專利名稱：一種fgfr2基因多態(tài)性檢測(cè)特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種FGFR2基因檢測(cè)特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)廣泛分布于全身，在血管新生、胚胎發(fā)育、骨骼形成及傷口愈合等方面起著非常重要的作用。FGFs的生物學(xué)活性是通過(guò)與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRS)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。FGFRs是一個(gè)多基因家族，屬免疫球蛋白基因超家族成員，共有4個(gè)結(jié)構(gòu)類似的成員FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4，分別由4個(gè)獨(dú)立的基因編碼。由于基因的選擇性剪輯， 每一個(gè)成員又可以分為不同的亞型。FGFR家族成員都是酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞的增殖、分化、血管生成、骨骼發(fā)育及生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的進(jìn)程中起著十分重要的作用。FGFRs的基因突變可導(dǎo)致顱縫早閉、軟骨發(fā)育不良，并與腫瘤發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。成纖維生長(zhǎng)因子受體2 (FGFR2)是FGFR家族的成員，在細(xì)胞生長(zhǎng)，浸潤(rùn)，侵襲和血管生成中都起到重要作用，該基因定位于第10號(hào)染色體，包含至少22個(gè)外顯子。最近，全基因組關(guān)聯(lián)研究識(shí)別出了 FGFR2上與乳腺癌易感性相關(guān)的多個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2基因多態(tài)性可顯著增加高加索人群罹患乳腺癌的危險(xiǎn)性，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明目標(biāo)檢測(cè)的FGFR2基因多態(tài)性位點(diǎn)與中國(guó)婦女乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本發(fā)明目標(biāo)檢測(cè)的FGFR2基因突變位點(diǎn)，如表所示
序號(hào)FGFR2位點(diǎn)突變的內(nèi)容簡(jiǎn)寫(xiě)1SEQ ID N0. 63的第130位核苷酸，發(fā)生C — T突變C130T2SEQ ID N0. 64的第167位核苷酸，發(fā)生T — C突變T167C3SEQ ID N0. 65的第189位核苷酸，發(fā)生T — C突變T189C4SEQ ID N0.冊(cè)的第115位核苷酸，發(fā)生T —C突變T115C5SEQ ID N0. 66的第107位核苷酸，發(fā)生G — A突變G107A6SEQ ID N0. 67的第76位核苷酸，發(fā)生C — T突變C76T7SEQ ID N0. 68的第101位核苷酸，發(fā)生C — T突變C101T8SEQ ID N0. 69的第81位核苷酸，發(fā)生G — A突變G81A 目前，對(duì)FGFR2基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)、分析的方法很多，如直接測(cè)序法、熒光定量 PCR,PCR-RFLP分析法、TaqMan技術(shù)等等，其中最常用的方法有熒光定量PCR和PCR-RFLP分析法。熒光定量PCR具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果快捷、量化等優(yōu)點(diǎn)，但是，該技術(shù)存在樣品易污染， 易發(fā)生交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)；而PCR-RFLP法是基于基因突變?cè)斐傻南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測(cè)酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒(méi)有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因突變檢測(cè)。再次，以上這些方法都存在著檢測(cè)通量的局限性，每次只能檢測(cè)一種突變類型，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，該液相芯片可用于檢測(cè) FGFR2 基因八種常見(jiàn)基因型 C130T、T167C、T189C、T115C、G107A、C76T、ClOlT 和 G81A 的野生型和突變型中的一種或多種。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，主要包括有A.針對(duì)FGFR2基因的八種常見(jiàn)多態(tài)性位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異性 ASPE引物，每種ASPE弓丨物由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)目的基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別選自針對(duì)C130T的SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18、針對(duì) T167C 的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20、針對(duì) T189C 的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID N0. 22、針對(duì) T115C 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24、針對(duì) G107A 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0.洸、針對(duì) C76T 的 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0.沘、針對(duì) C101T 的 SEQ ID N0. 29 和SEQ ID N0. 30、針對(duì)G81A的SEQ ID N0. 31和SEQ ID N0. 32中的一對(duì)或一對(duì)以上；所述 tag序列選自SEQ IDN0. 1 SEQID N0. 16中的序列；B.分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與A中所選tag序列互補(bǔ)配對(duì)，所述anti-tag序列選自SEQ ID N0. 33 SEQ ID N0. 48中的序列， 所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列，上述每種微球具有不同顏色編碼；C.用于擴(kuò)增具有 C130T、T167C、T189C、T115C、G107A、C76T、C101T、G81A 中的一個(gè)或一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，擴(kuò)增出含有多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物選自針對(duì)C130T 的 SEQ ID N0. 49 和 SEQ ID N0. 50、針對(duì) T167C 的 SEQ ID N0. 51 和 SEQ ID N0. 52、針對(duì) T189C 和 T115C 的 SEQ ID N0. 53 和 SEQ ID N0. 54、針對(duì) G107A 的 SEQ ID N0. 55 和 SEQ IDN0. 56、針對(duì) C76T 的 SEQ ID N0. 57 和 SEQ ID N0. 58、針對(duì) C101T 的 SEQ ID N0. 59 和 SEQ ID N0. 60、針對(duì) G81A 的 SEQ ID N0. 61 和 SEQ ID N0. 62 中的一對(duì)或一對(duì)以上。所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。優(yōu)選地，所述特異性ASPE引物分別選自針對(duì)C130T的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 17組成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 18組成的序列、針對(duì)T167C的由SEQ ID N0. 3和SEQID N0. 19組成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 20組成的序列、針對(duì) T189C 的由 SEQ ID N0. 5 和 SEQ ID N0. 21 組成的序列及由 SEQ ID N0. 6 和 SEQ ID N0. 22 組成的序列、針對(duì)T115C的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 23組成的序列及由SEQ ID N0. 8 和SEQ ID N0. 24組成的序列、針對(duì)G107A的由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 25組成的序列及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 26 組成的序列、針對(duì) C76T 的由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ IDNO. 27組成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ IDN0. 28組成的序列、針對(duì)ClOlT的由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 29組成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 30組成的序列、針對(duì) G81A 的由 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 31 組成的序列及由 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 32 組成的序列中的一組以上。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)的特異性引物，主要包括有針對(duì) C130T 的 SEQ ID N0. 17 和 SEQ ID N0. 18、針對(duì) T167C 的 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 20、針對(duì) T189C 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22、針對(duì) T115C 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24、針對(duì) G107A 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26、針對(duì) C76T 的 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0.沘、針對(duì) C101T 的 SEQ ID N0. 29 和 SEQ ID N0. 30、針對(duì) G81A 的 SEQ ID N0. 31 和SEQ ID N0. 32中的一對(duì)以上。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100%。且檢測(cè)所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。由于在非常大量的特異性引物中，經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，反應(yīng)驗(yàn)證，得到最優(yōu)組合的液相芯片系統(tǒng)，所制備的FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)SNP位點(diǎn)的并行檢測(cè)。2.本發(fā)明通過(guò)發(fā)明人長(zhǎng)期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量實(shí)驗(yàn)的操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個(gè)反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)特異性好， 交叉反應(yīng)率低于3% ；除了能夠檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的多態(tài)性情況，檢測(cè)效果一致。3.本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，八種多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)可通過(guò)一步多重PCR即可完成七個(gè)含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷， 同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對(duì)FGFR2 基因的八種常見(jiàn)基因型 C130T、T167C、T189C、T115C、G107A、C76T、 C101T和G81A的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表1FGFR2基因的ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有A.針對(duì)FGFR2基因的不同多態(tài)性位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異性ASPE引物， 每種ASPE弓丨物由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)目的基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別選自針對(duì)C130T的SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18、針對(duì) T167C 的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20、針對(duì) T189C 的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、針對(duì) T115C 的 SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、針對(duì) G107A 的 SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、 針對(duì)C76T 的 SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、針對(duì)ClOlT 的 SEQ ID NO.四和 SEQ ID NO. 30、 針對(duì)G81A的SEQ ID N0. 31和SEQ ID N0. 32中的一對(duì)以上；所述tag序列選自SEQ ID NO. 1 SEQ IDN0. 16中的序列；B.分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼微球，所述anti-tag序列選自SEQID N0. 33 SEQ ID N0. 48中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與A中所選 tag序列互補(bǔ)配對(duì)，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；C.用于擴(kuò)增相應(yīng)的具有C130T、T167C、T189C、T115C、G107A、C76T、C101T、G81A 中的一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物選自針對(duì) C130T 的 SEQ ID N0. 49 和 SEQ ID N0. 50、針對(duì) T167C 的 SEQ ID N0. 51 和 SEQ ID N0. 52、針對(duì) T189C 和 T115C 的 SEQ ID N0. 53 和 SEQ ID N0. 54、針對(duì) G107A 的 SEQ ID N0. 55 和 SEQID N0. 56、針對(duì) C76T 的 SEQID N0. 57 和 SEQ ID N0. 58、針對(duì) C101T 的 SEQ ID N0. 59 和 SEQ ID N0. 60、針對(duì) G81A 的 SEQ ID N0. 61 和 SEQ ID N0. 62 中的一對(duì)以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述特異性 ASPE引物分別選自針對(duì)C130T的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 17組成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 18組成的序列、針對(duì)T167C的由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 19組成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 20組成的序列、針對(duì)T189C的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 21組成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 22組成的序列、針對(duì)T115C的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 23組成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID NO. M組成的序列、針對(duì) G107A 的由 SEQ ID N0. 9 和 SEQ ID N0. 25 組成的序列及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 26 組成的序列、針對(duì)C76T的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 27組成的序列及由SEQ ID N0. 12 和SEQ ID N0. 28組成的序列、針對(duì)C101T的由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 29組成的序列及由 SEQ ID N0. 14 和 SEQ ID N0. 30 組成的序列、針對(duì) G81A 的由 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 31組成的序列及由SEQ ID N0. 16和SEQ ID N0. 32組成的序列中的一組以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，其特征是，A.所述特異性ASPE引物為針對(duì)C130T的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 17組成的序列及由SEQID N0. 2和SEQ ID N0. 18組成的序列、針對(duì)T167C的由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 19組成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 20組成的序列、針對(duì)T189C的由SEQ ID N0. 5和SEQ IDN0. 21組成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 22組成的序列、針對(duì) T115C 的由 SEQ ID N0. 7 和 SEQ ID N0. 23 組成的序列及由 SEQ ID N0. 8 和 SEQ ID N0. 24 組成的序列、針對(duì)G107A的由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 25組成的序列及由SEQ ID NO. 10 和SEQ ID N0. 26組成的序列、針對(duì)C76T的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 27組成的序列及由 SEQ ID N0. 12 和 SEQ ID N0. 28 組成的序列、針對(duì) C101T 的由 SEQ ID N0. 13 和 SEQ IDNO. 29組成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 30組成的序列、和針對(duì)G81A的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 31組成的序列及由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 32組成的序列；B.分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼微球，所述anti-tag序列選自SEQ IDN0. 33 SEQ ID NO. 48中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與A中所選 tag序列互補(bǔ)配對(duì)，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；C.所述擴(kuò)增引物為針對(duì)C130T的SEQID NO. 49和SEQ ID NO. 50、針對(duì)T167C的SEQ ID NO. 51 和 SEQ ID NO. 52、針對(duì) T189C 和 T115C 的 SEQ ID NO. 53 和 SEQ ID NO. 54、針對(duì) G107A 的 SEQID NO. 55 和 SEQ ID NO. 56、針對(duì) C76T 的 SEQ ID NO. 57 和 SEQ ID NO. 58、針對(duì) ClOlT 的 SEQID N0. 59 和 SEQ ID N0. 60、和針對(duì) G81A 的 SEQ ID N0. 61 和 SEQ ID N0. 62。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
6.一種用于FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)的特異性引物，其特征在于，其選自針對(duì)C130T的 SEQ ID N0. 17 和 SEQ ID N0. 18、針對(duì) T167C 的 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 20、針對(duì) T189C 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22、針對(duì) T115C 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24、針對(duì) G107A 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0.洸、針對(duì) C76T 的 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0.沘、針對(duì) C101T 的 SEQ ID N0. 29 和 SEQ ID N0. 30、針對(duì) G81A 的 SEQ ID N0. 31 和 SEQ ID N0. 32 中的一對(duì)以上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)特異性引物和液相芯片，該液相芯片包括有由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)目的基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列選自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.32；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.16中的序列；分別包被有特異的anti-tag序列的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明還公開(kāi)了FGFR2基因多態(tài)性的檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100％。所制備的FGFR2基因多態(tài)性檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102304568SQ20111011073
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者孫賢標(biāo), 羅彩英, 許嘉森, 郭婧 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司