專利名稱：一種產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株及利用其發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)聚蘋果酸[poly (β-L- malic acid), PMLA]的菌株以及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸[poly (β-L- malic acid)，PMLA]是以蘋果酸為唯一單體、相互通過酯鍵聯(lián)接而成的一種特殊的脂肪族聚酯，它是天然多聚物中新近開發(fā)的一種生物多聚物。 PMLA是以蘋果酸為基本結(jié)構(gòu)單元，以一個(gè)蘋果酸分子的-OH和另一個(gè)蘋果酸分子的α或 β -COOH連接而成。目前發(fā)現(xiàn)有3種結(jié)構(gòu)的PMLA α型、β型和Υ型三種聚蘋果酸可以通過化學(xué)的或生物的方法合成，目前兩種方法都在研究中。通過學(xué)合成可以得到3種類型聚蘋果酸；而從微生物細(xì)胞中分離的聚蘋果酸有β型一種。聚蘋果酸含有很多自由羧基和非對稱碳原子，具有良好的水溶性，生物可降解性， 生物相容性和生物可吸收性。這些性質(zhì)使得聚蘋果酸及其衍生物在制藥、醫(yī)學(xué)、食品和化妝品領(lǐng)域有很重要的應(yīng)用。目前已經(jīng)涉及應(yīng)用的領(lǐng)域包括藥物載體及微膠囊材料、生物醫(yī)學(xué)材料如固體藥物外包裝、滲析袋、醫(yī)療器械附加高分子涂層、組織工程的支架材料等、化妝產(chǎn)品輔料等。目前聚蘋果酸的制備主要有化學(xué)合成法和生物合成法兩種。生物合成法采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸。聚β-L-聚蘋果酸可以由各種各樣的黏菌和絲狀真菌合成。短梗霉屬菌株合成較低等分子量的聚蘋果酸，分子量約為llKDa，由黏菌合成的聚蘋果酸分子量約為50 300KDa。短梗霉屬菌株生產(chǎn)的聚蘋果酸產(chǎn)量很高，菌株A/r⑶如Μ Τ/ sp.以葡萄糖、丁二酸銨分別為碳氮源，添加適量的丁二酸，CaCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，得到的發(fā)酵液中含量為47 g/Ι聚蘋果酸。普魯蘭多糖是短梗霉屬菌株生產(chǎn)聚蘋果酸時(shí)產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，同時(shí)很多短梗霉屬菌株還產(chǎn)生大量黑色素。由黏菌產(chǎn)生的聚蘋果酸產(chǎn)量相對較低，最大3.3g/l。另外，生物合成的聚蘋果酸具有高度的光學(xué)純度，均為聚-L-蘋果酸?；瘜W(xué)合成法有直接聚合法和開環(huán)聚合法。一般來說，直接聚合得到的主要是Y 型聚蘋果酸，其相對分子質(zhì)量比較低，最大只有51(徹，且催化劑有毒性，較難分離得到產(chǎn)物。開環(huán)聚合法得到的聚蘋果酸相對分子質(zhì)量較大，最大可以達(dá)到174KDa。由于目前研究關(guān)注的熱點(diǎn)是在微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然β型聚蘋果酸，而β型的聚蘋果酸只有內(nèi)酯開環(huán)法可以合成，但該方法形成內(nèi)酯的步驟較多、且產(chǎn)率太低，中間產(chǎn)物分離提純步驟繁瑣，反應(yīng)對于原料和裝置都有很高要求，導(dǎo)致了高成本，這些制約了該方法的實(shí)際應(yīng)用。生物法合成聚蘋果酸可以利用可再生的生物資源發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉，合成條件溫和，產(chǎn)物的分子量相對較高，從發(fā)酵液中提取純化步驟簡單，通過甲醇或乙醇反復(fù)沉淀就可以得到聚蘋果酸鈣鹽。因此生物法合成具有很大優(yōu)勢，但其開發(fā)和應(yīng)用受到了高成本，低效率的制約，目前還沒有一個(gè)優(yōu)化的可以工業(yè)化生產(chǎn)的路線，只有少量的天然聚蘋果酸和人工合成聚蘋果酸可以提供。如果能夠提高天然聚蘋果酸的產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，其應(yīng)用
3領(lǐng)域?qū)玫竭M(jìn)一步開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株，是從植物葉片表面篩選得到的不產(chǎn)生黑色素的菌株， 分類命名為出芽短梗霉，拉丁文學(xué)名為(Aureobasidium pullulans)ZD-3D,該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC No. 4605。保藏日期 2011. 2.對，保藏單位地址中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明所述的菌株其形態(tài)特征為菌落表面粘稠，最初為白色，逐漸變?yōu)楹谏吘売芯z伸入瓊脂內(nèi)部，沒有氣生菌絲?？僧a(chǎn)生橢圓形酵母樣芽生孢子，厚壁孢子，腫脹孢子和菌絲。通過將該菌株的rDNA的ITS序列和其他真菌的比對，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的菌株為出芽短梗霉{Aureobasidium pullulans )。利用產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，包括以下步驟
1)取25°C培養(yǎng)48 60h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環(huán)，接種于液體種子培養(yǎng)基，裝液量為500ml三角瓶中3(T60ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為16(T220rpm，2(T30°C培養(yǎng)48 80h得到種子液；
上述的種子培養(yǎng)基為:4(Tl60g/l碳源，0. 5 4g/l氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 · 7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 · 7Η20，0· 5 2g/l 玉米菜，10 30g/l 碳酸鈣；
2)將制備好的種子液按59TlO%比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量500ml三角搖瓶中 3(T60ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為16(T220rpm，25°C，培養(yǎng)10(Tl80h ；或者將制備好的種子液接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為發(fā)酵罐容積的40-70%，接種量59TlO%，溫度25°C，通氣量 0. 2 0. 4m3/h，轉(zhuǎn)速 20(T400rpm，發(fā)酵時(shí)間 120 180h ；
上述的發(fā)酵培養(yǎng)基:10(Tl60g/l 碳源，0. 5 4g/l 氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 ·7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 ·7Η20，0· 5 2g/l 玉米漿，10 40g/l 碳酸鈣；
3)將步驟2)得到的發(fā)酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動(dòng)后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續(xù)加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌，冷凍干燥后得到聚蘋果酸。上述培養(yǎng)基中的碳源可以為葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖或麥芽糖。培養(yǎng)基中的氮源可以為硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、酵母膏、尿素或玉米漿。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中，碳酸鈣可以起調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH的作用。除了調(diào)節(jié)pH外，添加碳酸鈣可以減少副產(chǎn)物普魯蘭多糖的產(chǎn)生，同時(shí)增加聚蘋果酸的產(chǎn)量。碳酸鈣在本培養(yǎng)基中的作用是關(guān)鍵的，使用其他堿性試劑代替碳酸鈣調(diào)節(jié)PH不能起到相同的效果。而過量的碳酸鈣會抑制細(xì)胞生長。本發(fā)明得到的聚蘋果酸[poly (β-L- malic acid), PMLA]具有如下性質(zhì)1.易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。2.聚蘋果酸經(jīng)過2M硫酸在90°C水解18 24h后，經(jīng)HPLC檢測，其水解產(chǎn)物為單一
產(chǎn)物蘋果酸。3.聚蘋果酸經(jīng)過紅外光譜測定，具有1172 CnT1 ( - C - 0 - C)和1732 cnT1 ( - C=O) 酯鍵特征吸收峰，1732 cnT1 ( - C=O)和14 cnT1 ( - C - 0)羧基特征吸收峰。聚蘋果酸鹽具有1602 cm—1羧酸鹽吸收峰。4.聚蘋果酸經(jīng)過核磁共振碳譜測定，化學(xué)位移分別為C-I (-C00H-) 175.6， C-2 (-CH0H-)71. 5，C_3 (-CH2-) 35. 8，C-4 (-C0-) 171. 6。5.聚蘋果酸經(jīng)過GPC檢測，Mn，Mw和分散度分別為4247，4631和1. 09。本發(fā)明的有益效果
1.本發(fā)明提供了一種自行篩選的出芽短梗霉菌株(編號為CGMCC No. 4605)，可以高效的發(fā)酵產(chǎn)生聚蘋果酸(PMLA)。2.本發(fā)明所提供的菌株不產(chǎn)生黑色素，發(fā)酵液為白色，有利于簡化后期處理工藝。3.本發(fā)明所提供的方法通過加入碳酸鈣來調(diào)節(jié)副產(chǎn)物普魯蘭多糖的產(chǎn)生，提高聚蘋果酸的產(chǎn)量，有利于聚蘋果酸的分離純化。4.本發(fā)明所提供的方法簡單易行，所用的原料簡單，聚蘋果酸產(chǎn)量最高可達(dá)到 5(T60g/l，為商業(yè)化，大規(guī)模生產(chǎn)提供了適合的方法。5.本發(fā)明所得的聚蘋果酸產(chǎn)品為白色，提取方法簡單，產(chǎn)品無毒害，具有良好的水溶性和生物可降解性，可以廣泛應(yīng)用與醫(yī)藥，化妝品或食品行業(yè)。


圖1是發(fā)酵過程曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用以說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
1)取25°C培養(yǎng)48h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環(huán)，接種于液體種子培養(yǎng)基，裝液量為500ml三角瓶中60ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為220rpm，25°C培養(yǎng)4 得到種子液；
2)將制備好的種子液按10%比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量500ml三角搖瓶中60ml 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為220rpm，25°C，培養(yǎng)160h ；
上述的種子培養(yǎng)基為80g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03,0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，20g/l 碳酸鈣；
上述的發(fā)酵培養(yǎng)基:120g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03,0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，30g/l 碳酸鈣。碳酸鈣單獨(dú)滅菌后與已滅菌的其他培養(yǎng)基成分混合。3)將步驟2)得到的發(fā)酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動(dòng)后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續(xù)加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌2次，冷凍干燥后得到聚蘋果酸白色粉末。經(jīng)PMLA產(chǎn)量測定，產(chǎn)量可達(dá)到49. 76g/l。
PMLA產(chǎn)量測定方法如下
聚蘋果酸水溶液加入等體積的2M H2SO4,，90°C水解12h，水解后的蘋果酸含量經(jīng)高效液相色譜分析，色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H，色譜條件流動(dòng)相5mM H2SO4,流速0. 6ml/ min，溫度 45 °C ο實(shí)施例2
1)取25°C培養(yǎng)48h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環(huán)，接種于液體種子培養(yǎng)基，裝液量為500ml三角瓶中60ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為220rpm，25°C培養(yǎng)4 得到種子液；
2)將制備好的種子液按10%比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量500ml三角搖瓶中60ml 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為220rpm，25°C，培養(yǎng)160h ；
上述的種子培養(yǎng)基為:80g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03，0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，20g/l 碳酸鈣。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基:120g/l蔗糖，2g/l 硝酸鈉，0. 04%K2C03,0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，30g/l 碳酸鈣。碳酸鈣單獨(dú)滅菌后與已滅菌的其他培養(yǎng)基成分混合。3)將步驟2)得到的發(fā)酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動(dòng)后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續(xù)加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌2次，冷凍干燥后得到聚蘋果酸白色粉末。經(jīng)PMLA產(chǎn)量測定，產(chǎn)量可達(dá)到53. 65g/l。實(shí)施例3 1)同實(shí)施例1。2)同實(shí)施例1，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基120g/l葡萄糖，2g/l NH4NO3,0. 04%K2C03, 0. 01%ΚΗ2Ρ04，0· 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米漿，30g/l 碳酸鈣。3)同實(shí)施例1。經(jīng)PMLA產(chǎn)量測定，產(chǎn)量可達(dá)到50. 75g/l。實(shí)施例4 1)同實(shí)施例1。2)同實(shí)施例1，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基120g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03, 0. 01%KH2P04,0. 01%MgS04 · 7H20,0. 01% ZnSO4 · 7H20,0. 5g/l 玉米菜，5g/l 富馬酸鈉，30g/l 碳酸鈣。3)同實(shí)施例1。經(jīng)PMLA產(chǎn)量測定，產(chǎn)量可達(dá)到62. 27g/l。實(shí)施例5 1)同實(shí)施例1。2)同實(shí)施例1，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基120g/l木糖，2g/l NH4NO3,0. 04%K2C03, 0. 01%ΚΗ2Ρ04，0· 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米漿，30g/l 碳酸鈣。3)同實(shí)施例1。經(jīng)PMLA產(chǎn)量測定，產(chǎn)量可達(dá)到29. 63g/l。實(shí)施例6 1)同實(shí)施例1。
2)同實(shí)施例1，區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基120g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03， 0. 01%ΚΗ2Ρ04，0· 01%MgS04 ·7Η20，0· 01% ZnSO4 ·7Η20，0· 5g/l 玉米漿，0、10、20、30、40g/l 碳酸鈣(碳酸鈣添加量對PMLA和副產(chǎn)物普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響見表1 )。碳酸鈣單獨(dú)滅菌后與已滅菌的其他培養(yǎng)基成分混合。3)同實(shí)施例1。PMLA產(chǎn)量測定和普魯蘭多糖含量測定 PMLA產(chǎn)量測定方法同實(shí)施例1。普魯蘭多糖采用苯酚-硫酸法測定首先對硅藻土抽濾除菌后的發(fā)酵液用95%的乙醇沉淀多糖，將獲得的多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物， 然后與苯酚生成橙黃色化合物，在490nm處測定光吸收值。以已知含量葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定結(jié)果見表1。隨著碳酸鈣添加量的增加，PMLA產(chǎn)量也增加，當(dāng)添加40g/l碳酸鈣時(shí)，PMLA產(chǎn)量達(dá)到最大45. 42g/l，而副產(chǎn)物多糖產(chǎn)量減少到最少0. 76g/l。表1碳酸鈣添加量對PMLA和副產(chǎn)物普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株，其特征在于該菌株是從植物葉片表面篩選得到的不產(chǎn)生黑色素的菌株，分類命名為出芽短梗霉，拉丁文學(xué)名為(Aureobasidium pullulans)ZD-3D, 該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，，編號為CGMCC No. 4605。
2.用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于包括以下步驟1)取25°C培養(yǎng)48 60h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環(huán)，接種于液體種子培養(yǎng)基，裝液量為500ml三角瓶中3(T60ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為16(T220rpm，2(T30°C培養(yǎng)48 80h得到種子液；上述的種子培養(yǎng)基為:4(Tl60g/l碳源，0. 5 4g/l氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 · 7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 · 7Η20，0· 5 2g/l 玉米菜，10 30g/l 碳酸鈣；2)將制備好的種子液按59TlO%比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量500ml三角搖瓶中 3(T60ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為16(T220rpm，25°C，培養(yǎng)10(Tl80h ；或者將制備好的種子液接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為發(fā)酵罐容積的40-70%，接種量59TlO%，溫度25°C，通氣量 0. 2 0. 4m3/h，轉(zhuǎn)速 20(T400rpm，發(fā)酵時(shí)間 120 180h ；上述的發(fā)酵培養(yǎng)基:10(Tl60g/l 碳源，0. 5 4g/l 氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 ·7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 ·7Η20，0· 5 2g/l 玉米漿，10 40g/l 碳酸鈣；3)將步驟2)得到的發(fā)酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動(dòng)后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續(xù)加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌，冷凍干燥后得到聚蘋果酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖或麥芽糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的方法，其特征在于培養(yǎng)基中的氮源為硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、酵母膏、尿素或玉米漿。
全文摘要
本發(fā)明公開的產(chǎn)生聚蘋果酸的菌株，是從植物葉片表面篩選得到的不產(chǎn)生黑色素的菌株，分類命名為出芽短梗霉，拉丁文學(xué)名為(Aureobasidium pullulans)ZD-3D,該菌株保藏編號為CGMCC No.4605。利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸方法簡單易行，有利于聚蘋果酸的分離純化，產(chǎn)量最高可達(dá)到50~60g/L。
文檔編號C12P7/62GK102220248SQ20111013156
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者張慧莉, 徐志南, 蔡謹(jǐn), 黃磊 申請人:浙江大學(xué)