某些情況下，眼瞼眨眼以及接觸鏡佩戴在眼表上皮細(xì)胞上產(chǎn)生顯著的應(yīng)力，特別是存在受損的淚膜時(shí)更是如此。 如圖1所示，其表明增大的剪切應(yīng)力導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定性、蒸發(fā)性淚液損失、高摩爾滲透壓濃度、溶脹壓力變化和剪切應(yīng)力的反饋提高。在某些情況下，增大的剪切應(yīng)力也被認(rèn)為促進(jìn)炎癥、雄激素缺乏癥和蛋白聚糖的表達(dá)下降。在某些情況下，增大的剪切應(yīng)力及其后遺癥可隨著時(shí)間導(dǎo)致眼表處的邊界潤滑的損失。可通過任何合適的方法確定眼部潤滑不足以及與其有關(guān)的癥狀。在一些情況下， 定性(例如，感覺到低潤滑、干眼、不適等)或定量(例如，通過力學(xué)、生物化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或其它定量測定方法測量)地確定眼部潤滑不足以及與其有關(guān)的癥狀。在某些情況下，在眼部邊界潤滑的不良疾病中，將存在受損的淚膜，所述不良疾病例如由淚液生成不足或蒸發(fā)性干眼病、Sj0gren綜合征、干燥性角結(jié)膜炎、雄激素缺乏癥、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術(shù)、變態(tài)反應(yīng)、減少的淚膜破裂時(shí)間、變態(tài)反應(yīng)、眼表病癥、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎癥、高摩爾滲透壓濃度和老化所導(dǎo)致的那些。在這些之中的一些情況下，提高的蒸發(fā)可妨礙有效的流體膜潤滑，但是容許邊界潤滑和分子犧牲機(jī)理來減少細(xì)胞表面處的剪切應(yīng)力。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提出，眼表處的邊界潤滑分子的治療性補(bǔ)充和富集將中斷反饋環(huán)路，而與眼部潤滑不足有關(guān)的不良疾病通過該反饋環(huán)路促進(jìn)眼表窘迫。在某些情況下，如本文所述，PRG4蛋白在眼睛中作為邊界潤滑劑起到重要的作用。 在一些情況下，這種分泌的糖蛋白保護(hù)眼表，從而保護(hù)角膜和結(jié)膜免受在眼瞼眨眼、接觸鏡佩戴以及由慢性炎癥和高摩爾滲透壓濃度所引起的任何其它不良眼部邊界潤滑過程中所產(chǎn)生的顯著剪切力，所述慢性炎癥和高摩爾滲透壓濃度是由于干眼病、雄激素缺乏癥、雌激素替代療法、受損的淚膜、變態(tài)反應(yīng)、老化、眼表疾病以及淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平所引起的。鑒于帶電分子中機(jī)電相互作用與滲透壓之間的關(guān)系，本發(fā)明在一些實(shí)施方式中提供用于處理眼部潤滑不足的藥物組合物，所述藥物組合物通過中斷反饋機(jī)理來調(diào)節(jié)眼表的高摩爾滲透壓濃度或摩爾滲透壓濃度，所述反饋機(jī)理阻止分泌的成分降低摩擦系數(shù)和減輕剪切應(yīng)力。在另一示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征是眼部邊界潤滑的犧牲機(jī)理，通過該犧牲機(jī)理表面結(jié)合受體可逆地結(jié)合一種或多種凝膠形成或表面活性劑構(gòu)建體(construct)。 在一些情況下，凝膠形成或表面活性劑構(gòu)建體在剪切活動(dòng)中脫離，從而防止剪切應(yīng)力到達(dá)上皮表面(或減小到達(dá)上皮表面的剪切應(yīng)力)。在某些實(shí)施方式中，在短暫的剪切活動(dòng)之后，凝膠形成和表面活性劑構(gòu)建體容許回到它們未受到干擾的平衡，再次與表面結(jié)合受體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，整個(gè)構(gòu)建體可在剪切期間脫離?？梢韵胂?，在某些情況下這種平衡的熱力學(xué)將隨著剪切幅度的增大而提高從受體釋放的概率，但是任何一種締合都是容易可逆的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將包含懸浮在眼可接受的平衡溶液中的PRG4蛋白的藥物組合物局部施用到眼表，其中PRG4蛋白締合或結(jié)合到該眼表。在該實(shí)施方式的某些情況下，PRG4起到表面結(jié)合受體的作用，其被容許與淚膜內(nèi)的蛋白聚糖和內(nèi)源蛋白相互作用以建立犧牲機(jī)理，從而在眼表減小眼瞼眨眼期間的摩擦，防止眼表處的蛋白吸附，并減少由于淚膜的不穩(wěn)定性弓I起的干燥斑點(diǎn)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，PRG4以與一種或多種透明質(zhì)酸和磷脂構(gòu)建體組合的方式局部施用并締合或結(jié)合到眼表。在該實(shí)施方式的某些情況下，PRG4起到表面結(jié)合受體的作用，其與外源供給的透明質(zhì)酸和/或磷脂相互作用以建立犧牲機(jī)理，從而在眼表減小眼瞼眨眼期間的摩擦，防止眼表處的蛋白吸附，并減少由于淚膜的不穩(wěn)定性引起的干燥斑點(diǎn)。在該實(shí)施方式中，透明質(zhì)酸和磷脂構(gòu)建體在剪切活動(dòng)期間與PRG4解離。在又一實(shí)施方式中，整個(gè)構(gòu)建體在剪切活動(dòng)期間脫離以防止剪切應(yīng)力到達(dá)上皮。在再一實(shí)施方式中，PRG4的功能片段、多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體等)、 同源物或直向同源物(ortholog)在犧牲機(jī)理中起到表面受體和/或凝膠形成構(gòu)建體的作用。PRG4的功能片段和同源物包括在中心粘蛋白樣KEPAPTT-重復(fù)(SEQ ID NO 4)結(jié)構(gòu)域中具有較少重復(fù)序列的那些、糖基化和非糖基化形式的蛋白、剪接變體、重組體形式等。根據(jù)以定性的、力學(xué)的、光學(xué)的、電的方式或通過生物化學(xué)測定進(jìn)行的測量，PRG4的潤滑片段呈現(xiàn)人PRG4的至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的眼潤滑效果。如本文所使用的術(shù)語“PRG4”、"PRG4蛋白”或“蛋白聚糖4”蛋白可與術(shù)語“潤滑素”蛋白互換地使用。本文所使用的PRG4還涵蓋UCL/HGNC/HUG0人基因命名(Human Gene Nomenclature)數(shù)據(jù)庫所接受的術(shù)語巨核細(xì)胞刺激因子(MSF)、和淺區(qū)蛋白(SZP)。如本文所使用的PRG4或潤滑素蛋白是指任何分離的或純化的天然或重組潤滑素蛋白、同源物、功能片段或基序、同種型、和/或其突變體。在某些實(shí)施方式中，分離的或純化的PRG4蛋白包括人天然或重組潤滑素蛋白的氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，分離的或純化的PRG4蛋白包括由PRG4基因外顯子編碼的氨基酸序列，該P(yáng)RG4基因外顯子編碼全長PRG4蛋白或同種型的一級結(jié)構(gòu)。蛋白聚糖4(PRG4)基因含有12個(gè)外顯子。本文所使用的PRG4蛋白包括由PRG4基因外顯子1 12，更優(yōu)選外顯子6 12且最優(yōu)選外顯子9 12編碼的氨基酸序列。如本文所使用的PRG4蛋白包括現(xiàn)在已知的或者以后描述的任何PRG4蛋白。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的PRG4蛋白氨基酸序列在SEQ ID NO :1中提供。PRG4蛋白以至少 60%的同源性，優(yōu)選75%的同源性，更優(yōu)選85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性享有任何已知PRG4蛋白或同種型的一級氨基酸結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的 PRG4蛋白具有50kDa 400kDa的平均摩爾質(zhì)量，包括PRG4蛋白的一個(gè)或多個(gè)生物活性部分、或其功能片段(例如潤滑片段)、或其同源物。如本文所使用的PRG4蛋白包括蛋白的生物活性部分。如本文所使用的PRG4蛋白的“生物活性部分”包括蛋白的功能片段，其包含與所述蛋白的氨基酸序列充分同源或者源自所述蛋白的氨基酸序列，其包括比全長蛋白少的氨基酸，并呈現(xiàn)全長蛋白的至少一種活性。典型地，生物活性部分包括具有蛋白的至少一種活性的功能結(jié)構(gòu)域或基序。蛋白的生物活性部分可以是多肽，其為例如長度10、25、50、100、200或更多的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，PRG4蛋白的生物活性部分可以單獨(dú)或者與用于治療不良的或降低的眼部邊界潤滑的其它治療劑組合用作治療劑。在例如Turner 等人的美國專利 No. 5，326，558 ；6，433，142 ；7，030，223 ； 7，361，738以及Jay等人的美國專利No. 6，743，774和6，960，562中公開了若干天然和重組 PRG4或潤滑素蛋白的核酸和氨基酸序列、以及PRG4蛋白和各種同種型的表征。Flarmery 等人的美國公開No. 20070191268也公開了可用于本發(fā)明的重組PRG4或潤滑素分子。PRG4蛋白的分離、純化和重組表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是公知的。在某些實(shí)施方式中，所述方法以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)例如PCR或RT-PCR克隆和分離編碼PRG4蛋白或同種型的cDNA和mRNA開始。然后，將編碼PRG4蛋白或同種型的分離的cDNA克隆到表達(dá)載體中，并進(jìn)一步在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化和表達(dá)，從而產(chǎn)生重組PRG4蛋白。如本文中所用的“重組”是指體外合成的或者以其它方式操作的多核苷酸(例如 “重組多核苷酸”)，是指使用重組多核苷酸在細(xì)胞或其它生物體系中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法， 或者是指由重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白”)?！爸亟M”還包括將具有來自不同來源的各種編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)域或啟動(dòng)子序列的核酸連接成表達(dá)盒或載體，用以表達(dá)(例如，誘導(dǎo)型或組成型表達(dá))包含使用本發(fā)明的引物擴(kuò)增的核酸序列和PRG4基因的活性結(jié)構(gòu)域的融合蛋白ο在某些實(shí)施方式中，PRG4蛋白編碼核酸可含有一個(gè)或多個(gè)突變、缺失或插入。在這樣的實(shí)施方式中，PRG4蛋白編碼核酸與野生型PRG4蛋白編碼核酸具有至少60%的同源性，優(yōu)選75%的同源性，更優(yōu)選85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。如本文所使用的術(shù)語“cDNA”包括與細(xì)胞中存在的mRNA分子互補(bǔ)的DNA或者可使用酶例如逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA的生物體mRNA。在某些實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域中公知的 RT-PCR方法從人角膜或結(jié)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)的PRG4mRNA中分離編碼PRG4蛋白的cDNA。如本文所使用的術(shù)語“多核苷酸”、“核酸/核苷酸”和“寡核苷酸”可互換地使用， 并且包括任何長度的聚合形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其類似物。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可發(fā)揮任何已知或未知的功能。下列是多核苷酸的非限制性實(shí)例基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酶、 DNA、cDNA、基因組DNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重組的或其任意組合。多核苷酸可包括修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話， 對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在聚合物的裝配之前或之后賦予?？捎梅呛塑账峤M分中斷核苷酸的序列。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾，如通過與標(biāo)記組分接合。該術(shù)語還包括雙鏈和單鏈分子兩者。除非另有說明或者需要，作為多核苷酸的本發(fā)明的任何實(shí)施方式涵蓋雙鏈形式以及已知或預(yù)計(jì)組成雙鏈形式的兩個(gè)互補(bǔ)單鏈形式中的每一個(gè)。如本文所使用的術(shù)語“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。多核苷酸由四種核苷酸堿基的特定序列組成腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及代替胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)(當(dāng)多核苷酸為RNA，而不是DNA時(shí))。這種字母表示可以輸入到計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫中并用于生物信息應(yīng)用，例如功能基因組和同源性檢索。如本文所使用的術(shù)語“分離的多核苷酸/cDNA”包括與天然來源的多核苷酸中存在的其它多核苷酸分子分離的多核苷酸分子。例如，關(guān)于基因組DNA，術(shù)語“分離的”包括與基因組DNA天然關(guān)聯(lián)的染色體分離的多核苷酸分子。優(yōu)選地，“分離的”多核苷酸不含天然地位于得到所述多核苷酸的生物體的基因組DNA中的多核苷酸側(cè)翼的序列(即，位于目標(biāo)多核苷酸的5’端和3’端的序列)。例如，在多種實(shí)施方式中，在本發(fā)明中使用的編碼PRG4蛋白的分離的多核苷酸分子可含有小于約5吐、4吐、31^、21^、11^、0. 51Λ或0. Ikb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位于得到所述多核苷酸的細(xì)胞的基因組DNA中多核苷酸分子的側(cè)翼。而且，“分離的”多核苷酸分子，例如cDNA分子，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，可基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)其通過化學(xué)方式合成時(shí)，可基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。如本文所使用的“基因”包括含有至少一個(gè)在轉(zhuǎn)錄和翻譯后能夠編碼特定多肽或蛋白的可讀框的多核苷酸。本文中所述的任何多核苷酸序列也可用于鑒定與它們有關(guān)的基因的較大片段或全長編碼序列。分離較大片段序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如本文所使用的“天然的或天然存在的”多核苷酸分子包括例如具有天然存在的核苷酸序列 (例如，編碼天然蛋白)的RNA或DNA分子。如本文所使用的術(shù)語“多肽”或“蛋白”是可互換的，并且包括兩個(gè)或更多個(gè)亞基氨基酸、氨基酸類似物或肽模擬物(P^tidomimetic)的化合物。所述亞基可通過肽鍵連接。 在另一實(shí)施方式中，所述亞基可通過其它鍵，例如酯、醚等連接。如本文所使用的術(shù)語“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光異構(gòu)體兩者，以及氨基酸類似物和肽模擬物。三個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽通常稱作寡肽。超過三個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽鏈稱作多肽或蛋白。在某些實(shí)施方式中，如本文所使用的PRG4蛋白是指在人或其它宿主細(xì)胞中天然或重組表達(dá)的PRG4蛋白或其各種同源物或同種型。如本文所使用的“表達(dá)(express)”或 “表達(dá)(expression)”包括多核苷酸轉(zhuǎn)錄為RNA和/或翻譯為多肽的過程。如果多核苷酸是源自基因組DNA的，當(dāng)選擇合適的真核宿主時(shí)，表達(dá)可包括RNA的剪接。表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件包括結(jié)合RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列和用于核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄起始序列。例如，細(xì)菌表達(dá)載體包括啟動(dòng)子例如Iac啟動(dòng)子以及用于轉(zhuǎn)錄起始的Siine-Dalgarno序列和起始密碼子AUG。類似地，真核表達(dá)載體包括RNA聚合酶II的異源或同源啟動(dòng)子、下游聚腺苷酸化信號、起始密碼子AUG和用于核糖體脫離的終止密碼子。這樣的載體可商購獲得或者通過本領(lǐng)域公知的方法例如以下所述通常用于構(gòu)建載體的方法中所述序列進(jìn)行裝配而獲得。如本文所使用的術(shù)語“載體”包括將插入的多核苷酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中和/或在宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的自我復(fù)制的核酸分子。該術(shù)語意在包括主要功能是將核酸分子插入到細(xì)胞中的載體、主要功能是復(fù)制核酸的復(fù)制載體、以及功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達(dá)載體。 該術(shù)語還意在包括提供多于一種的以上功能的載體。如本文所使用的“宿主細(xì)胞”意在包括任何個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以是或者已經(jīng)是載體用受體或者用于引入外源多核苷酸和/或多肽的受體。其還意在包括單個(gè)細(xì)胞的后代。由于天然的、偶然的或故意的突變，后代可不必與原始親代細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)或者基因組或總DNA互補(bǔ)體方面)。細(xì)胞可以是原核的或真核的，包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于鼠類、 大鼠、猿猴或人細(xì)胞。如本文所使用的“宿主細(xì)胞”還包括遺傳修飾細(xì)胞。術(shù)語“遺傳修飾細(xì)胞”包括含有和/或表達(dá)外來或外源基因或多核苷酸序列的細(xì)胞，而所述外來或外源基因或多核苷酸序列又改變細(xì)胞或其后代的基因型或表型?！斑z傳修飾”還包括含有或表達(dá)已經(jīng)被引入到細(xì)胞中的基因或多核苷酸序列的細(xì)胞。例如，在該實(shí)施方式中，遺傳修飾細(xì)胞已經(jīng)引入有對該細(xì)胞而言也是內(nèi)源性的基因。術(shù)語“遺傳修飾”還包括對細(xì)胞的內(nèi)源核苷酸的任何添加、缺失或破壞。如本文所使用的“宿主細(xì)胞”可為表達(dá)人PRG4蛋白的任何細(xì)胞。如本文所使用的“同源物”在本文中定義為分別具有類似的或基本上相同的核酸或氨基酸序列的兩個(gè)核酸或肽。術(shù)語“同源物”還涵蓋由于遺傳密碼的簡并性而不同于核苷酸序列之一而編碼相同的氨基酸序列的核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源物包括編碼PRG4蛋白的核酸(例如，SEQ IDNO=I)的等位基因變體、直向同源物、橫向同源物 (paralog)、激動(dòng)劑以及拮抗劑。如本文所使用的術(shù)語“直向同源物”是指來源于不同的物種但由共同的祖先基因通過物種形成進(jìn)化而來的兩個(gè)核酸。通常，直向同源物編碼具有相同或類似功能的肽。具體地說，本發(fā)明的直向同源物與任何已知的PRG4蛋白(例如，SEQ ID NO :1)、其同種型或類似物的所有或部分的氨基酸序列通常呈現(xiàn)出至少80 85%，更優(yōu)選85 90%或90 95%，且最優(yōu)選95%、96%、97%、98%或甚至99 %的同一性，或100 %的序列同一性，并且呈現(xiàn)出與這些肽類似的功能。為了確定兩個(gè)氨基酸序列的百分序列同一性，以進(jìn)行最佳比較為目的進(jìn)行序列比對(例如，為了與其它多肽或核酸進(jìn)行最佳比對，可在一個(gè)多肽的序列中引入缺口)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸殘基。當(dāng)一個(gè)序列中的位置被與另一序列中相應(yīng)位置處的相同的氨基酸殘基占據(jù)時(shí)，則分子在該位置處是相同的。在兩個(gè)核酸序列之間可以進(jìn)行相同類型的比較。兩個(gè)序列之間的百分序列同一性是所述序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù) (即，百分序列同一性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)X100)。優(yōu)選地，本發(fā)明中包括的分離的氨基酸同源物與任何已知PRG4蛋白的整個(gè)氨基酸序列(例如，SEQ ID NO 1)是至少約50 60 %，優(yōu)選至少約60 70 %，且更優(yōu)選至少約70 75 %、75 80 %、80 85 %、85 90 % 或90 95%，且最優(yōu)選至少約96%、97%、98%、99%或更高相同的。在某些實(shí)施方式中，編碼PRG4蛋白的分離的核酸同源物包括與編碼這種PRG4蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO 1)至少約40 60%，優(yōu)選至少約60 70%，更優(yōu)選至少約70 75%、75 80%、80 85%、85 90%或90 95%，甚至更優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高相同的核苷酸序列。兩個(gè)核酸或肽序列之間百分序列同一性的確定是本領(lǐng)域中公知的。例如，可使用 Vector NTI 6. 0 (PC)軟件包anforMax，Bethesda，MD)來確定兩個(gè)核酸或肽序列之間的百分序列同一性。在該方法中，使用15的缺口開放罰分(gap opening penalty)和6. 66的缺口延伸罰分(gap extension penalty)來確定兩個(gè)核酸之間的百分同一性。使用10的缺口開放罰分和0. 1的缺口延伸罰分來確定兩個(gè)多肽的百分同一性。所有其它參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)設(shè)置。為了進(jìn)行多重比對(Clustal W算法)，使用blosum 62矩陣，缺口開放罰分為10， 而缺口延伸罰分為0. 05。應(yīng)理解，當(dāng)比較DNA序列和RNA序列時(shí)，為了確定序列同一性，胸腺嘧啶核苷酸相當(dāng)于尿嘧啶核苷酸。而且，本文所使用的PRG4蛋白包括由與編碼PRG4蛋白的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼的PRG4蛋白。如本文所使用的“雜交”包括其中一種或多種多核苷酸反應(yīng)以形成通過核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵鍵合而穩(wěn)定化的復(fù)合物的反應(yīng)。所述氫鍵鍵合可通過Watson-Crick堿基配對、Hoogstein結(jié)合或以任何其它序列特異性方式發(fā)生。所述復(fù)合物可包含兩條形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的鏈、三條或更多條形成多鏈復(fù)合物的鏈、單獨(dú)的自雜交鏈、或這些的任意組合。雜交反應(yīng)可構(gòu)成更廣泛的過程中的一個(gè)步驟，例如PCR反應(yīng)的起始，或核糖體對多核苷酸的酶切割。雜交反應(yīng)可在不同的嚴(yán)格條件下進(jìn)行。本發(fā)明包括能夠在降低的嚴(yán)格條件下、更優(yōu)選在嚴(yán)格條件下、且最優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件下與編碼本文所述PRG4蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指在IOx Denhart溶液，6xSSC、0. 5% SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中，在60°C過夜的雜交。印記在62°C依次在下述中各洗滌 30 分鐘:3xSSC/0. 1% SDS，然后是 lxSSC/0. 1% SDS，最后為 0. lxSSC/0. 1% SDS。在某些實(shí)施方式中，如本文所使用的短語“嚴(yán)格條件”還指在6xSSC溶液中在65°C的雜交。在其它實(shí)施方式中，“高度嚴(yán)格條件”是指在IOx Denhart溶液，6xSSC、0. 5% SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中在65°C過夜的雜交。印記在65°C依次在下述中各洗滌30分鐘3xSSC/0. 1% SDS, 然后是lxSSC/0. 1% SDS，最后為0. lxSSC/0. 1% SDS。核酸雜交的方法在本領(lǐng)域是公知的。 因此，由本文使用的核酸編碼的PRG4蛋白包括與編碼人PRG4蛋白的多核苷酸序列(例如， SEQ ID NO 1)或其特異性同種型或同源物具有至少60%同源性，優(yōu)選75%同源性，更優(yōu)選 85%，更優(yōu)選90%，最優(yōu)選95%、96%、97%、98%、99%同源性的核酸。而且，本文使用的PRG4蛋白還可以是嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所使用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括可操作地與第二多肽連接的第一多肽。嵌合蛋白可任選地包括可操作地與第一或第二多肽連接的第三、第四或第五或其它多肽。嵌合蛋白可包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的多肽。嵌合蛋白可包含相同多肽的多個(gè)拷貝。嵌合蛋白還可在一個(gè)或多個(gè)多肽中包含一個(gè)或多個(gè)突變。產(chǎn)生嵌合蛋白的方法在本領(lǐng)域是公知的。在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，嵌合蛋白是PRG4蛋白與其它PRG4蛋白同種型的嵌合體。如本文所使用的“分離的”或“純化的”蛋白、多核苷酸或分子意為從它們天然存在的環(huán)境中移出；或基本上不含細(xì)胞物質(zhì)，如來自得到所述蛋白多核苷酸或分子的細(xì)胞或組織源的其它污染蛋白；或化學(xué)合成時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。表述“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括從由其分離或重組產(chǎn)生或合成的細(xì)胞的細(xì)胞組分中分離的制備物(preparation)。在某些實(shí)施方式中，表述“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括具有少于約30% (按干重計(jì))的其它蛋白(在本文中也稱為“污染蛋白”)，更優(yōu)選少于約20%、還更優(yōu)選少于約 10%、以及最優(yōu)選少于約5%的其它蛋白的PRG4蛋白的制備物。當(dāng)?shù)鞍谆蚨嗪塑账釣橹亟M產(chǎn)生時(shí)，還優(yōu)選其基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基少于約20%、更優(yōu)選少于約10%、且最優(yōu)選少于約5%的目標(biāo)蛋白制備物的體積。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供藥物組合物，該藥物組合物適于將與一種或多種眼可接受的試劑組合的懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的藥物有效濃度的PRG4蛋白局部施用于有需要的個(gè)體的眼表。所述眼可接受的試劑可選自眼可接受的緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑和軟化劑。如本文所使用的術(shù)語“有效濃度或有效量”或“治療有效濃度或治療有效量”意為表示無毒的而足以提供期望治療效果的PRG4蛋白或其它治療劑的濃度或量。有效的濃度或量隨受試者不同而不同，取決于個(gè)體的年齡和一般狀況、特定試劑等。 因此，并非總是可以規(guī)定精確的有效濃度或有效量。然而，任何個(gè)體案例中的合適的有效濃度或有效量可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段來確定。而且，引入到本發(fā)明組合物或劑型中的PRG4蛋白和其它治療劑的精確有效濃度或有效量并不重要，只要該濃度在這樣的范圍內(nèi)，該范圍足以允許溶液或配制物(formulation)立即施用從而遞送在治療有效范圍內(nèi)的量的PRG4蛋白和其它活性劑。在某些實(shí)施方式中，PRG4蛋白的藥物有效濃度在10 lOOOOyg/mL，優(yōu)選 50 500mg/mL，且更優(yōu)選100 300mg/mL。如本文所使用的，包括眼可接受的緩和劑、 賦形劑、收斂劑、血管收縮劑和軟化劑的眼可接受的試劑完整地定義于Code of Federal Regulations 21CFR349 中。如本文所使用的術(shù)語“局部施用”以其常規(guī)含意使用，是指將包含PRG4蛋白和一種或多種眼可接受的試劑的組合物遞送到眼部。一般而言，局部施用通過用于滴眼劑或灌洗的液體配制物實(shí)現(xiàn)，并提供局部效果。在某些實(shí)施方式中，任何本文所述的藥物組合物包含以下的一種或多種或者將或可將前述眼可接受的試劑與以下的一種或多種組合羧甲基纖維素鈉(例如約0. 2 約 2. 5% w/v)、羥乙基纖維素(例如約0. 2 約2. 5% w/v)、羥丙甲纖維素(例如約0. 2 約 2. 5% w/v)、甲基纖維素(例如約0. 2 約2. 5% w/v)、右旋糖酐70 (例如約0. 1 % w/v)、 明膠(例如約0. 01% w/v)、甘油(例如約0. 2 約1 % w/v)、聚乙二醇300 (例如約0. 2 約1 % w/v)、聚乙二醇400 (例如約0. 2 約1 % w/v)、聚山梨醇酯80 (例如約0. 2 約1 % w/v)、丙二醇(例如約0. 2 約1 % w/v)、聚乙烯醇(例如約0. 1 約4% w/v)、聚乙烯吡咯酮(例如約0. 1 約2% w/v)、硫酸鋅(例如約0. 25% w/v)、無水羊毛脂(例如約1 約10% w/v)、羊毛脂(例如約1 約10% w/v)、輕質(zhì)礦物油(例如，≤約50% w/v)、礦物油(例如，≤約50% w/v)、石蠟(例如，≤約5% w/v)、凡士林(例如，≤約100% w/v)、白色軟膏(例如，≤約100% w/v)、白凡士林(例如，≤約100% w/v)、白蠟(例如，≤約5% w/v)、黃蠟(例如，≤約5% w/v)、鹽酸麻黃堿(例如約0. 123% w/v)、鹽酸萘唑啉(例如約 0. 01 約0. 03% w/v)、鹽酸脫羥腎上腺素(例如約0. 08 約0. 2% w/v)和鹽酸四氫唑啉 (例如約0. 01 約0. 05% w/v)。在某些實(shí)施方式中，本文所使用的百分量是按重量計(jì)的百分量。在其它實(shí)施方式中，包含與上面討論的一種或多種眼可接受的試劑組合的PRG4蛋白的本發(fā)明的藥物組合物還包含10 ΙΟΟΟΟΟμ g/mL、優(yōu)選500 5000mg/mL的治療有效濃度的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鈉。此外，本發(fā)明的藥物組合物還包含10 10000 μ g/mL的一種或多種表面活性磷脂，這樣的表面活性磷脂包括但不限于，L- α - 二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (DPPC)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(Sp)、或其它中性和極性脂質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物還可包含一種或多種藥物可接受的載體或媒介物 (vehicle)，其包括任何可接受的物質(zhì)、和/或任何一種或多種本領(lǐng)域已知的添加劑。如本文所使用的術(shù)語“載體”或“媒介物”指適于局部藥物施用的載體物質(zhì)?？捎糜诒疚牡妮d體和媒介物包括任何本領(lǐng)域已知的這樣的物質(zhì)，所述物質(zhì)是無毒的，且不與組合物中的其它組分以有害的方式相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種添加劑可包括在所述組合物中。 例如，溶劑，包括相對少量的醇類，可用于溶解某些藥物物質(zhì)。其它可任選的添加劑包括遮光劑、抗氧化劑、香味劑、著色劑、膠凝劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑等。還可以添加其它試劑，如抗微生物劑，以防止在儲藏時(shí)腐敗，即，抑制微生物如酵母和霉菌的生長。合適的抗微生物劑通常選自對羥基苯甲酸的甲酯和丙酯(即，尼泊金(paraben)甲酯和丙酯)、苯甲酸鈉、山梨酸、咪唑烷基脲(imidurea)及其組合。還可以將滲透促進(jìn)劑和/或緩解刺激的添加劑包括在本發(fā)明的藥物組合物中。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物在藥物可接受的載體中制備，所述藥物可接受的載體例如磷酸鹽緩沖鹽水或淚液電解質(zhì)的滲透平衡的鹽溶液，所述淚液電解質(zhì)包括以下的一種或多種約44% 約摩爾分?jǐn)?shù)的氯化鈉、約8% 約14%摩爾分?jǐn)?shù)的氯化鉀、約8% 約18%摩爾分?jǐn)?shù)的碳酸氫鈉、約0% 約4%摩爾分?jǐn)?shù)的碳酸氫鉀、約0% 約4%摩爾分?jǐn)?shù)的氯化鈣、約0% 約4%摩爾分?jǐn)?shù)的氯化鎂、約0% 約4%摩爾分?jǐn)?shù)的檸檬酸三鈉、以及約0 % 約20 %摩爾分?jǐn)?shù)的鹽酸或約0 % 約20 %摩爾分?jǐn)?shù)的氫氧化鈉。在某些實(shí)施方式中，可配制藥物載體以產(chǎn)生約150 200mM的電解質(zhì)水溶液。本發(fā)明中也涵蓋其它適用于局部施用的合適劑型，如軟膏劑(ointment)、乳膏劑(cream)、凝膠劑、糊劑等。在某些實(shí)施方式中，電解質(zhì)在與PRG4組合時(shí)提供合適的滲透平衡，使得溶液為眼可接受的。本發(fā)明還提供在需要的個(gè)體中治療降低的或不良的眼部邊界潤滑、與其有關(guān)的癥狀、或者與眼部潤滑不足有關(guān)的或?qū)е卵鄄繚櫥蛔愕募膊〉姆椒?，包括將包含治療有效量的PRG4蛋白的藥物組合物局部施用至有需要的個(gè)體的眼表。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括局部施用包含治療有效量的PRG4蛋白的藥物組合物，所述PRG4蛋白懸浮于磷酸鹽緩沖的鹽水溶液或包含一種或多種電解質(zhì)的眼可接受的平衡鹽溶液中。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括局部施用包含PRG4蛋白的藥物組合物，其配制為包含一種或多種以上討論的其它眼可接受的試劑的眼可接受的配制物。如本文所使用的術(shù)語“治療”指降低癥狀的嚴(yán)重程度和/或頻率、消除癥狀和/或根本起因(underlying cause)、預(yù)防癥狀和/或它們的根本起因的發(fā)生、以及改善或補(bǔ)救損傷。術(shù)語“治療”還涵蓋易感個(gè)體中病癥的預(yù)防以及臨床上出現(xiàn)癥狀的個(gè)體中病癥的治療。在某些實(shí)施方式中，降低的眼部邊界潤滑是由眼部邊界回路中增加的蒸發(fā)性淚液損失或不穩(wěn)定的淚膜而導(dǎo)致的。這種降低的或不良的眼部邊界潤滑與以下有關(guān)淚液生成不足或蒸發(fā)性干眼病、Sj0gren綜合征、干燥性角結(jié)膜炎(KCS)、雄激素缺乏癥、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術(shù)、變態(tài)反應(yīng)、減少的淚膜破裂時(shí)間、受損的淚膜、眼表病癥、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎癥、高摩爾滲透壓濃度和老化。如上所討論的，增大的剪切應(yīng)力導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定性、蒸發(fā)性淚液損失、高摩爾滲透壓濃度、溶脹壓力變化以及剪切應(yīng)力的反饋提高。增大的剪切應(yīng)力還促進(jìn)炎癥、雄激素缺乏癥和蛋白聚糖的表達(dá)減少。隨時(shí)間增大的剪切應(yīng)力及其后遺癥導(dǎo)致眼表處的邊界潤滑的損失。因此，本發(fā)明提供通過在眼表處補(bǔ)充和富集蛋白聚糖如PRG4蛋白的表達(dá)而減少剪切應(yīng)力，從而預(yù)防或增加眼部邊界潤滑的方法。在整個(gè)本申請中，引用了多種出版物。所有這些出版物以及這些出版物所引用的那些參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均全部引入本申請作為參考，以更加全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。還應(yīng)理解上述內(nèi)容涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，且對其可進(jìn)行許多改變而不背離本發(fā)明的范圍。本發(fā)明由以下實(shí)施例進(jìn)一步說明，所述實(shí)施例決不應(yīng)解釋為對本發(fā)明范圍施加限制。相反，應(yīng)清楚地理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀了本文的說明書之后，會想到可訴諸各種其它實(shí)施方式、其改型方式和等同方式，而不背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。根據(jù)下述對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是明晰的。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在閱讀了所附的說明書和實(shí)施例之后，本發(fā)明的這些以及許多其它變型和實(shí)施方式將是明晰的。實(shí)施例實(shí)施例1人角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞中PRG4mRNA的表達(dá)從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細(xì)胞。將細(xì)胞或者直接處理(η =8)，或者先在不含酚紅的角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(n =幻。在手術(shù)過程中獲得球結(jié)膜(n = 2)、結(jié)膜印記細(xì)胞樣品(n = 9)、培養(yǎng)后永生化的人結(jié)膜上皮細(xì)胞(n = 1)、 NOD小鼠淚腺(n = 5成體小鼠/性別，10腺體/樣品)和BALB/c小鼠瞼板腺(n = 7成體小鼠/性別，來自觀個(gè)眼瞼的腺體/樣品)。這些樣品通過主要使用RT-PCROi= 18人，全部小鼠)和Affymetrix GeneChips (n = 4人角膜)進(jìn)行處理以進(jìn)行PRG4mRNA的分析。用于PCR的PRG4引物跨越IlAp的內(nèi)含子序列，以抑制污染性的染色體DNA的擴(kuò)增(表1)。 使用瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100Bioanalyzer篩選存在PRG4產(chǎn)物的擴(kuò)增樣品。為了確 ilHirii1 子白勺身I， Massachusetts Eye and Ear Infirmary DNASequencing Center for Vision Research (Bonston, MA)使用 3100Genetic Analyzer 對來自角膜樣品(η = 2)、結(jié)膜上皮細(xì)胞(η = 1)和人肝臟標(biāo)準(zhǔn)物(n = 1)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并用GenBank數(shù)據(jù)庫的BLASTn檢索對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。表1.為PRG4mRNA的RT-PCR分析設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物
物種定向核苷酸序列(5，-3，)外顯子擴(kuò)增子大小(bp)
人有義 GATGCAGGGTACCCCAAA(SEQ ID NO: 2)9-12526
反義 CAGACTTTGGATAAGGTCTGCC(SEQ ID NO: 3)
證實(shí)PRG4mRNA存在于所有人角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞以及印記細(xì)胞樣品中。通過DNA 序列分析確證了 PRG4PCR產(chǎn)物的身份(表2)。結(jié)果顯示PRG4在人角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。表2.來自人角膜、結(jié)膜和肝臟樣品的擴(kuò)增子序列的鑒定
測序方向與人PRG4比對的堿基對來自擴(kuò)增子的總堿基對BLASTn檢索身份人肝臟標(biāo)準(zhǔn)物
A正向495500人 PRG4A反向488491人 PRG4B正向496499人 PRG4B反向498500人 PRG4人角膜(24歲女性)A正向497499人 PRG4A反向490492人 PRG4B正向500504人 PRG4B反向498501人 PRG4
人角膜(51歲女性)
A正向498499人 PRG4A反向474489人 PRG4B正向496498人 PRG4B反向490491人 PRG4
人結(jié)膜上皮細(xì)胞
A正向 A反向 B正向 B反向
496 490
499 492
人 PRG4 人 PRG4
495 474
499 491
人 PRG4 人 PRG4對每個(gè)制備物的兩個(gè)不同的樣品(A和B)進(jìn)行正向和反向測序。人角膜樣品為來自女性供體角鞏膜邊緣的上皮細(xì)胞。人PRG4的基因登錄號為NM_005807。實(shí)施例2通過添加PRG4 (潤滑素)降低體外摩擦對臨床相關(guān)界面如眼表-眼瞼和眼表-接觸鏡界面的體外摩擦試驗(yàn)如下所述。目前缺乏能夠定量評價(jià)人造眼淚液的潤滑能力的臨床相關(guān)方法。對合成的(例如，膠乳和玻璃)或非眼部的“天然”表面(例如，臍帶靜脈區(qū)段)的摩擦試驗(yàn)可促進(jìn)在關(guān)節(jié)聯(lián)接/眨眼期間發(fā)生的一些，但很可能不是全部的分子相互作用。事實(shí)上，對使用非組織界面獲得的數(shù)據(jù)的相關(guān)性尚不清楚。已顯示“盤上環(huán)”(armulus-on-disk)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)配置對于研究關(guān)節(jié)軟骨-軟骨界面處的邊界潤滑是理想的。邊界模式的潤滑通過不隨影響流體膜形成的因素(包括滑動(dòng)速度和軸向載荷)變化的動(dòng)摩擦來指示。這是因?yàn)榘l(fā)生表面與表面的接觸，并且表面結(jié)合分子有助于潤滑(通過減少摩擦和磨損)。發(fā)現(xiàn)邊界潤滑在眼表處是關(guān)鍵的和起作用的機(jī)理，這與在關(guān)節(jié)軟骨表面處一樣。因此，對之前為研究關(guān)節(jié)軟骨-軟骨界面處的邊界潤滑而開發(fā)并表征的體外摩擦試驗(yàn)進(jìn)行改型以用于研究眼表-眼瞼和眼表-接觸鏡界面。為了確定邊界潤滑在眼表-眼瞼和眼表-接觸鏡界面占優(yōu)勢的試驗(yàn)條件，檢查摩擦性質(zhì)對軸向載荷和滑動(dòng)速度的依賴性。從Lions Eye Bank of Alberta獲得正常的新鮮人眼表(切除的角膜，帶有 3mm的鞏膜)。將切除的角膜在4°C儲藏于Optisol-GS中并在胃Ml^H吏ffl。 University of Calgary Body Donation Program^H^tB 1-3 H ^ 眼瞼(年齡60-80歲)，并立即使用或使用前在-20°C在鹽水中儲藏最多2周。比較用潤滑劑由以下組成作為陰性對照的 Lens Plus Sterile Saline Solution (Advanced Medical Optics)；作為試驗(yàn)潤滑劑的Systane Lubricant Eye Drops (Alcon Laboratories) > Refresh Tears Lubricant Eye Drops (Allergan)、Aquify⑧ Long Lasting Comfort Drops (CIBAVision)禾口 Blink ⑧ Tears Lubricant Eye Drops (Advanced Medical Optics)。摩擦試驗(yàn)的示意圖示于圖6。通過將超級膠水(super glue)施用于鞏膜，將角膜眼表(605)固定在惰性非滲透性半剛性橡膠塞式圓柱體(603)(半徑r = 6mm)的球面端。 該塞式圓柱體(603)附接于力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(BoseELF 3200)的旋轉(zhuǎn)致動(dòng)器，從而形成下關(guān)節(jié)面。環(huán)(601)(外徑=3. 2mm,內(nèi)徑=1. 5mm)從眼瞼(604)沖壓，并附接于與軸向載荷(N) 和扭轉(zhuǎn)(τ)載荷單元耦合的線性致動(dòng)器，從而形成上關(guān)節(jié)面。潤滑劑浴(60 通過在塞式圓柱體(603)的周圍緊固惰性管而形成。樣品首先在鹽水中進(jìn)行試驗(yàn)，然后在三C3)種試驗(yàn)潤滑劑中的一種中進(jìn)行試驗(yàn)。 將潤滑劑浴用 0. 3ml填充，并使關(guān)節(jié)面與潤滑劑平衡。緩慢地(0.05mm/s)使樣品表面接觸并壓縮直至球形塞變平且整個(gè)環(huán)狀眼瞼表面與角膜(60 接觸。所得的法向應(yīng)力(由軸向載荷根據(jù)Ν/π |r%K5-r2W5計(jì)算，單位為MPa)可通過使用不同剛度的橡膠塞而改變以模擬 5kPa的生理應(yīng)力。試驗(yàn)順序?yàn)樵谏硐嚓P(guān)的有效滑動(dòng)線速度veff = 30mm/s (其中 veff = coReff，ω為角頻率，Reff = 2. 4mm是通過對整個(gè)環(huán)狀接觸面積上的剪切應(yīng)力分布進(jìn)行積分而計(jì)算出的有效半徑)下通過旋轉(zhuǎn)+4周(rev)對樣品進(jìn)行預(yù)處理而開始，并旋轉(zhuǎn)-4周而復(fù)原。然后通過以下對樣品進(jìn)行試驗(yàn)以veff = 30、10、1、0. 3然后30mm/s旋轉(zhuǎn) +4周，接著立即旋轉(zhuǎn)-4周，每次旋轉(zhuǎn)之間的停留時(shí)間為12秒。然后以相反的旋轉(zhuǎn)方向重復(fù)該試驗(yàn)順序。為評價(jià)眼表的潤滑性質(zhì)，計(jì)算μ = τ/(ReffN)形式的兩個(gè)摩擦系數(shù)(μ)，其中如上所述τ是轉(zhuǎn)矩，Rrff是有效半徑，N是軸向載荷。反映對運(yùn)動(dòng)開始的阻力的靜摩擦系數(shù)μ 計(jì)算為剛開始旋轉(zhuǎn)后( 10°以內(nèi))μ的峰值。反映對穩(wěn)態(tài)運(yùn)動(dòng)的阻力的平均動(dòng)摩擦系數(shù)<μ 由第三和第四次完整試驗(yàn)旋轉(zhuǎn)過程中平均的μ計(jì)算。在每次試驗(yàn)中對+和-旋轉(zhuǎn)的μ 和<μ 進(jìn)行平均以計(jì)算出對τ測量的潛在的方向影響。數(shù)據(jù)在20Hz的頻率下進(jìn)行收集。在圖7中顯示將潤滑素(PRG4)以100 300 μ g/mL的濃度添加至角膜表面的結(jié)
19果。在所有速度下，潤滑素在眼瞼界面處對于動(dòng)摩擦和靜摩擦均具有降低摩擦的效果。在濃度為透明質(zhì)酸生理濃度的1/10下，潤滑素與含有透明質(zhì)酸的Blink bars Lubrication Eye Drop類似。兩種潤滑劑組合時(shí)比各自單獨(dú)使用時(shí)更佳。圖8證實(shí)與Aquify 滴眼劑相比，在添加潤滑素后的第一分鐘期間測得的體外角膜/眼瞼動(dòng)摩擦減少。在各試驗(yàn)之間，使用鹽水從眼表徹底清洗潤滑劑。當(dāng)將Aquify (具有透明質(zhì)酸)與潤滑素組合使用時(shí)，協(xié)同效應(yīng)(與單獨(dú)的任一者相比μ a降低)明顯。鹽水重復(fù)(saline repeat)低于最初的鹽水對照。這顯示即使在用鹽水清洗后仍保留潤滑素的效果，這表明分子與眼表結(jié)合，且與單獨(dú)的透明質(zhì)酸鈉相比，潤滑素顯示出較優(yōu)的保留時(shí)間。圖9證實(shí)與Aquify 滴眼劑相比，在添加潤滑素后的第五分鐘期間測得的體外角膜/眼瞼動(dòng)摩擦減少。當(dāng)將Aquify (具有透明質(zhì)酸)與潤滑素組合時(shí)，協(xié)同效應(yīng)(與單獨(dú)的任一者相比μ a降低)明顯。在5分鐘后，Aquify 的摩擦系數(shù)回到與鹽水在統(tǒng)計(jì)學(xué)上相等，而潤滑素的摩擦系數(shù)保持較低，潤滑素和透明質(zhì)酸的組合也保持較低。圖10顯示在添加潤滑素后，動(dòng)摩擦系數(shù)隨時(shí)間降低。同樣，持續(xù)的降低表明與眼表結(jié)合O實(shí)施例3體內(nèi)眼部邊界潤滑不足的治療通過以下方式以及客觀體征(sign)檢查抱怨眼表刺激的患者的眼部潤滑或與眼部潤滑不足有關(guān)的疾病測量在McMormies問卷調(diào)查中多于兩個(gè)陽性應(yīng)答、在Ocular Surface Disease Index(OSDI)中得分大于 5 的癥狀，或通過 Visual Analog kale 中一些癥狀的證據(jù)，所述客觀體征包括以下中的一種或多種減少的淚膜破裂時(shí)間(少于 10 秒)、大于308m0SmS/L的差的側(cè)淚液彎月面摩爾滲透壓濃度、低khirmer試紙值(少于 ^ 10mm)、熒光素鈉角膜和結(jié)膜染色(得分>0，具有多個(gè)巨斑(macropimctate))、得自印記細(xì)胞的大量碎片、無論以何種方式確定的瞼板腺功能障礙、接觸鏡在眨眼后的移位率減少、在施加一系列壓力沖擊后接觸鏡的時(shí)空傳遞函數(shù)改變、眨眼后干涉計(jì)量的淚膜舒張率減少、促炎細(xì)胞因子的濃度增加、降低的乳鐵蛋白或溶菌酶濃度、或者眨眼后點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)脫散(decoherence)率增力口?；颊咴诟髦谎劬Φ谋砻媸┯?到2滴含有懸浮于眼可接受的平衡鹽溶液中的 200 μ g/ml PRG4的溶液。指示患者閉眼10秒鐘。隨后的訪問可追蹤到差的側(cè)淚液摩爾滲透壓濃度減少，增加的淚膜破裂時(shí)間，或其它之前提及的體征。特別是如果淚膜摩爾滲透壓濃度從異常值(可能為330m0SmS/L)減少到更正常的值(可能為304m0SmS/L)，可認(rèn)為對眼表潤滑的治療性調(diào)節(jié)和補(bǔ)充是成功的。參考文獻(xiàn)1. G. D. Jay, Curr Opin Orthop 15,355(2004).2. D. A. Swann, R. B. Hendren, Ε. L. Radin, S. L. Sotman, Ε. Α. Duda, Arthritis Rheum 24,22(1981).3. G. D. Jay, D. Ε. Britt, D. -J. Cha, J Rheumatol 27,594(2000).4. G. D. Jay, Connect Tissue Res 28,71(1992).
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權(quán)利要求
1.一種適合于局部施用至眼表的藥物組合物，其包含懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含10 10，000μ g/mL的治療有效濃度的PRG4。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含50 500μ g/mL的治療有效濃度的raG4。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，包含治療有效濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含10 100，000μ g/mL的治療有效濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含500 5000μ g/mL的治療有效濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含治療有效濃度的選自以下的表面活性磷脂: L-α - 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含10 10，000μ g/mL的治療有效濃度的表面活性磷脂。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述眼可接受的平衡鹽溶液包含至少三種不同的選自以下的電解質(zhì)磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氯化鈣、氯化鎂、醋酸鈉、 檸檬酸鈉、鹽酸和氫氧化鈉。
11.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4具有50kDa 400kDa的平均摩爾質(zhì)量。
12.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4包括潤滑片段、其多聚體或同源物。
13.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4是重組PRG4蛋白或其功能片段。
14.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4是經(jīng)純化的天然存在的PRG4蛋白。
15.在需要治療的個(gè)體中治療眼部潤滑不足或與其有關(guān)的癥狀的方法，包括對所述需要治療的個(gè)體的眼表局部施用包含治療有效濃度的PRG4的藥物組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與眼可接受的配制物組合施用，所述眼可接受的配制物包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑、眼可接受的軟化劑和眼可接受的電解質(zhì)。
17.權(quán)利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與包含治療有效濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸的眼可接受的溶液組合施用。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述眼可接受的溶液包含10 100，000μ g/mL的治療可接受濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述眼可接受的溶液包含500 5，000μ g/mL的治療可接受濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸。
20.權(quán)利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與包含治療有效濃度的表面活性磷脂的眼可接受的溶液組合施用，所述表面活性磷脂選自L- α - 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述眼可接受的溶液包含10 10，000μ g/mL的治療有效濃度的表面活性磷脂。
22.權(quán)利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與至少包含磷酸鈉和氯化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水溶液組合施用。
23.權(quán)利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與眼可接受的平衡鹽溶液組合施用，所述眼可接受的平衡鹽溶液包含一種或多種選自以下的電解質(zhì)氯化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氯化鈣、氯化鎂、檸檬酸三鈉、鹽酸和氫氧化鈉。
24.權(quán)利要求15的方法，其中所述PRG4是重組PRG4蛋白或其功能片段。
25.權(quán)利要求15的方法，其中所述PRG4是經(jīng)純化的天然存在的PRG4蛋白。
26.權(quán)利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與包含治療有效濃度的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸和表面活性磷脂的眼可接受的溶液組合施用，所述表面活性磷脂選自 L-α - 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。
27.權(quán)利要求15的方法，其中所述需要治療的個(gè)體具有與以下有關(guān)的眼部邊界潤滑不足淚液生成不足或蒸發(fā)性干眼病、Sj0gren綜合征、干燥性角結(jié)膜炎、雄激素缺乏癥、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術(shù)、變態(tài)反應(yīng)、減少的淚膜破裂時(shí)間、受損的淚膜、變態(tài)反應(yīng)、眼表病癥、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎癥、高摩爾滲透壓濃度、老化或其組合。
28.用于治療個(gè)體中與眼部潤滑不足有關(guān)的或引起眼部潤滑不足的疾病、或者其癥狀的方法，所述方法包括向所述個(gè)體的眼表局部施用包含治療有效濃度的PRG4的藥物組合物。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中包含PRG4的所述藥物組合物與眼可接受的配制物組合施用，所述眼可接受的配制物包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑、眼可接受的軟化劑、眼可接受的電解質(zhì)、眼可接受的透明質(zhì)酸鈉或透明質(zhì)酸以及眼可接受的表面活性磷脂。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述疾病選自淚液生成不足或蒸發(fā)性干眼病、Sj0gren綜合征、干燥性角結(jié)膜炎、雄激素缺乏癥、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術(shù)、 變態(tài)反應(yīng)、減少的淚膜破裂時(shí)間、受損的淚膜、變態(tài)反應(yīng)、眼表病癥、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎癥、高摩爾滲透壓濃度、老化及其組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療眼部邊界缺陷、與其有關(guān)的癥狀、或者不良疾病的藥物組合物及使用其的方法。所述組合物包含人PRG4蛋白、潤滑片段、其同源物或同種型，并且可任選地包含一種或多種選自以下的試劑緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑、軟化劑、透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸、或表面活性磷脂。
文檔編號A61K31/16GK102164593SQ200980126381
公開日2011年8月24日 申請日期2009年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者坦寧·A·施密特, 戴維·A·沙利文, 本杰明·沙利文 申請人:司科彭斯眼部研究學(xué)會